楚宗麗，張睿男,2，李亮杰，孫君艷，王付娟，周 強(qiáng)，仝勝利

(1. 信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院，河南信陽(yáng) 464006； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇南京 210095)

小麥(TriticumaestivumL.)是我國(guó)重要的糧食作物之一，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥品種的選育對(duì)保證國(guó)家糧食安全和社會(huì)穩(wěn)定具有重要意義。生物技術(shù)為作物新品種培育提供了有效途徑，但小麥組培效率較低，制約著生物技術(shù)在小麥育種中的應(yīng)用。胚性愈傷組織容易再生獲得植株，是提高小麥組培效率的關(guān)鍵。胚性愈傷組織的形成是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程。植物胚性愈傷組織的形成受AGAMOUS-LIKE15(AGL15)[1-2]、 BABY BOOM[3-4]、LEC[5-6]等轉(zhuǎn)錄因子的影響，同時(shí)，逆境脅迫因子對(duì)植物胚性愈傷組織的形成也有影響[7-8]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物的多種生理代謝過(guò)程，是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，其N端含有高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域約由60個(gè)氨基酸殘基組成，包含高度保守的WRKYGQK序列，同時(shí)C末端含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，鋅指結(jié)構(gòu)有C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H(C2H2)和C-X7-C-X23-H-X1-C(C2HC)兩種類型[9]。根據(jù)所含WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和鋅指結(jié)構(gòu)類型，WRKY轉(zhuǎn)錄因子一般分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3組，其中，第Ⅰ組含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2鋅指結(jié)構(gòu)；第Ⅱ組含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2鋅指結(jié)構(gòu)；第Ⅲ組含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2HC鋅指結(jié)構(gòu)[10]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與(T)(T)TGAC(C/T)序列(W-box)特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)啟動(dòng)子中含有該元件相關(guān)基因的表達(dá)。目前，在擬南芥[11]、水稻[12]、棉花[13]、豆類[14-15]、葡萄[16]、菠蘿[17]、月季[18]、茶樹[19]等多種植物中已經(jīng)鑒定出WRKY轉(zhuǎn)錄因子。在小麥中，Niu等[20]利用小麥EST數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定到43個(gè)TaWRKY基因，Okay等[21]和Gupta等[22]用逆境脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也分別鑒定到160和107個(gè)TaWRKY基因。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物的防御調(diào)控過(guò)程，包括響應(yīng)多種生物和非生物脅迫[9,12,20-24]，如月季W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子基因RcWRKY41在月季抗灰霉病中發(fā)揮作用[18]，棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因GhWRKY39-1在轉(zhuǎn)基因煙草中可提高對(duì)病原體的防御能力，并且可調(diào)節(jié)鹽脅迫耐受性[25]。小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY01和TaWRKY33可增強(qiáng)擬南芥抗旱和耐熱的能力[21]。同時(shí)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物的衰老、萌發(fā)和休眠以及胚的形成等過(guò)程[26-28]。

然而，目前在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及其在小麥胚性愈傷組織形成中的功能還未見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析了小麥胚性愈傷組織形成的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因在胚性愈傷組織形成中上調(diào)表達(dá)[29]，但僅在所測(cè)序轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)范圍內(nèi)進(jìn)行了分析。小麥基因組序列的公布，為小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員的分析提供了基礎(chǔ)。本研究以小麥基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行了小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子的鑒定、分類、系統(tǒng)進(jìn)化樹繪制、motif保守元件分析和基因結(jié)構(gòu)分析，并對(duì)WRKY轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因在小麥胚不同發(fā)育時(shí)期的胚性和非胚性愈傷組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子在小麥胚性愈傷組織形成中的作用，以期為研究小麥胚性愈傷組織形成的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 注釋基因組序列的獲取

從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(kù)(http://plants.ensembl.org/)中獲取小麥基因組數(shù)據(jù)。同時(shí)，從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中下載水稻和擬南芥WRKY蛋白序列，用于多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹的繪制。

