孟雪蓮，劉曉娜，張 欣，陳長蘭

(遼寧大學 藥學院，遼寧 沈陽 110036)

0 引言

蓮子心是《中國藥典》收錄的草藥，藥用來源為睡蓮科植物蓮(NelumbonuciferaGaertn)的成熟種子中間的綠色胚芽[1]，從蓮子心中分離的活性成分有類黃酮、萜類、類固醇、糖苷和生物堿等，尤其是芐基異喹啉生物堿(BIA)是蓮子心生物堿的主要生物活性成分.現(xiàn)代藥理學對蓮子心的研究主要集中在其抗癌、降壓、抗心律失常、抗氧化、抗自由基、抗纖維化、抗糖尿病、神經(jīng)保護、抗炎等方面[2-6].

阿爾茨海默病(AD)是一種不可逆的進行性神經(jīng)退行性疾病.AD是全世界癡呆的最常見原因，并且其發(fā)病率隨著人口老齡化而增加.AD的主要病理學特征是Aβ斑塊的細胞外聚集和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(Neurofibrillary Tangles)的細胞內(nèi)聚集，導致神經(jīng)元功能障礙[7-10].目前尚無治愈阿爾茨海默病的方法.

基于系統(tǒng)生物學理論的網(wǎng)絡藥理學是一門新興學科，旨在分析生物網(wǎng)絡并篩選出特別感興趣的節(jié)點，以設計多靶點藥物分子[11].中醫(yī)的整體理念與新興的網(wǎng)絡藥理學和網(wǎng)絡生物學的關鍵思想有很多共同點，網(wǎng)絡藥理學是最近已應用于防治諸如癌癥、AD等復雜疾病的中醫(yī)藥研究[12].為了預測中藥化合物的靶標特征和藥理作用，揭示藥物-基因-疾病共模塊關聯(lián)，以高通量方式從中草藥配方中篩選出協(xié)同多化合物，并解釋草藥配方的組合規(guī)則和網(wǎng)絡調(diào)節(jié)效果，當前的研究模式發(fā)生了改變，從“一種靶標，一種藥物”模式更新為“網(wǎng)絡靶標，多組分”模式，建立了一種新穎的中藥網(wǎng)絡藥理方法[13-14].這些研究表明，中醫(yī)網(wǎng)絡藥理學方法為中醫(yī)從經(jīng)驗醫(yī)學到循證醫(yī)學系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化提供了新的研究范式，這將加速中醫(yī)藥物的發(fā)現(xiàn)，并改善當前的藥物發(fā)現(xiàn)策略[15].因此本研究通過網(wǎng)絡藥理學來研究蓮子心化學成分防治阿爾茨海默病的作用機制，初步探究其抗阿爾茨海默病的藥效物質(zhì)及其潛在的作用靶點和作用通路，為之后的實驗驗證提供理論依據(jù).

1 實驗用數(shù)據(jù)庫及軟件

本研究所用的數(shù)據(jù)庫及軟件見表1.

表1 實驗用數(shù)據(jù)庫及軟件

2 實驗方法

2.1 數(shù)據(jù)庫構建

2.1.1 構建蓮子心化學成分相關靶點數(shù)據(jù)庫

以“LIAN ZI XIN”“NelumbonuciferaGaertn”為關鍵詞，在TCMSP[16]、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫[17]中檢索蓮子心的化學成分.以生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18為篩選條件，以便篩選出口服利用度高的化學成分作為研究對象[18].利用PubChem數(shù)據(jù)庫得到化學成分的Canonical Smile號，將Canonical Smile號導入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫[19]中，選擇人類(Homo sapiens)作為研究物種，預測得到相關的潛在作用靶點，合并多個化學成分的搜索結(jié)果，去除重復項，得到蓮子心化學成分相關靶點數(shù)據(jù)庫.

2.1.2 構建阿爾茨海默病相關靶點數(shù)據(jù)庫

以阿爾茨海默病常用的英文表達方式“Alzheimer′s disease”為關鍵詞在Gene Cards 數(shù)據(jù)庫中搜索，查找與阿爾茨海默病相關的基因，得到阿爾茨海默病的8 718個相關潛在基因靶點.

2.1.3 構建“藥物成分-疾病”交集靶點數(shù)據(jù)庫

分別將2.1.1構建得到的蓮子心生物堿化學成分相關靶點數(shù)據(jù)庫與2.1.2構建得到的阿爾茨海默病相關靶點數(shù)據(jù)庫導入到Venny2.1.0軟件中，取兩者交集，得到“藥物成分-疾病”交集靶點數(shù)據(jù)庫.

