王 穎，劉曉艷，閔 勇，周榮華，饒 犇

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064）

蛋白酶是一類水解蛋白質(zhì)肽鏈的酶，廣泛存在于微生物、動物內(nèi)臟和植物莖葉、果實中［1］。早在20世紀(jì)初，美國首次將木瓜蛋白酶用于啤酒的澄清處理，而在20世紀(jì)30年代第一次將微生物蛋白酶用于食品行業(yè)［2］，隨著科技水平的提高，越來越多的蛋白酶被發(fā)掘出來，并被廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)，如食品加工、皮革制造、洗滌劑以及分子生物研究等領(lǐng)域［3-5］。

蛋白酶K是蛋白酶的一種，屬于堿性絲氨酸蛋白酶類，來源于林伯氏白色念球菌（Tritirachium al?bumLimber）。首次由Hennrich等于1973年報道，因其能降解角蛋白，故命名為蛋白酶K；1974年Ebeling等［6］通過凝膠過濾大致確定其分子質(zhì)量為（18 500±500）Da，等電點（pi）為8.9，最適pH在7.5～12.0，是一種堿性蛋白酶。蛋白酶K的蛋白序列由Jany等［7］于1985年報道，晶體結(jié)構(gòu)由Pahler等于1984年初次報道，蛋白質(zhì)準(zhǔn)確大小由Gunkel等［8］于1989年報道，蛋白酶K的基因有2個外顯子編碼，含有一個63 bp長的內(nèi)含子；蛋白質(zhì)由15個氨基酸組成的信號肽、90個氨基酸組成的前導(dǎo)肽和279個氨基酸組成的成熟肽組成［7］。蛋白酶K具有2個Ca2+結(jié)合位點，若用乙二胺四乙酸螯合蛋白酶K中的Ca2+，處理3 h其活性降低50%，而加入Ca2+復(fù)性處理，其酶活只有初始酶活的28%；此外，其成熟體還含有典型的絲氨酸蛋白酶類催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)（Asp 39-His 69-Ser 224）和兩對二硫鍵［8］。有研究指出，蛋白酶K對尿素具有較強的耐受性，低濃度十二烷基硫酸鈉（SDS）對其活性影響較低，高濃度影響較大，PMSF對其活性具較強的抑制作用［7，8］。

目前對蛋白酶K的研究主要集中在提高蛋白酶K活性、產(chǎn)量，以及其在各行業(yè)中的應(yīng)用。本研究通過文獻(xiàn)調(diào)研與在線軟件TSpred預(yù)測對蛋白酶K活性具有潛在影響的3個氨基酸殘基位點，對這些位點進(jìn)行定點誘變，并將這些突變基因在畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115中進(jìn)行表達(dá)，對表達(dá)得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，篩選比酶活和熱穩(wěn)定性均得到提高的蛋白酶K突變體。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

Escherichia coliTop-10、載 體pPicZαA、酵 母GS115均為Invitrogen公司產(chǎn)品。大腸桿菌（Escherich?ia coli）使用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，畢赤酵母使用BMGY、BMMY培養(yǎng)基培養(yǎng)，具體配方見Invitrogen手冊。

1.2 蛋白酶K表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及突變體的構(gòu)建

從NCBI上面查詢到蛋白酶K序列PK（GenBank：P06873.2），在上海生工進(jìn)行了基因合成，利用2個酶切位點EcoRI和NotI將PK克隆至pPicZαA表達(dá)載體上，得到重組質(zhì)粒pPicZαA-PK。蛋白酶K突變體的構(gòu)建主要是根據(jù)具體的氨基酸突變位點，在引物上引入突變堿基，然后利用PCR的方法對基因進(jìn)行點突變，分別得到突變質(zhì)粒pPicZαA-PK108、pPicZαAPK199和pPicZαA-PK238。

1.3 蛋白酶K在畢赤酵母中的表達(dá)

在大腸桿菌中構(gòu)建好表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和測序鑒定，然后大量提取質(zhì)粒，利用PmeI進(jìn)行線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)，然后挑取重組子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，電轉(zhuǎn)換條件和搖瓶誘導(dǎo)條件均根據(jù)Invitrogen手冊實現(xiàn)。

1.4 蛋白酶K及其突變體蛋白活性定義及測定

在一定溫度和pH條件下，在1 min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量為1個酶活單位，以U表示。蛋白酶K在一定溫度和pH條件下，水解酪蛋白產(chǎn)生含有酚基的酪氨酸，在堿性條件下，可將Folin試劑還原，生成鉬藍(lán)和鎢藍(lán)，其顏色的深淺與酪氨酸的含量成正比。通過在680 nm處測定其吸光度，得到酶解產(chǎn)生酪氨酸的量，進(jìn)而計算蛋白酶K的活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶K表達(dá)質(zhì)粒p Pic ZαA-PK的構(gòu)建

