吳兆圓，任夢(mèng)瑤，張志剛，劉 芳，張亞妮，方 偉

（1.湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064；2.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，武漢 430081）

利用微生物及其代謝產(chǎn)物來(lái)開(kāi)發(fā)新型除草劑是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一，而從罹病的雜草植株上分離強(qiáng)致病性的病原菌則是發(fā)掘微生物（源）除草劑的主要手段［1］。其中利用最多的是植物病原真菌，有超過(guò)40個(gè)屬的真菌已經(jīng)或者正在被考慮開(kāi)發(fā)成生物除草劑［2］。馬唐（Digitaria sanguinalis）是禾本科單子葉植物，是一種秋熟作物農(nóng)田中的雜草，在熱帶和溫帶地區(qū)的36個(gè)國(guó)家均有分布，對(duì)30多種農(nóng)作物的生產(chǎn)有嚴(yán)重危害［3］。國(guó)外有報(bào)道利用彎孢屬病原真菌Curvularia intermedia［4］及馬唐黑粉菌（Ustilago synthersmae）［5］作為馬唐生防菌劑。在國(guó)內(nèi)，海南大學(xué)利用新月彎孢菌（Curvularia lunata）［6］，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)利用畫(huà)眉彎孢菌（Curvularia eragrostidis）［7］，浙江師范大學(xué)利用從馬唐罹病葉片上分離得到的炭疽菌Colletotrichum hanaui［8］進(jìn)行 了對(duì) 馬 唐的 防 治研究，均取得一定效果。盡管已報(bào)道的對(duì)馬唐有致病性的菌株有很多，但是真正商品化的防除馬唐的微生物制劑種類(lèi)相對(duì)較少。因此，繼續(xù)篩選馬唐生防菌株能夠?yàn)檠邪l(fā)新型、高效的生物除草劑提供微生物品種資源，具有重要的科學(xué)意義和廣泛的應(yīng)用前景。湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心課題組從罹病的馬唐植株上分離得到1株病原真菌NBERC_H56，經(jīng)鑒定為鏈格孢屬真菌Alternaria perpunctulata，并發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液對(duì)馬唐幼苗的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，盆栽噴霧14 d試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)馬唐鮮重的抑制率為75.6%。為明確菌株NBERC_H56的除草活性物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)菌株進(jìn)行了大量發(fā)酵、提取以及分離純化，并經(jīng)LC-MS和NMR鑒定，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器和主要試劑

Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振儀（TMS為內(nèi)標(biāo)，δ為mg/L，J為Hz）（德國(guó)Bruker BioSpin公司）；Bruker APEX DUO單晶衍射儀（銅靶衍射）（德國(guó)Bruker BioSpin公司）；Waters 2695液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）；Waters 2767高效液相制備儀（Waters 2525泵，帶2767自動(dòng)收集系統(tǒng)，2996二級(jí)管陣列檢測(cè)器，色譜工作站Masslynx V4.0）；美國(guó)Sunfire C18 OBD制備柱（5μm，19 mm×250 mm/10 mm×250 mm，愛(ài)爾蘭）；100～200目柱色譜填料柱層析硅膠（青島海洋化工廠）。分離提取試劑乙酸乙酯為中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，HPLC制備用乙腈為湖北弗頓科學(xué)技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 馬唐致病真菌的分離

菌株分離自湖北省武漢市郊區(qū)烏龍泉馬唐罹病植株（2020年6月采樣），現(xiàn)菌種保存在湖北生物農(nóng)藥工程研究中心，編號(hào)NBERC_H56。

將馬唐罹病植株用乙醇浸泡15 s，無(wú)菌水漂洗3次，用滅菌濾紙吸干殘留水分后剪碎，置于研缽中搗碎，隨后加入5 mL無(wú)菌水，取0.1 mL混合液于裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中涂勻，28℃恒溫保濕培養(yǎng)，每天觀察菌種生長(zhǎng)情況，待菌體長(zhǎng)出后，挑選菌株邊緣菌絲進(jìn)行培養(yǎng)，如此反復(fù)至得到純凈的菌體。

1.3 菌株的培養(yǎng)及活性測(cè)試

NBERC_H56發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖6.25 g/L，麥芽提取物6.25 g/L，酵母提取物1.0 g/L，蛋白胨0.625 g/L，磷酸二氫鉀1.25 g/L，硫酸鎂0.625 g/L，pH調(diào)至7.0。

將NBERC_H56菌株接種于已滅菌的裝有100 mL上述培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，加入0.3%瓊脂，于28℃靜置培養(yǎng)7 d。

選取營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)相同、4葉期馬唐，取適量菌株發(fā)酵液采用噴霧法對(duì)馬唐幼苗進(jìn)行噴灑（90 mL/m2），以含0.1%吐溫-80的無(wú)菌水作為空白對(duì)照，每次試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，28℃，光照強(qiáng)度8 000 lx。14 d后對(duì)株高、根長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量，對(duì)鮮重進(jìn)行稱(chēng)量，計(jì)算抑制率。抑制率=［（對(duì)照平均株高或根長(zhǎng)或鮮重-處理平均株高或根長(zhǎng)或鮮重）/對(duì)照平均株高或根長(zhǎng)或鮮重］×100%。

1.4 菌株的大量發(fā)酵、提取及次生代謝產(chǎn)物分離純化

按照上述培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件發(fā)酵100瓶（10 L），發(fā)酵完成后合并發(fā)酵液，加入10 L的乙酸乙酯攪拌提取3次，提取液過(guò)濾后真空濃縮得到提取物1.45 g。提取物用少量甲醇溶解，經(jīng)硅膠柱色譜進(jìn)行柱層析，用石油醚/乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，洗脫組分通過(guò)HPLC檢測(cè)合并為6段（Fr.1至Fr.6）。主要組分Fr.4（1.06 g）經(jīng)制備色譜柱（Sunfire C18 OBD制備柱，5μm，19 mm×250 mm，24 mL/min）進(jìn)行分離，洗脫梯度為5%～100%乙腈，洗脫40 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株NBERC_H56的除草活性