2.2 構建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡

將2.1.3構建得到的交集靶點導入String 數(shù)據(jù)庫，選取人類(Homo sapiens)為研究物種，設置置信度為0.95，以確保數(shù)據(jù)的可靠性，保存結(jié)果.將結(jié)果中的node 1、node 2以及結(jié)合分數(shù)(Combined score)等信息導入到Cytoscape 3.7.2軟件中構建蛋白相互作用網(wǎng)絡.

2.3 京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

打開DAVID數(shù)據(jù)庫，選擇6.7版本，將2.1.3得到的交集靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫中，選擇Identifier為Office gene symbol，選擇List Type為Gene list，選取人類(Homo sapiens)為研究物種，選擇Pathways下的KEGG_PATHWAY進行KEGG分析，設置閾值P<0.05，篩選排名靠前的通路，利用Omishare Tools 對結(jié)果進行可視化處理.

2.4 構建“藥物成分-交集靶點-作用通路”網(wǎng)絡

在KEGG分析中，篩選具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)的通路，得到關鍵核心靶標參與的關鍵通路，將上述蓮子心的化學成分、“藥物成分-疾病”交集靶點、通路分析、阿爾茨海默病在Excel中分別建立成分-靶點、靶點-通路、通路-疾病之間的對應關系，導入到Cytoscape 3.7.2中，構建“藥物成分-交集靶點-作用通路”網(wǎng)絡圖.

3 實驗結(jié)果

3.1 構建“藥物成分-疾病”交集靶點數(shù)據(jù)庫

3.1.1 構建蓮子心化學成分相關靶點數(shù)據(jù)庫

將篩選后得到的蓮子心中13種化學成分(圖1)的Canonical Smile號導入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中，選擇人類(Homo sapiens)作為研究物種，預測得到相關的潛在作用靶點.將13種化學成分的相關潛在作用靶點合并，去重復后最終得到95個蓮子心化學成分相關潛在作用靶點.對“13種活性化合物-化合物靶標”網(wǎng)絡的總體特征進行分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)13種活性成分既存在一個化合物與多個靶蛋白結(jié)合的作用，也存在多個化合物與同一個靶蛋白相互作用的現(xiàn)象，表明蓮子心抗阿爾茨海默病作用存在多活性成分、多靶標的作用特點.

圖1 蓮子心中篩選出的13種化學成分

圖2 “13種活性化合物-化合物靶標”網(wǎng)絡

3.1.2 構建阿爾茨海默病相關靶點數(shù)據(jù)庫

以阿爾茨海默病常用的英文表達方式“Alzheimer′s disease”為關鍵詞在Gene Cards 數(shù)據(jù)庫中搜索，查找與阿爾茨海默病相關的基因，得到阿爾茨海默病的8 718個相關潛在基因靶點(圖3).

3.1.3 構建“藥物成分-疾病”交集靶點數(shù)據(jù)庫

分別將3.1.1構建得到的蓮子心生物堿化學成分相關靶點數(shù)據(jù)庫與3.1.2構建得到的阿爾茨海默病相關靶點數(shù)據(jù)庫導入到Venny2.1.0軟件中，取兩者交集，得到“藥物成分-疾病”交集靶點數(shù)據(jù)庫(圖3).分析發(fā)現(xiàn)，13種藥物成分相關靶點(95個靶點)與阿爾茨海默病相關靶點(8 718個靶點)之間有73個交集靶點.

圖3 13種藥物成分相關靶點與阿爾茨海默病疾病相關靶點的交集靶點數(shù)

3.2 構建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡

將73個“藥物成分-疾病”交集靶點輸入到String數(shù)據(jù)庫中，選取物種為人類(Homo sapiens)，篩選置信區(qū)間大于0.95的靶點，得到23個“藥物成分-疾病”交集靶點之間的蛋白相互作用信息.將String數(shù)據(jù)庫導出的靶點蛋白相互作用關系數(shù)據(jù)(node1、node2、combined score)導入到Cytoscape 3.7.2軟件中構建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡圖(圖4)，同時利用Cytoscape3.7.2軟件的內(nèi)置插件Network Analyzer plugin進行網(wǎng)絡拓撲參數(shù)分析計算.結(jié)果表明，GRM2(代謝性谷氨酸受體2)、HDAC1(組蛋白去乙酰酶1)、CHRNB4(神經(jīng)乙酰膽堿受體β4)、CHRNB2(神經(jīng)乙酰膽堿受體β2)為度值排名前4的靶點蛋白，為4個關鍵靶點.

……圖4 “藥物成分-疾病”交集靶點蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡圖

3.3 京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

將73個“藥物成分-疾病”交集靶點輸入到DAVID數(shù)據(jù)庫中進行KEGG通路富集分析.通過KEGG分析富集到蓮子心13種化學成分與50個關鍵核心靶標相關，這50個靶點相關的基因通路共20條，其中，具有顯著意義的(P<0.01)有11條通路(表2).將KEGG信號通路按P值進行排序，繪制氣泡圖(圖5).由表2和圖5可見，蓮子心中13種關鍵化學成分抗阿爾茨海默病的潛在作用途徑主要包括神經(jīng)活動配體-受體相互作用通路、5-羥色胺能突觸信號通路、鈣離子信號通路等.其中“神經(jīng)活動配體-受體相互作用通路”涉及的化合物作用靶標最多(30個)，該通路可能為蓮子心活性成分抗阿爾茨海默病作用的關鍵通路.

