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        利用Connectivity Map數(shù)據(jù)庫篩選抗菌藥物的初步研究

        2022-01-10 05:28:50劉曼莉張亞妮王開梅吳兆圓
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年24期
        關(guān)鍵詞:石蒜水蘇豬鏈球菌

        劉曼莉,舒 芬,張亞妮,方 偉,王開梅,吳兆圓

        (湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心,武漢 430064)

        細(xì)菌性傳染病是威脅人類和動(dòng)物健康的重要病原,自20世紀(jì)20年代抗生素的發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在,抗生素仍是解決細(xì)菌性傳染病的重要手段,然而耐藥性問題急需新型抗細(xì)菌感染的策略和藥物。

        Connectivity map(Cmap)是Lamb等[1]利用1千多個(gè)小分子藥物處理人類細(xì)胞后獲得的超過7 000個(gè)全基因組表達(dá)譜的數(shù)據(jù)庫。研究人員利用Cmap研究新化合物的活性、推論藥物的主結(jié)構(gòu)與藥理作用、找到疾病治療的新靶點(diǎn)。Gao等[2]發(fā)現(xiàn)celastrol和withaferin可作為化學(xué)伴侶和抗肥胖藥物;Dyle等[3]發(fā)現(xiàn)番茄堿可治療骨骼肌萎縮;Dudley等[4]發(fā)現(xiàn)托吡酯治療炎癥性腸病;Brum等[5]發(fā)現(xiàn)丁苯咪唑是治療骨關(guān)節(jié)炎的重要藥物等。Connectivity map是一個(gè)老藥新用、研究新化合物活性、篩選新靶點(diǎn)潛在的有廣泛應(yīng)用前景的工具。

        生物堿類化合物廣泛存在于動(dòng)植物中,是一類含氮雜環(huán)的有機(jī)物,具有堿性和顯著的生理活性,是重要的天然產(chǎn)物之一。目前已鑒定的生物堿有超過2萬個(gè),一些生物堿因其抗腫瘤、抗菌和抗病毒活性,及低毒性、低成本成為研究的熱點(diǎn)。

        本研究通過Cmap數(shù)據(jù)庫篩選潛在抗菌活性化合物的過程中,篩選到石蒜堿(Lycorine)、左旋水蘇堿(Betonicine)、玫瑰樹堿(Ellipticine)3個(gè)生物堿類化合物具有潛在抗菌活性,并對它們的抑菌活性及抗溶血活性進(jìn)行了研究。

        1 材料與方法

        1.1 菌種

        大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC 25922、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 27853、金黃色葡萄球菌(Staphylicoccus aureus)ATCC 25923由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保存,豬丹毒桿菌(Ery?sipelothrix rhusiopathiae)WH13013、豬鏈球菌(Strep?tococcussuis)SC19由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)譚臣教授課題組提供。

        1.2 試劑

        大腸桿菌使用LB培養(yǎng)基,由酵母粉、胰蛋白胨和氯化鈉按配方配制,固體培養(yǎng)基是在LB中加入瓊脂粉。酵母粉和胰蛋白胨購自O(shè)XOID公司,氯化鈉和瓊脂粉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、豬丹毒桿菌、豬鏈球菌使用含10%小牛血清的TSB和TSA培養(yǎng)基。TSB和TSA培養(yǎng)基購自BD Difco公司按配方配制,小牛血清購自杭州四季青生物有限公司。

        石蒜堿(B21169,≥98%)和頭孢匹羅(Cefpirome sulfate,S25863,98%)購自上海源葉生物科技有限公司。左旋水蘇堿(ZES-0605,N/A)購自法國EXTRA?SYNTHESE公司。玫瑰樹堿(T4614,98.85%)、青霉素(Ampicillin,T0814L,99.27%)和鏈霉素(Strepto?mycin sulfate,0060,720IU)購自上海陶素生化科技有限公司。石蒜堿、左旋水蘇堿和玫瑰樹堿均使用DMSO溶解,青霉素、鏈霉素和頭孢匹羅用無菌水溶解,化合物的儲存濃度均為10 mg/mL,試驗(yàn)時(shí)使用細(xì)菌培養(yǎng)基LB或TSB稀釋成相應(yīng)的使用濃度,同時(shí)設(shè)立DMSO和水的陰性對照孔。

