胡文靜，高德榮，江 偉，廖 森，馬紅勃，張曉祥

(1.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江中下游小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225007；2.揚(yáng)州大學(xué)/江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009； 3.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州434023；4.江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)科所，江蘇徐州221131 )

小麥赤霉病(Fusarium head blight，F(xiàn)HB)是由禾谷鐮孢菌(FusariumgraminearumSchw.)等多種鐮刀菌引起的世界性病害，常發(fā)生在溫暖濕潤(rùn)地區(qū)。小麥開花期遇到連續(xù)陰雨且氣溫在15℃以上時(shí)，赤霉菌侵染小麥穗部并迅速擴(kuò)展，在籽粒灌漿成熟過程中不斷繁殖，并產(chǎn)生和累積多種毒素，導(dǎo)致小麥產(chǎn)量受損、品質(zhì)降低，甚至造成食品安全問題，危害人畜健康[1]。因此，選育和推廣抗赤霉病小麥品種是解決赤霉病危害最安全、經(jīng)濟(jì)和有效的途徑[2]。長(zhǎng)江中下游麥區(qū)是我國(guó)小麥赤霉病的重發(fā)區(qū)，選育抗赤霉病的小麥品種一直是該麥區(qū)重要育種目標(biāo)，自上世紀(jì)80年代以來，該麥區(qū)育種家相繼選育出一批赤霉病抗性較好的小麥品種，如揚(yáng)麥4號(hào)、揚(yáng)麥5號(hào)、揚(yáng)麥158、蘇麥3號(hào)等，此外，一些農(nóng)家品種，如望水白、黃方柱、白三月黃等，也都呈現(xiàn)出穩(wěn)定的赤霉病抗性，這些品種已被國(guó)內(nèi)外小麥育種單位作為赤霉病抗源使用[2-4]。由于黃淮麥區(qū)歷史上缺少赤霉病的誘發(fā)環(huán)境，育種家對(duì)抗病品種的關(guān)注較晚，造成一旦氣候變化和耕作制度改變，該麥區(qū)的赤霉病危害迅速蔓延和加重[5-6]。因此，發(fā)掘和利用小麥抗赤霉病種質(zhì)資源，培育赤霉病抗性達(dá)到中感及以上水平的小麥品種已經(jīng)成為黃淮麥區(qū)的主要育種目標(biāo)之一[7]。

培育抗赤霉病小麥品種離不開抗赤霉病基因的利用。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)小麥抗赤霉病基因的研究進(jìn)展迅速，為小麥赤霉病抗性遺傳改良奠定了理論基礎(chǔ)。目前共定位到250余個(gè)赤霉病抗性基因/QTL，分布在小麥21條染色體上[1]，但明確的抗赤霉病基因只有7個(gè)，即Fhb1～Fhb7，其中Fhb1、Fhb2、Fhb3、Fhb6和Fhb7是赤霉病抗擴(kuò)展類型，F(xiàn)hb4和Fhb5是赤霉病抗侵染類型，F(xiàn)hb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5來源于普通小麥，F(xiàn)hb3、Fhb6和Fhb7來源于外緣種質(zhì)[8-12]。目前已知效應(yīng)值較大的抗赤霉病QTL有QFhs.crc-2DL、Fhb7AC和QFhb.cau-7DL[13-15]。蘇麥3號(hào)等長(zhǎng)江中下游麥區(qū)的抗赤霉病品種雖然赤霉病抗性穩(wěn)定，但這些品種與我國(guó)黃淮麥區(qū)的小麥品種遺傳背景差異太大，在株型、生育期等方面具有顯著差異，利用它們改良該麥區(qū)品種的赤霉病抗性需要的育種周期很長(zhǎng)，甚至最終會(huì)因?yàn)榭剐曰騺G失導(dǎo)致抗赤霉病育種失敗。迄今在黃淮麥區(qū)罕見選育出赤霉病抗性較好的品種[16]，因此從該區(qū)域內(nèi)篩選優(yōu)良赤霉病抗源用于小麥遺傳改良顯得尤為重要。前人在黃淮麥區(qū)已開展了一些篩選抗赤霉病小麥品種(系)的研究[17]，如張 煜等[6]采用土表接種結(jié)合單花滴注的方法對(duì)黃淮南部762個(gè)小麥品種(系)的赤霉病抗性進(jìn)行鑒定，僅篩選出10個(gè)穩(wěn)定的中抗赤霉病小麥品種(系)。張 彬等[18]對(duì)黃淮南片65個(gè)主栽小麥品種進(jìn)行了赤霉病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)黃淮南片主栽小麥品種的赤霉病抗性普遍較差。本研究以71個(gè)黃淮麥區(qū)小麥品種(系)為材料，連續(xù)兩年采用單花滴注接種的方法，對(duì)供試品種(系)進(jìn)行赤霉病抗性鑒定，并利用與Fhb1[19-20]、Fhb2、Fhb4、Fhb5基因[6]和QFhs.crc-2DL位點(diǎn)[13]緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)供試材料進(jìn)行檢測(cè)及分析，以期為該麥區(qū)小麥抗赤霉病育種提供遺傳資源與信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