表2 蓮子心化學成分防治阿爾茨海默病作用靶點的KEGG通路分析

圖5 蓮子心化學成分防治阿爾茨海默病作用靶點的KEGG富集氣泡圖

3.4 構建“藥物成分-交集靶點-作用通路”網(wǎng)絡

在KEGG分析中，共得到20條通路，選取其中具有統(tǒng)計學意義的(P<0.01)通路，最終得到13個活性化合物與50個關鍵核心靶標相關，參與的關鍵通路11條.

利用Cytoscape 3.7.2軟件構建了“藥物成分-交集靶點-作用通路”網(wǎng)絡模型圖(圖6)并用Cytoscape 3.7.2軟件中的內(nèi)置插件Network Analyzer進行分析(表3).該網(wǎng)絡中有75個節(jié)點(包括1個藥材、13個化學成分、50個交集靶點、11條通路和1個疾病)和282條邊.圖中八邊形代表阿爾茨海默病疾病，三角形代表作用通路，橢圓形代表“藥物成分-疾病”交集靶點，四邊形代表蓮子心中的化學成分，度值(Degree)越大表明與之相連的節(jié)點數(shù)越多，在整個網(wǎng)絡中調(diào)控作用越大.結(jié)果表明，度值較大的化學成分有C9(甲基蓮心堿，17)、C6(蓮心堿，17)、C5(異蓮心堿，16)等.度值較大的靶點蛋白有DRD1(多巴胺受體D1)、DRD2(多巴胺受體D2)、DRD5(多巴胺受體D5)等，可能是蓮子心干預阿爾茨海默病的作用靶點.這些靶點涉及的通路有Neuroactive ligand-receptor interaction(神經(jīng)活動配體-受體相互作用通路)、Calcium signaling pathway(鈣離子信號通路)、Dopaminergic synapse(多巴胺神經(jīng)突觸通路)、Alcoholism(酒精依賴代謝通路)、cAMP signaling pathway(cAMP信號通路)等.所有的信號通路中神經(jīng)活動配體-受體相互作用通路涉及的靶標最多，該通路與50個關鍵核心靶標中的30個靶標相關.通過分析網(wǎng)絡發(fā)現(xiàn)CHRNA1(神經(jīng)乙酰膽堿受體α1)、CHRNA2(神經(jīng)乙酰膽堿受體α2)、CHRNA3(神經(jīng)乙酰膽堿受體α3)、CHRNB4(神經(jīng)乙酰膽堿受體β4)、CHRNA7(神經(jīng)乙酰膽堿受體α7)僅與蓮子心中的雙芐基異喹啉類生物堿如C5、C6、C9相互作用.而靶點DRD1、DRD2可以與蓮子心中的大多數(shù)化學成分相互作用.

圖6 “藥物成分-交集靶點-作用通路”網(wǎng)絡模型圖

表3(續(xù)表)

4 分析與討論

中醫(yī)是中華文化中最偉大的寶藏之一，在東亞和東南亞有著悠久的歷史，自古以來就被廣泛使用.傳統(tǒng)上，大多數(shù)新藥的發(fā)現(xiàn)都集中在識別或設計與單個靶標特異性相互作用的藥物上，但是，作用于單個分子靶標的藥物通常在治療某些疾病(例如糖尿病，炎癥和癌癥)時效果不令人滿意[20].鑒于藥物研發(fā)的瓶頸，藥物研究與開發(fā)已逐漸從“單一目標，單一藥物”模式轉(zhuǎn)變?yōu)椤熬W(wǎng)絡目標，多成分治療”模式[21-22].網(wǎng)絡藥理學方法已用于研究“蛋白/基因-疾病”途徑，該途徑能夠從網(wǎng)絡角度描述生物系統(tǒng)、藥物和疾病之間的復雜性，并具有與中醫(yī)相似的整體哲學觀念[12，23].中醫(yī)網(wǎng)絡藥理學開創(chuàng)了一種新的研究范式，旨在將中醫(yī)藥從基于經(jīng)驗的醫(yī)學轉(zhuǎn)變?yōu)榛谧C據(jù)的醫(yī)學.

