劉東海，喬 艷，李雙來，張 智，李 菲，徐 為，胡 誠

（1.湖北省農業(yè)科學院植保土肥研究所，武漢 430064；2.湖北美天生物科技股份有限公司，湖北 武穴 435400）

武穴市是全國最大的佛手山藥生產基地［1］，播種面積2 000 hm2。佛手山藥因其品種獨特，品質優(yōu)良，風味獨特，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，2012 年被湖北省農業(yè)廳授予“首屆湖北名優(yōu)蔬菜”［2］。長期連續(xù)種植山藥會導致土壤中微生物組成和數量發(fā)生變化［3，4］，破壞土壤耕層微生物種群結構［5］，并抑制土壤酶活性，加重根結線蟲的危害［6］，甚至誘發(fā)嚴重的土傳病害［7］，從而影響山藥生長發(fā)育和產量［8］。宋佳承［9］指出馬鈴薯-玉米輪作明顯提高了馬鈴薯根際土壤中細菌和真菌多樣性，改變了細菌和真菌的群落結構，對調控馬鈴薯連作障礙效果較好。蘇燕等［10］指出水旱輪作模式可提高馬鈴薯根際土壤的細菌群落多樣性，重點預防馬鈴薯發(fā)生細菌性病害。范琳娟等［11］增加山藥種植間隔期，可改變土壤線蟲群落結構，大幅降低植物寄生線蟲豐度，增加土壤生態(tài)系統(tǒng)健康程度。

研究者采用微生物培養(yǎng)技術開展了山藥連作對土壤主要微生物類群的影響，僅限于對土壤中極少數部分（0.1%～1.0%）可培養(yǎng)的微生物類群的研究。高通量測序技術可全面、準確獲得微生物群落結構信息的特點，在細菌和真菌方面應用較多，但是線蟲研究停留在傳統(tǒng)的形態(tài)學方法。本研究采用高通量測序（細菌16S rDNA、真菌18S rDNA 和線蟲NF1-F/18Sr2b-R）技術對經過3 年連作和水稻山藥輪作的山藥土壤中的細菌、真菌和線蟲多樣性展開研究，結合土壤理化性質以及產量數據，分析不同種植模式下土壤微生物的變化情況，為減輕山藥連作障礙，采用更好的輪作模式提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗地點位于湖北省武穴市余川鎮(zhèn)大祝村，土壤類型為沙質壤土，品種均為本地佛手山藥品種，試驗地設置為2 個處理。處理1的種植模式是3 年水稻山藥輪作（SY），處理2 是3 年山藥連作（LZ）。土壤耕層（0～30 cm）進行多點取樣，每個處理按“S”形選取5 個樣點，土樣充分混合均勻，裝入已消毒的自封袋中，放入冰盒中帶回。每個混合土樣分為兩部分，一部分用于化學指標測試，另一部分放置于-80 ℃冰箱保存，用于DNA 提取和高通量測序。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 土壤理化性狀測定 堿解氮用堿解擴散法，速效磷用紫外可見分光光度法，速效鉀用火焰光度法，有機質用重鉻酸鉀法，土壤pH 采用1.0∶2.5的水土比、復合電極測定；植株樣品測定全氮、全磷、全鉀含量。樣品用H2SO4-H2O2消煮，全氮用凱氏定氮法，全磷用鉬銻抗比色法，全鉀用火焰光度法進行測定。粗蛋白質的測定采用凱式定氮法，將所測得值乘以系數6.25 即為其粗蛋白質含量。以上測定方法均參考文獻［12］。

1.2.2 細菌和真菌擴增測序 采用EZNA Soil NDA Kit（Omega Bio-tek 公司）提取土壤總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。對16S rDNA 基因的V3-V4 高變區(qū)片段進行PCR 擴增，引物序 列為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。對18S rDNA 基因的V3-V4 高變區(qū)片段進行PCR 擴增引物序列為SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和81196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）。擴增條件為95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。每個樣本3 個重復，將同一樣本的PCR 產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN Biosciences 公司）切膠回收PCR 產物，Tris_HCl 洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結果，將PCR 產物用QuantiFluor-ST 藍色熒光定量系統(tǒng)（Promega 公司）進行檢測定量，按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina Miseq PE300、PE 250平臺分別進行細菌和真菌的測序。

1.2.3 線蟲群落的擴增測序

1）使用引物NF1-F/18Sr2b-R［13］對線蟲18S rDNA V4區(qū)進行擴增。PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL 反應體系：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，Forward Primer（5 μmol/L）0.8 μL，Reverse Primer（5 μmol/L）0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA 10 ng，滅菌PCR 水補足至20 μL。