以上海生工合成好的蛋白酶K基因為模版，用引物PKF和引物PKR進(jìn)行PCR擴增獲得蛋白酶K基因（圖1），然后用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI分別處理載體pPicZαA和PK片段，連接克隆后得到重組質(zhì)粒，命名為pPicZαA-PK。

圖1 PCR擴增蛋白酶K基因

2.2 蛋白酶K突變體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)蛋白酶K氨基酸序列，通過網(wǎng)站（http：//co?spi.iiserpune.ac.in/TSpred/）對其活性位點進(jìn)行了分析，選取了3個位點的氨基酸（108I、199L、238M）進(jìn)行飽和突變，其中突變位點氨基酸密碼子根據(jù)畢赤酵母蛋白表達(dá)密碼子偏愛性進(jìn)行了優(yōu)化。例如，將蛋白酶K基因第108位I突變成G，用引物PKF、PK108F、PK108R、PKR（表1）對蛋白酶K基因進(jìn)行搭橋PCR得到目的片段PK108，然后將該片段克隆至pPicZαA載體上，命名為pPicZαA-PK108，根據(jù)該方法，還構(gòu)建了pPicZαA-PK199和pPicZαA-PK238。

表1 用于構(gòu)建野生型及突變體的引物

2.3 蛋白酶K及其突變體重組子的轉(zhuǎn)化及篩選

將蛋白酶K及其突變體質(zhì)粒用SacI線性化，純化后電轉(zhuǎn)化Pichia pastorisGS115感受態(tài)細(xì)胞，涂布MD平板，然后酪素底物平板篩選，如圖2所示，選取水解圈大的菌株進(jìn)行下一步試驗。

圖2 酪素平板篩選蛋白酶K重組子

2.4 蛋白酶K的搖瓶表達(dá)

將篩選到的蛋白酶K重組菌株進(jìn)行搖瓶表達(dá)，先用200 mL BMGY培養(yǎng)基富集培養(yǎng)至OD600nm為8～12（40～48 h），離心（4 000 r/min，5 min）棄上清液，加入50 mL BMMY培養(yǎng)基重懸，加入1%體積甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)72 h，每12 h加1次甲醇。待誘導(dǎo)結(jié)束后，離心（6 000 r/min，5 min）收集培養(yǎng)基上清液，用0.22μm濾膜過濾4℃短期保存，并通過SDS-PAGE檢測蛋白酶K的表達(dá)情況（圖3），之后用BCA試劑盒對發(fā)酵液的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測定，結(jié)果顯示其濃度為1.5 mg/mL。

圖3 不同誘導(dǎo)時間蛋白酶K的表達(dá)量（SDS-PAGE檢測）

2.5 蛋白酶K及其突變體的性質(zhì)對比

比較了蛋白酶K野生型菌株和3個突變菌株在最適條件下（pH 5.0、40℃）的比酶活變化，結(jié)果（表2）表明，第108位氨基酸的突變可以顯著提高蛋白酶K的活性，其他2個位點的突變則起了負(fù)效應(yīng)；除此之外，還比較了幾個突變子在50℃的熱穩(wěn)定性，突變子pPicZαA-PK108顯示出了更高的熱穩(wěn)定性，該突變子比野生型表現(xiàn)了更好的應(yīng)用前景。

表2 野生型蛋白酶K及其突變體的酶活性比較

3 小結(jié)

林伯氏白色念球菌來源的蛋白酶K（EC3.4.21.64），自1973年首次被發(fā)現(xiàn)以來，有研究者對其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)進(jìn)行了研究報道［5］，并實現(xiàn)了蛋白酶K的異源表達(dá)（主要是大腸桿菌和畢赤酵母）。此外，研究者們還對如何提高蛋白酶K的表達(dá)量、比活性，以及在研究中的最適用量與處理時間（如在原位雜交中的最適用量與處理時間）等方面進(jìn)行了研究［6-8］，極大程度地促進(jìn)了蛋白酶K在工業(yè)與科研中的應(yīng)用。

本研究首先獲得了野生型的蛋白酶K表達(dá)菌株，然后通過軟件預(yù)測得到了對其熱穩(wěn)定性具有潛在影響的3個氨基酸殘基位點，對它們進(jìn)行了點突變，分別在畢赤酵母GS115中進(jìn)行了分泌表達(dá)，通過篩選獲得了一個熱穩(wěn)定性提高了30%，比活性提高約50%的蛋白酶K突變體pPicZαA-PK108。這對蛋白酶K在工業(yè)上的應(yīng)用起到了一定的促進(jìn)作用，如可以減少蛋白酶K在洗滌劑、食品加工中的用量，降低生產(chǎn)成本；此外，也可提高污水中病毒的滅活效率，減少環(huán)境污染。