71份供試品種(系)分別來自江蘇、安徽、河南、山東、陜西、河北和北京，分別以蘇麥3號(hào)、鄭麥9023、淮麥22和濟(jì)麥22為赤霉病抗病(Resistant，簡(jiǎn)稱R級(jí))、中抗(Moderately resistant，簡(jiǎn)稱MR級(jí))、中感(Moderately susceptible，簡(jiǎn)稱MS級(jí))和感病(Susceptible，簡(jiǎn)稱S級(jí))對(duì)照品種。

禾谷鐮孢菌菌株(F0301、F0609、F0980和F1312)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所陳懷谷研究員惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2016―2017和2017―2018年度2個(gè)小麥生長(zhǎng)季在江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所揚(yáng)州灣頭試驗(yàn)基地赤霉病鑒定圃內(nèi)進(jìn)行。播種日期均為每年的10月25日。每品種種植2行，行長(zhǎng)1.5 m，行距25 cm，每行均勻播種30粒種子，2次重復(fù)。土質(zhì)為沙壤土，前茬為水稻，肥力中等，田間管理如施肥、除草、灌溉和蟲害防治同常規(guī)育種田。

1.3 赤霉病抗性鑒定與評(píng)價(jià)

參照Yu等[21]的方法制備赤霉菌孢子懸浮液(1×105～ 5×105個(gè)·mL-1)。

接種方法：采用單花滴注法接種，于小麥開花初期，用注射器吸取10 μL孢子液注入麥穗自頂部小穗開始自上而下第6個(gè)小穗的任意一個(gè)小花中，每個(gè)品種接種20個(gè)穗子，2次重復(fù)。接種后采用人工彌霧保濕(每半小時(shí)彌霧5 min)21 d。

抗性評(píng)價(jià)方法：接種21 d后調(diào)查接種穗的病小穗數(shù)，計(jì)算病小穗率。病小穗率=發(fā)病小穗數(shù)/總小穗數(shù)×100%。病情嚴(yán)重度調(diào)查和記載標(biāo)準(zhǔn)按照《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) NY/T 2954-2016：小麥區(qū)域試驗(yàn)品種抗赤霉病鑒定技術(shù)規(guī)程》[22]和張曉軍等[23]的方法進(jìn)行，嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：接種小穗無可見發(fā)病癥狀，0級(jí)；僅接種小穗發(fā)病，或相鄰的個(gè)別小穗發(fā)病，但病斑不擴(kuò)展到穗軸，1級(jí)；穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗占總小穗數(shù)的1/4以下，2級(jí)；穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗占總小穗數(shù)的 1/4～1/2，3級(jí)；穗軸發(fā)病，發(fā)病小穗占總小穗數(shù)的1/2以上，4級(jí)。每年調(diào)查2次各病穗的病情嚴(yán)重度，再根據(jù)連續(xù)2年的平均嚴(yán)重度分級(jí)，將供試品種分為抗病(R級(jí)，0<平均嚴(yán)重度<2.0)、中抗(MR級(jí)，2.0≤平均嚴(yán)重度<3.0)、中感(MS級(jí)，3.0≤平均嚴(yán)重度<3.5)和感病(S級(jí)，平均嚴(yán)重度≥3.5)四個(gè)等級(jí)。

1.4 赤霉病抗性基因(QTL)的分子檢測(cè)

每品種(系)選取10粒種子，室溫下發(fā)芽，取嫩葉放入液氮中速凍，采用CTAB法[24]提取基因組DNA。采用與Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5基因和QFhb.crc-2DL位點(diǎn)連鎖的標(biāo)記(表1)對(duì)供試材料進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)所用的陰性對(duì)照品種均為鄭麥9023，其中Fhb1參考Rasheed等[25]的檢測(cè)方法，以蘇麥3號(hào)為陽性對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果與陽性對(duì)照品種一致的，說明該品種(系)可能攜帶Fhb1基因。Fhb2、Fhb4和Fhb5基因參考張 煜等[6]的檢測(cè)方法，均以望水白為陽性對(duì)照。QFhb.crc-2DL位點(diǎn)的檢測(cè)以揚(yáng)麥158為陽性對(duì)照，PCR反應(yīng)體系為10 μL，包含2×Taq MasterMix(P114-03，中國(guó)南京諾唯贊生物科技有限公司)5.0 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.1 μL，DNA模板(50 ng·μL-1)1.0 μL，ddH2O 3.8 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。Fhb2、Fhb4、Fhb5基因和QFhb.crc-2DL位點(diǎn)的兩側(cè)連鎖標(biāo)記與陽性對(duì)照品種檢測(cè)結(jié)果一致，說明該品種(系)可能攜帶有該抗性基因/QTL。