2）線蟲（NF1FF/18Sr2bR）PCR 擴增條件為95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 次循；72 ℃延伸10 min。擴增之后，PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠電泳，使用AxyPrep DNA 凝膠提取試劑盒進行純化，并使用QuantiFluor-ST（Promega 公司）對回收產物進行檢測定量。根據Illumina MiSeq 平臺（Illumina 公司）標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建PE 300 文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300 平臺進行雙端測序。

1.3 數據統(tǒng)計及分析

生物信息分析使用Trimmomatic 軟件對原始測序序列進行質控，使用FLASH 軟件進行拼接。使用UPARSE 軟件，根據97%的相似度對序列進行OTU聚類。數據整理采用Microsoft Excel 2007。

2 結果與分析

2.1 土壤基礎化學性質和產量

與輪作比較，連作導致佛手山藥的產量降低了41.88%；連作對山藥塊莖的粗蛋白、全氮、全磷和全鉀養(yǎng)分含量影響不顯著（表1）。

表1 山藥塊莖氮磷鉀含量及產量

與輪作比較，連作導致土壤中堿解氮、有效磷、速效鉀和全氮分別提高了36.06%、10.41%、80.41%和12.77%。但是土壤中全磷、全鉀和pH 變化不顯著（表2）。

表2 土壤養(yǎng)分和pH 情況

2.2 土壤細菌、真菌和線蟲群落結構特征

2.2.1 土壤微生物α 多樣性 與輪作比較，連作導致土壤中細菌、真菌和線蟲的序列數分別降低了6.96%、12.78%和36.74%。連作導致土壤細菌、真菌和和線蟲豐富度指數（ChaoI）分別降低了18.64%、6.26%和16.22%，多樣性指數（ShannonI）則分別降低了13.46%、10.38%和10.55%。連作降低了土壤微生物群落的多樣性（表3）。

表3 土壤細菌、真菌和線蟲多樣性

2.2.2 土壤細菌群落組成綠彎菌門、放線菌門、變形菌門、厚壁菌門和酸桿菌門是土壤優(yōu)勢菌群（相對豐度＞5%），共占到群落組成的86.08%～92.63%。輪作處理中細菌豐度排序是放線菌門（26.37%）＞變形菌門（20.20%）＞綠彎菌門（18.34%）＞厚壁菌門（13.01%）＞酸桿菌門（8.16%）＞芽單胞菌門＞擬桿菌門＞腐霉菌門。連作處理中細菌豐度排序是綠彎菌門（35.41%）＞放線菌門（25.48%）＞變形菌門（10.64%）＞厚壁菌門（10.44%）＞酸桿菌門（10.26%）＞芽單胞菌門＞腐霉菌門＞擬桿菌門。與輪作比較，連作導致綠彎菌門和酸桿菌門分別提高了93.08%和25.74%，但變形菌門、厚壁菌門、芽單胞菌門和擬桿菌分別降低了47.33%、19.75%、41.35% 和67.19%（圖1A）。

細菌屬水平上，連作處理綠彎菌門中的norank_f__JG30-KF-AS9 屬占比最高（25.88%）。與輪作比較，連作顯著提高了綠彎菌門中norank_f__JG30-KF-AS9（3.13 倍）的豐度。連作導致變形菌門中的Chujaibacter 和鞘脂單胞菌屬、放線菌門中的節(jié)桿菌屬和地桿菌屬、厚壁菌門的芽孢桿菌屬和子囊菌門中的假絲酵母菌屬，分別降低了63.47%、65.86%、73.42%、70.57%、29.69% 和23.25%。輪作處理中other（＜0.01的細菌種群），所占的比例54.39%，而連作導致other（＜0.01的細菌種群）降低了32.08%，說明連作減少了細菌中稀有物種的多樣性（圖1B）。

圖1 細菌群落組成

2.2.3 土壤真菌群落組成 從門水平看出，不同處理下真菌群落的優(yōu)勢種群依次都是子囊菌門、擔子菌門和毛霉菌門，三者占群落豐度的95%以上，在土壤真菌群落結構中占主導地位。與輪作比較，連作導致子囊菌門降低了6.89%，擔子菌門和毛霉菌門分別提高了40.15%和100.28%（圖2A）。