1.2 小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子的鑒定

從Pfam網(wǎng)站((http://pfam.xfam.org/family/PF03106)下載WRKY結(jié)構(gòu)域的隱馬爾科夫模型文件，Pfam編號(hào)為PF03106。使用Hummer Search 3.0軟件，在小麥基因組序列中通過(guò)隱馬爾科夫模型比對(duì)，搜索小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子，使用Perl程序，篩選Hummer搜索結(jié)果，篩選條件為E-value<1e-3[18]。為了確保已知基因組信息中所有小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子不被遺漏，從NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取擬南芥WRKY蛋白序列，通過(guò)Blast比對(duì)，搜索小麥注釋基因組序列中小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子。去除上述兩種操作結(jié)果中的重復(fù)序列，對(duì)余下的序列用SMART數(shù)據(jù)庫(kù)(http:// smart.embl.de/)和Pfam-CDD工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，去除不含WRKY結(jié)構(gòu)域的序列，保留確定的小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子序列。利用Perl程序?qū)aWRKY蛋白的分子量、等電點(diǎn)進(jìn)行分析。使用MEGA 7.0軟件，參照擬南芥WRKY蛋白分類方法[24]對(duì)鑒定出的TaWRKY蛋白進(jìn)行分類。

1.3 小麥WRKY家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的繪制

從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)中分別挑選21個(gè)具有代表性的擬南芥和粳稻W(wǎng)RKY蛋白序列，利用MEGA 7.0軟件，與TaWRKY蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。算法為鄰接法(neighbor-joining，NJ)，模型為泊松模型，校驗(yàn)參數(shù)bootstrap為1 000[24]。

1.4 小麥WRKY蛋白保守基序與基因結(jié)構(gòu)分析

在Bio-Linux環(huán)境下，使用MEME 4.12.0軟件預(yù)測(cè)分析TaWRKY蛋白保守基序。具體參數(shù)為：搜索motif的總個(gè)數(shù)為10，motif長(zhǎng)度范圍為6～50。使用Perl程序獲取TaWRKY基因在染色體上的外顯子、CDS、UTR位置，使用在線工具GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對(duì)TaWRKY基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并繪制基因結(jié)構(gòu)圖。

1.5 小麥胚性愈傷組織中TaWRKY家族基因的差異表達(dá)分析

以小麥品種周麥18為材料，在其幼胚和成熟胚培養(yǎng)中，對(duì)來(lái)源于幼胚的胚性愈傷組織(培養(yǎng)3、6和15 d，分別用IME3、IME6和IME15表示)和成熟胚的非胚性愈傷組織(培養(yǎng)3、6和15d，分別用ME3、ME6和ME15表示)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(ID：PRJNA353135，登錄號(hào)：SRP093588)[29]進(jìn)行分析，獲得TaWRKY基因，并對(duì)不同轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中的TaWRKY基因進(jìn)行差異表達(dá)分析。

1.6 差異表達(dá)基因?qū)崟r(shí)定量PCR驗(yàn)證

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)在Bio-Rad CFX96TM實(shí)時(shí)定量系統(tǒng)上進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物(cDNA溶液)2.0 μL、正、反向引物各1.0 μL(引物序列詳見(jiàn)表1)、2× SYBR Premix Ex TaqTMII 12.5 μL、RNase游離水8.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。以Actin基因(GenBank: AB181991)為內(nèi)參，所有反應(yīng)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和溶解曲線分析驗(yàn)證每對(duì)引物的特異性。以ME3文庫(kù)中的基因CT值作為參照，其表達(dá)水平設(shè)為1.0，使用2-△△Ct方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[30]，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