        綿羊紅細(xì)胞購自廣州鴻泉生物科技有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 Connectivity map數(shù)據(jù)庫分析 將豬鏈球菌感染THP-1細(xì)胞中的差異表達(dá)基因(accession num?ber:GSE20508)分別以UP和DOWN文件輸入Con?nectivity map數(shù)據(jù)庫,除去不能識別的數(shù)據(jù),進(jìn)行分析,獲得6 100個(gè)化合物的Connectivity score,從Con?nectivity score為負(fù)的數(shù)據(jù)中進(jìn)行挑選。

        1.3.2 藥物最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(CLSI 2012)推薦的微量肉湯稀釋法進(jìn)行。將純化的細(xì)菌劃線接種于LB或TSA固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24 h,挑取單菌落接種于LB或TSB液體培養(yǎng)基中,于37℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h。將菌液按1∶1 000的比例接種于LB或TSB液體培養(yǎng)基,于37℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至OD600nm約為0.5(菌量約為1×108CFU/mL),再將菌懸液1∶100稀釋后備用。在96孔培養(yǎng)板中每孔加入50μL倍比稀釋不同濃度的藥物,加入50μL稀釋的菌液,每種藥物每株菌3次重復(fù),同時(shí)設(shè)陰性對照和陽性對照。對照藥物選擇青霉素、鏈霉素和頭孢匹羅。置于37℃溫箱中孵育16~20 h,讀取測定結(jié)果。

        肉眼觀察微量稀釋孔中以無細(xì)菌生長現(xiàn)象的最高藥物稀釋濃度為該藥物對該種細(xì)菌的藥物最小抑菌濃度。平行操作3次,以3次結(jié)果的平均值作為此藥對該細(xì)菌的MIC。

        1.3.3 藥物抗溶血試驗(yàn) 細(xì)菌于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(37℃搖床220 r/min),1∶500擴(kuò)大培養(yǎng)4 h至對數(shù)生長期,分裝成3 mL/細(xì)菌瓶,加入不同濃度的藥物,繼續(xù)培養(yǎng)5 h。取1 mL培養(yǎng)物離心(10 000 r/m,1 min)收集上清液,取150μL上清液于96孔板中,加入2%綿羊紅細(xì)胞150μL,同時(shí)分別做加入150μL的LB或TSB的陰性對照和加入150μL 1%Triton X-100的陽性對照,于37℃作用2 h,8 000 r/min離心10 min。將150μL上清液移到新的96孔板中,用分光光度計(jì)測定OD540nm。樣品的溶血百分比=[(樣品OD540nm-陰性對照OD540nm)/(陽性對照OD540nm-陰性對照OD540nm)]×100%。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 Connectivity map數(shù)據(jù)庫分析及抗菌化合物挑選

        將豬鏈球菌感染THP-1細(xì)胞結(jié)果中的差異表達(dá)基因按Connectivity map網(wǎng)站的要求,分別以UP和DOWN的文件輸入數(shù)據(jù),通過分析,獲得化合物的相關(guān)Connectivity值,共有1 685個(gè)化合物Connec?tivity值為負(fù)值。篩選出石蒜堿、左旋水蘇堿和玫瑰樹堿等3個(gè)具有潛在抗菌活性的生物堿類化合物,相關(guān)結(jié)果見表1。

        表1 3個(gè)化合物的Connectivity map分析結(jié)果

        2.2 抗菌活性研究

        將3個(gè)化合物與5株菌作用,研究化合物對G+和G-菌的抑菌情況,同時(shí)使用青霉素、鏈霉素和頭孢匹羅作為陽性對照。由表2可知,玫瑰樹堿對4種菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬丹毒桿菌和豬鏈球菌均有抑菌效果,且MIC與鏈霉素效果相當(dāng)或更優(yōu)。左旋水蘇堿和石蒜堿對5株菌均無明顯的抑菌效果。