從屬水平上看出，輪作處理中子囊菌門Plectosphaerella 豐度最高（34.63%），而連作處理中子囊菌門unclassified_o_Eurotiales 豐度最高（46.45%）。鐮孢屬Fusarium 在輪作和連作豐度分別是12.39%和11.76%，差異不大。與輪作比較，連作中unclassified_o__Eurotiales、Heterocephalacria 和纓霉屬Thysanophora 分別顯著提高了368.89%、269.16%和93.69%，然而Plectosphaerella 和孢霉屬Arthrinium 分別降低了95.16%和64.60%（圖2B）。

圖2 真菌群落組成

2.2.4 土壤線蟲群落組成 輪作和連作處理中線蟲門水平的豐度分別是0.05%和1.88%。綱水平下，線蟲色矛綱豐度分別是0.05%和1.33%。與輪作比較，連作土壤中線蟲類群的豐度顯著提高（圖3）。

圖3 線蟲群落組成

3 小結與討論

3.1 小結

連作降低了佛手山藥的產量（41.88%）和土壤微生物群落多樣性，富集了土壤速效養(yǎng)分。在山藥連作和輪作下，土壤細菌、真菌群落和線蟲群落組成結構出現較大差異。連作顯著提高綠彎菌門豐度，使其成為主要的優(yōu)勢類群，同時降低了變形菌門、厚壁菌門、芽單胞菌門和擬桿菌門豐度。連作和輪作處理中真菌優(yōu)勢種群都是子囊菌門和擔子菌門。連作降低了子囊菌門豐度，提高了擔子菌門和毛霉菌門豐度。連作土壤中線蟲類群的豐度顯著提高。

3.2 討論

3.2.1 理化性質和產量 山藥連作導致土壤速效養(yǎng)分的富集尤其是有效磷和速效鉀，其中有效磷含量超過閾值106.2 mg/kg［14］，速效鉀最高達到644.48 mg/kg，極大地增加了養(yǎng)分淋失的風險，這與農戶習慣施肥有關。有研究指出有機肥、無機肥與微生物肥料的質量比例為250～300∶10∶1，有利于山藥的生長，改善山藥品質［15］。輪作顯著提高了山藥的產量，與宋佳承［9］指出輪作提高馬鈴薯產量的結論一致。

3.2.2 微生物多樣性 輪作提高了土壤細菌和真菌多樣性，與馬鈴薯-玉米輪作明顯提高了馬鈴薯根際土壤中細菌和真菌多樣性的結論一致［9］。連作降低土壤線蟲多樣性指數，與棉花連作10～15 年會發(fā)生土壤養(yǎng)分失衡，土壤線蟲多樣性降低的結論一致［16］。輪作的微生物多樣性高于連作，可能是水旱輪作模式下，土壤環(huán)境厭氧及好氧條件交替，土壤中的碳、氮循環(huán)加速所導致［17，18］。

3.2.3 微生物群落組成 佛手山藥土壤綠彎菌門、放線菌門、變形菌門、厚壁菌門和酸桿菌門是優(yōu)勢菌群，與淮山藥根際土壤細菌在門水平上的主要優(yōu)勢菌群類似［19］。連作顯著提高了綠彎菌門豐度，卻降低了變形菌門的豐度；綠彎菌門可降解土壤纖維素等物質，參與土壤碳循環(huán)［20］。變形菌參與了必需礦物質營養(yǎng)的生物循環(huán)［21］，高比例的變形菌可能有助于改善土壤肥力，有助于植物生長［22］。連作改變細菌群落結構，進而可能間接影響土壤肥力。連作導致細菌屬水平下豐度＜0.01的種群降低了32.08%，說明連作降低了細菌中稀有物種的多樣性。

輪作和連作處理真菌群落的優(yōu)勢種群依次是子囊菌門、擔子菌門和毛霉菌門，在土壤真菌群落結構中占主導地位。屬水平上看出，輪作處理中Plectosphaerella 豐度最高（34.63%）；Plectosphaerella 種類存在不同的棲息地，地理分布廣泛［23，24］，大多數物種是病原體，在生產中可造成巨大損失［25］。連作處理中unclassified_o_Eurotiales 豐度最高（46.45%），Eurotiales 跟蘋果病害有關［26］。

土壤線蟲是一種豐富而普遍存在的生物，在營養(yǎng)循環(huán)、分解、害蟲和病原體種群調節(jié)等過程中發(fā)揮著重要作用［27，28］。耕作和施肥等土壤管理能夠影響線蟲群落多樣性［29］。本研究表明，輪作提升了土壤線蟲群落的多樣性，降低了線蟲的物種豐度。