表1 qRT-PCR所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及分類

用Hmmer Search 3.0和NCBI Blast鑒定，分別獲得312和69個(gè)候選小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子，刪除兩者的重復(fù)部分，余下序列通過(guò)SMART數(shù)據(jù)庫(kù)和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證，去除保守結(jié)構(gòu)域或鋅指結(jié)構(gòu)域不完整的序列，最后確定270個(gè)小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子(TaWRKY01～TaWRKY270)。根據(jù)WRKY保守結(jié)構(gòu)域數(shù)目和鋅指結(jié)構(gòu)域類型，將這些WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3組，其中，第Ⅰ組WRKY轉(zhuǎn)錄因子(TaWRKY01～TaWRKY41)均含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，第Ⅱ組WRKY轉(zhuǎn)錄因子(TaWRKY42～TaWRKY186)均含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，第Ⅲ組WRKY轉(zhuǎn)錄因子(TaWRKY187～TaWRKY270)均含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2HC鋅指結(jié)構(gòu)域，數(shù)量分別是41、145和84個(gè)。蛋白理化特性分析結(jié)果表明，TaWRKY蛋白氨基酸序列長(zhǎng)度為135～1 482 aa，等電點(diǎn)為4.59～10.86，分子量為14 796.1～165 344.2。

2.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)中分別選擇21個(gè)具有代表性的完整的擬南芥和粳稻W(wǎng)RKY蛋白序列，與鑒定出的TaWRKY蛋白序列一起，利用MEGA 7.0進(jìn)行多序列比對(duì)分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖1所示。在I、II、III 3個(gè)分組中，TaWRKY蛋白主要分布在第II組中，根據(jù)基因結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化樹關(guān)系，可進(jìn)一步分為3個(gè)亞組：II-a、II-b和 II-c(圖1)，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，每個(gè)分組聚類為一個(gè)分支，組II中II-a、II-b和II-c分別聚類為一個(gè)分支，總計(jì)5個(gè)分支。

黑色、紫色和紅色分別表示小麥、水稻和擬南芥中的WRKY成員。

2.3 TaWRKY蛋白保守基序分析

在Bio-Linux環(huán)境下，用MEME 4.12.0軟件對(duì)TaWRKY蛋白序列進(jìn)行保守基序掃描，共搜索到10個(gè)保守基序，命名為motif 1～motif 10(圖2A)，其中motif 1～ motif 5和motif 8均含有WRKY轉(zhuǎn)錄因子的WRKYGQK序列(如圖2B)，TaWRKY蛋白一般含有2～4個(gè)保守基序(除TaWRKY194、TaWRKY241、TaWRKY203和TaWRKY216僅含1個(gè)基序)(圖2A)，基序分布特征相似的TaWRKY在系統(tǒng)發(fā)育樹中關(guān)系較近。

圖2 TaWRKY蛋白的基序分析

A：TaWRKY蛋白的基序分布; B：TaWRKY蛋白的基序序列。氨基酸字母的高度代表在該位點(diǎn)相應(yīng)氨基酸的相對(duì)頻率。

2.4 TaWRKY基因的結(jié)構(gòu)分析

在Bio-Linux環(huán)境下，通過(guò)Perl程序進(jìn)行分析，用CSDS 2.0軟件繪制基因結(jié)構(gòu)圖，結(jié)果(圖3)表明，大部分TaWRKY基因包含1～5個(gè)內(nèi)含子(除TaWRKY13包含8個(gè)內(nèi)含子)。在同一進(jìn)化分支的TaWRKY基因表現(xiàn)出類似的基因結(jié)構(gòu)，如TaWRKY167和TaWRKY168。但也有一些例外，如TaWRKY39和TaWRKY40雖然聚類為同一分支，但TaWRKY40僅有1個(gè)內(nèi)含子，而TaWRKY39含有3個(gè)內(nèi)含子。

圖3 部分TaWRKY的基因結(jié)構(gòu)