本研究利用網(wǎng)絡藥理學對蓮子心的化學成分干預阿爾茨海默病的作用機制進行研討，以期發(fā)現(xiàn)蓮子心中的活性成分及其潛在的抗阿爾茨海默病作用靶點及作用通路.采用網(wǎng)絡藥理學的方法，篩選得到蓮子心的13種主要活性成分，并預測得到上述藥物化學成分的潛在作用靶點95個；在這95個潛在作用靶點中，與阿爾茨海默病相關的交集靶點有73個，即“藥物成分-疾病”交集靶點；進一步的分析表明，蓮子心這13個活性化合物與50個阿爾茨海默病關鍵核心靶標相關，并參與關鍵信號通路11條.分析發(fā)現(xiàn)，蓮子心的13種主要活性成分最有可能通過 Neuroactive ligand-receptor interaction(神經(jīng)活動配體-受體相互作用通路)發(fā)揮抗阿爾茨海默病作用.該通路是質(zhì)膜上所有與細胞內(nèi)外信號通路相關的受體配體的集合[24]，涉及神經(jīng)元乙酰膽堿受體(CHRNA1、CHRNA2、CHRNA3、CHRNA7)、腎上腺素能受體(ADRA1D、ADRA1A)、血清素受體(HTR2A、HTRlB)、多巴胺受體(DRD5、DRD1)等多種配體-受體信號轉(zhuǎn)導途徑，與生理節(jié)律、內(nèi)分泌、心血管控制、情緒、學習和記憶等功能有關，研究表明，CHRNA7其異常程度與認知功能相關[25]；DRD5屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，可能參與獎賞和強化機制、認知和情感以及運動的調(diào)節(jié)；HTRlB基因敲除，小鼠沖動、過激行為增加[26]，這與阿爾茨海默病的發(fā)生、發(fā)展密切相關.除了該通路以外，蓮子心的13種主要藥效成分還可以通過5-羥色胺能突觸信號通路、鈣離子信號通路、多巴胺能突觸信號通路等發(fā)揮藥效作用.從構建的“藥物成分-交集靶點-作用通路”網(wǎng)絡的總體特征分析，發(fā)現(xiàn)蓮子心化學成分抗阿爾茨海默病作用存在多活性成分、多靶標以及通過不同的作用通路發(fā)揮作用的特點.

通過構建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)了GRM2、HDAC1、CHRNB4、CHRNB2為13種蓮子心藥效成分抗阿爾茨海默病作用關鍵靶點蛋白.CHRNB4、CHRNB2是乙酰膽堿受體，廣泛表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng).病理學上，阿爾茨海默病相關腦區(qū)煙堿乙酰膽堿受體的減少和膽堿能神經(jīng)元的丟失是阿爾茨海默病的主要神經(jīng)化學特征之一，乙酰膽堿介導的神經(jīng)傳遞是神經(jīng)系統(tǒng)功能的重要組成部分.在阿爾茨海默病晚期，膽堿能神經(jīng)元丟失，從而逐漸導致阿爾茨海默病的記憶喪失和認知功能下降[27].乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEIs)是一種基于膽堿能假說的治療藥物，可以防止乙酰膽堿酯酶的降解，恢復突觸乙酰膽堿酯酶的活性，改善癥狀.GRM2(代謝型谷氨酸受體2，mGluR2)是一種G-蛋白偶聯(lián)受體，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)第二信使的產(chǎn)生而導致代謝改變.谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，mGluR2通過控制釋放興奮性氨基酸谷氨酸來調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中快速的突觸傳遞[28].谷氨酸能突觸傳遞改變是阿爾茨海默病發(fā)生的關鍵.組蛋白去乙酰酶(HDACs)是一種去除組蛋白和非組蛋白賴氨酸殘基乙?；拿?HDACs可調(diào)節(jié)許多細胞過程，包括轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)重塑和DNA修復.有研究表明，HDAC1是腦內(nèi)的一種OGG1(8-羥基鳥嘌呤糖苷酶)去乙?；福赡芡ㄟ^促進AP部位切割來刺激OGG1活動.研究發(fā)現(xiàn)，HDAC1和OGG1與大腦衰老和神經(jīng)退行性疾病中的氧化DNA損傷、神經(jīng)元基因表達、突觸可塑性和認知功能有關，并強調(diào)了藥理HDAC1激活在衰老和神經(jīng)疾病中的治療潛力[29].

從構建的“藥物成分-交集靶點-作用通路”網(wǎng)絡模型分析發(fā)現(xiàn)幾種乙酰膽堿受體靶點(CHRNA1、CHRNA2、CHRNA3、CHRNB4、CHRNA7)僅可與蓮子心的雙芐基異喹啉類生物堿(異蓮心堿、蓮心堿、甲基蓮心堿)相互作用，而多巴胺受體靶點(DRD1、DRD2)可以與蓮子心的大多數(shù)化學成分相互作用.這表明，蓮子心不同結(jié)構類型化學成分的作用機制可能存在明顯差異，可為進一步研究化合物構效關系、藥效物質(zhì)基礎及作用機制提供思路.