如表1、圖1所示，菌株NBERC_H56發(fā)酵液（簡(jiǎn)稱(chēng)H56發(fā)酵液）盆栽噴霧14 d對(duì)馬唐幼苗的株高、根長(zhǎng)及鮮重有明顯的抑制作用，抑制率分別為55.6%、45.1%和75.6%。

表1 菌株NBERC_H56發(fā)酵液對(duì)馬唐的株高、根長(zhǎng)以及鮮重的抑制率

圖1 菌株NBERC_H56發(fā)酵液對(duì)馬唐的生長(zhǎng)抑制作用

2.2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

洗脫組分通過(guò)HPLC檢測(cè)、分離、純化，得到化合物1（7.89 mg）、化合物2（8.86 mg）和化合物3（6.50 mg），其結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 菌株NBERC_H56產(chǎn)生的化合物結(jié)構(gòu)

化合物1：淡黃色粉末，分子式為C12H14O5，分子量 為238.2；1H NMR（C2D6SO，500 MHz）δ：6.31（1H，d，J=2.1 Hz，H-6′），6.15（1H，d，J=2.1 Hz，H-4′），4.04（2H，dd，J=14.2，7.1 Hz，H2-1″），3.47（2H，s，H2-2），2.40（3H，s，H3-8′），1.18（3H，t，J=7.1 Hz，H3-2″）；13C NMR（C2D6SO，125 MHz）δ：202.6（s，C-7′），171.4（s，C-1），160.2（s，C-3′），158.8（s，C-5′），136.2（s，C-1′），120.1（s，C-2′），111.1（d，C-6′），102.1（d，C-4′），60.4（t，C-1″），39.53（t，C-2），32.6（q，C-8′），14.6（q，C-2″）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道的Curvulin的核磁數(shù)據(jù)基本一致，確定該化合物為Curvulin。

化合物2：黃色油狀物，分子式為C14H10O5，分子量為258.3；1H NMR（C2D6SO，500 MHz）δ：7.24（1H，d，J=1.8 Hz，H-6），6.72（1H，d，J=2.4 Hz，H-5′），6.64（1H，d，J=2.4 Hz，H-3′），6.36（1H，d，J=1.8 Hz，H-4），2.71（3H，s，H3-7′）；13C NMR（C2D6SO，125 MHz）δ：166.4（s，C-4），165.2（s，C-7），165.2（s，C-5），164.6（s，C-3），159.0（s，C-4′），153.1（s，C-2′），138.8（s，C-6′），138.6（s，C-1），118.0（s，C-5′），109.5（s，C-1′），105.0（d，C-6），102.1（d，C-3′），101.5（d，C-4），97.6（s，C-2），25.7（q，C-7′）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報(bào)道的Alternariol的核磁數(shù)據(jù)基本一致，確定該化合物為Alternariol。

化合物3：淡黃色粉末，分子式為C15H22O4，分子量 為266.3；1H NMR（C2D6SO，500 MHz）δ：6.91（1H，s，H-6），5.45（1H，t，J=6.7 Hz，H-2′），4.57（2H，d，J=3.4 Hz，H2-7），4.54（2H，d，J=6.7 Hz，H2-1′），4.49（2H，s，H2-8），3.65（3H，s H3-9），2.05（3H，s，H3-10），1.76（3H，s，H3-4′），1.72（3H，s，H3-5′）；13C NMR（C2D6SO，125 MHz）δ：158.2（s，C-3），157.5（s，C-7），165.2（s，C-5），141.9（s，C-1），137.3（s，C-3′），120.7（s，C-2），120.3（s，C-4），117.0（d，C-3′），106.8（d，C-6），65.1（t，C-1′），63.6（t，C-7），61.9（q，C-9），60.6（t，C-8），26.0（q，C-4′），18.5（q，C-5′），9.6（q，C-10）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的Zinniol的核磁數(shù)據(jù)基本一致，確定該化合物為Zinniol。

3 討論

通過(guò)篩選，本課題組從罹病的馬唐植株上分離得到1株鏈格孢屬雜草病原真菌Alternaria perpunct?ulataNBERC_H56，活性測(cè)試結(jié)果表明其發(fā)酵液對(duì)馬唐幼苗的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，并且從菌株NBERC_H56的次級(jí)代謝產(chǎn)物中得到化合物Curvu?lin（1）、Alternariol（2）和Zinniol（3）。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Curvulin（1）主要由內(nèi)臍蠕孢屬（Drechslera）和彎孢屬病原真菌產(chǎn)生［9］，對(duì)馬齒莧（Portulaca oleracea）和刺莧（Amaranthus spino）具有植物毒性［12］，而Alter?nariol（2）和Zinniol（3）均為鏈格孢屬真菌產(chǎn)生的植物毒素［11，13］，由此可初步推斷化合物1、化合物2和化合物3均為菌株NBERC_H56產(chǎn)生除草活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本次試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)鏈格孢菌Alternaria perpunct?ulata對(duì)馬唐具有生長(zhǎng)抑制作用，并且首次對(duì)該菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，分離得到3個(gè)具有除草活性的化合物，初步闡明了活性物質(zhì)基礎(chǔ)，下一步可對(duì)菌株NBERC_H56的除草活性進(jìn)行深入研究，為真菌源除草劑的發(fā)現(xiàn)提供良好的研究基礎(chǔ)。