        表2 化合物的MIC結(jié)果

        2.3 藥物抗細(xì)菌溶血活性

        為了研究菌株的溶血活性,將5株菌分別培養(yǎng)6、12、24 h,離心取上清液與紅細(xì)胞在37℃共培養(yǎng)2 h,由表3可知,金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌有較強(qiáng)的溶血活性。

        表3 5株菌的溶血活性

        將3個(gè)化合物與金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌共作用12 h,取上清液與紅細(xì)胞進(jìn)行溶血試驗(yàn)。由圖1可以看出,玫瑰樹堿對2株菌均有明顯的抑制溶血活性。石蒜堿和左旋水蘇堿在64μg/mL對2株菌無明顯抑制溶血活性。

        圖1 玫瑰樹堿抑制金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌的溶血活性

        3 討論

        本研究利用豬鏈球菌感染的THP-1芯片信息,通過Cmap數(shù)據(jù)庫分析,獲得化合物的相關(guān)信息,從中挑選了石蒜堿、左旋水蘇堿、玫瑰樹堿3個(gè)生物堿類化合物進(jìn)行抗菌活性研究。結(jié)果表明,石蒜堿和左旋水蘇堿對5株菌沒有明顯的抑菌活性。玫瑰樹堿對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬丹毒桿菌、豬鏈球菌均有明顯的抑菌作用,但對綠膿桿菌沒有明顯的抑菌作用。而且玫瑰樹堿能抑制金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌的溶血活性,說明玫瑰樹堿具有廣譜的抗菌、抗溶血活性。

        玫瑰樹堿是一種吲哚并異喹啉類生物堿,主要是從夾竹桃科玫瑰樹屬植物古城玫瑰樹(Ochrosia elliptica)的葉中分離出的天然生物堿[6,7],玫瑰樹堿及其類似物具有抗腫瘤、抗病毒[8-10]及抗菌活性。玫瑰樹堿對豬鏈球菌和大腸桿菌有較好的殺菌作用,并能很好地抑制豬鏈球菌的溶血活性,減輕豬鏈球菌導(dǎo)致的小鼠肺損傷[11,12]。有研究表明,玫瑰樹堿的衍生物對角叉菜膠致大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎具有保護(hù)作用[13],也可以削弱脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺炎[14]等。玫瑰樹堿的季銨鹽是D-丙氨酸-D-丙氨酸連接酶抑制劑,是細(xì)菌細(xì)胞壁合成必需的胞內(nèi)酶[15]。玫瑰樹堿的作用機(jī)制主要包括DNA嵌入、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ、大分子共價(jià)烷基化和誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力等[16-20]。

        生物堿是一類含氮雜環(huán)的有機(jī)物,已知的生物堿有上萬種,主要存在于植物中。生物堿類化合物有較強(qiáng)的生理活性,是中草藥中重要的有效成分之一。石蒜堿屬生物堿,具有抗菌、抗病毒、抗瘧疾、抗腫瘤等多方面的作用[21-26]。研究發(fā)現(xiàn)石蒜堿抗腫瘤機(jī)制可能是通過干擾DNA的模板功能,影響DNA轉(zhuǎn)錄過程,從而抑制RNA的合成[27,28]。而且石蒜堿能抑制P38和STATs的激活并降低LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及小鼠死亡率[29]。左旋水蘇堿是益母草的主要活性成分之一,能拮抗LPS所致的病理損傷[30]。左旋水蘇堿的研究并不多,但有研究發(fā)現(xiàn)左旋水蘇堿能參與抑制細(xì)菌根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tume?faciens)的群體效應(yīng)[31,32]。

        本研究中Cmap的篩選結(jié)果里包含了玫瑰樹堿、石蒜堿和左旋水蘇堿。玫瑰樹堿有較好的抗菌和抑制溶血的活性,但石蒜堿和左旋水蘇堿的直接殺菌和抑制溶血作用不明顯。因此,Cmap在藥物篩選過程中有重要的應(yīng)用價(jià)值,但仍需要通過試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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