2.5 TaWRKY基因在小麥胚性愈傷組織形成過(guò)程中的表達(dá)模式

用周麥18幼胚培養(yǎng)3、5和15 d獲得的胚性愈傷組織(IME3、IME6、IME15)和成熟胚培養(yǎng)3、5和15 d獲得的非胚性愈傷組織(ME3、ME6、ME15)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)，對(duì)不同文庫(kù)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，共鑒定獲得39個(gè)TaWRKY基因(表2)，其中27個(gè)在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到且在愈傷組織中表達(dá)，12個(gè)在小麥基因組數(shù)據(jù)中沒(méi)有鑒定到，僅在小麥愈傷組織發(fā)育中特異表達(dá)(配對(duì)比例為0)。TaWRKY基因在不同轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中的差異表達(dá)分析表明，共有11個(gè)TaWRKY基因差異表達(dá)，其中包含5個(gè)(TaWRKY275、TaWRKY276、TaWRKY277、TaWRKY280和TaWRKY281)特異表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)表3。隨機(jī)選擇8個(gè)差異表達(dá)的TaWRKY基因(含3個(gè)特異表達(dá))進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致(表4)。

表2 小麥胚性愈傷組織形成中鑒定到的TaWRKY基因

表3 小麥胚性愈傷組織形成中差異表達(dá)的TaWRKY基因

表4 隨機(jī)選取的8個(gè)TaWRKY差異表達(dá)基因在小麥愈傷組織中的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中廣泛存在，家族成員較多，參與調(diào)控植物的多種生物學(xué)功能。隨著植物基因組測(cè)序的逐漸完成，多種植物在全基因組范圍內(nèi)已經(jīng)進(jìn)行了WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定[13-19]，而小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究多以轉(zhuǎn)錄組或EST序列為基礎(chǔ)[20-22]，小麥基因組信息的公布為在全基因范圍內(nèi)進(jìn)行小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究提供了條件。本研究利用小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)結(jié)合小麥胚性愈傷組織形成中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共鑒定獲得270個(gè)小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域特征可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三組[10]，分別含有41、145和84個(gè)小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子，均多于擬南芥、水稻、棉花等植物中鑒定到的WRKY轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量[11-12,31-32]，可能這與小麥?zhǔn)橇扼w及其具有龐大的基因組有關(guān)。

在研究方法上，本研究用Hummer搜索和NCBI Blast兩種方法相結(jié)合來(lái)鑒定小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子，可能也是鑒定到小麥WRKY數(shù)量較多的原因之一。

在小麥胚性愈傷組織發(fā)育過(guò)程中，共鑒定到39個(gè)TaWRKY基因，其中12個(gè)在小麥愈傷組織發(fā)育過(guò)程中特異表達(dá)。在小麥胚性愈傷組織中鑒定到的小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量(39)遠(yuǎn)小于小麥全基因組條件下鑒定到的小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量(270)，這可能與該數(shù)據(jù)是來(lái)源于特定發(fā)育時(shí)期的材料以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的程度有關(guān)。

WRKY結(jié)構(gòu)域中存在高度保守的WRKYGQK序列，但也存在變異，如在水稻中，WRKYGEK和WRKYGKK是WRKY轉(zhuǎn)錄因子中WRKY結(jié)構(gòu)域兩個(gè)常見(jiàn)的變異[31,33]。本研究在小麥中也發(fā)現(xiàn)了WRKYGEK和WRKYGKK兩種變異，其中有13個(gè)小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子存在WRKYGEK變異(均位于第III組)，有15個(gè)存在WRKYGKK變異(有3個(gè)位于第I組，該組中有兩個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，一個(gè)變異，另一個(gè)不變異；有12個(gè)位于第II組)。

小麥胚性愈傷組織的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，本研究發(fā)現(xiàn)，在小麥胚性愈傷組織不同發(fā)育時(shí)期，有11個(gè)TaWRKY基因差異表達(dá)，其中5個(gè)特異表達(dá)，說(shuō)明小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子與胚胎愈傷組織的形成相關(guān)，小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)何種途徑對(duì)植物胚胎愈傷組織的形成進(jìn)行調(diào)控還需進(jìn)一步研究。