表1 赤霉病抗性基因/QTL相應(yīng)分子標(biāo)記信息

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsoft Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試品種(系)的赤霉病抗性

根據(jù)2016-2017和2017-2018兩年度的赤霉病抗性鑒定結(jié)果，共篩選到赤霉病抗性達(dá)中抗的品種(系)5個(gè)，占供試品種總數(shù)的7.0%，分別為皖麥32(安徽)、皖麥31(安徽)、新鄉(xiāng)289(河南)、西農(nóng)511(陜西)和徐麥DH9(江蘇)，平均病小穗率為19.3%～26.3%，平均嚴(yán)重度為2.0～2.5；赤霉病抗性達(dá)中感的品種(系)17個(gè)，占供試品種總數(shù)的24.0%，11個(gè)來自江蘇，4個(gè)來自河南，1個(gè)來自安徽，1個(gè)來自山東，平均病小穗率為28.9%～48.5%，平均嚴(yán)重度為3.0～3.4；感赤霉病的品種(系)有49個(gè)，占供試品種總數(shù)的 69.0%，10個(gè)來自江蘇，24個(gè)來自河南，10個(gè)來自山東，2個(gè)來自安徽，其他3個(gè)分別來自陜西、北京、河北，平均病小穗率為48.6%～ 78.8%，平均嚴(yán)重度為3.5～4.0。沒有鑒定到赤霉病抗性達(dá)“抗”的品種(系)(表2)。

表2 71個(gè)小麥品種(系)的抗赤霉病鑒定結(jié)果

(續(xù)表2 Continued table 2)

2.2 赤霉病抗性基因/QTL的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

利用與Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5基因和QFhs.crc-2DL位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)供試品種(系)進(jìn)行基因型分析，結(jié)果(表3)顯示，徐麥DH9和淮麥40可能同時(shí)攜帶Fhb1基因和QFhs.crc-2DL位點(diǎn)，太麥198可能僅攜帶Fhb4基因，明麥16和皖麥32可能僅攜帶QFhs.crc-2DL位點(diǎn)。其他品種(系)未檢測(cè)到所檢測(cè)基因/QTL。

表3 赤霉病抗性基因/QTL的分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

3.1 抗赤霉病種質(zhì)資源篩選

單花滴注接種結(jié)合彌霧保濕是鑒定小麥赤霉病抗性最有效的方法。除對(duì)照品種蘇麥3號(hào)外，本試驗(yàn)未鑒定到赤霉病抗性水平達(dá)到“抗”的品種(系)，說明黃淮麥區(qū)匱乏抗赤霉病的品種，這與張 煜等[6]和張 彬等[18]的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，西農(nóng)511、徐麥DH9、皖麥32等22個(gè)品種(系)對(duì)赤霉病的抗性達(dá)到中抗或中感水平，說明這22個(gè)品種(系)赤霉病發(fā)病較輕，在赤霉病發(fā)病年份結(jié)合藥劑防治可在一定程度上控制病害的發(fā)生。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，上述22個(gè)對(duì)赤霉病表現(xiàn)為中抗或中感的小麥品種(系)大多來自或者適宜種植在江蘇、安徽的北部和黃淮南部。2010年以來，隨著氣候的變化，小麥赤霉病在上述地區(qū)已由偶發(fā)性病害轉(zhuǎn)變?yōu)槌０l(fā)性病害，該麥區(qū)的育種家們相繼把培育中感及以上水平的小麥品種納入育種目標(biāo)，因此上述抗性較好的品種(系)無疑是育種家根據(jù)育種目標(biāo)不斷選擇的結(jié)果，這些品種(系)的株高、穗數(shù)等農(nóng)藝性狀與當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境相適應(yīng)，相較于蘇麥3號(hào)、望水白等長(zhǎng)江流域的抗源，這些品種(系)更適宜用于該麥區(qū)抗赤霉病小麥品種的遺傳改良。

3.2 抗赤霉病基因/QTL分析

Fhb1基因是目前國(guó)內(nèi)外唯一公認(rèn)的抗赤霉病主效基因[26]，F(xiàn)hb2、Fhb4、Fhb5基因和QFhs.crc-2DL位點(diǎn)是目前已報(bào)道的赤霉病抗性效應(yīng)值較大且穩(wěn)定的基因/QTL。本研究利用與這些基因/QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)供試品種(系)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)黃淮麥區(qū)小麥品種(系)不攜帶這些基因/QTL，原因可能是這些基因/QTL的來源是長(zhǎng)江中下游麥區(qū)的地方品種和改良品種[20,27]，說明來源于長(zhǎng)江中下游麥區(qū)的抗赤霉病品種或者抗性基因可能還未在黃淮麥區(qū)的抗赤霉病育種中廣泛實(shí)踐。本研究抗赤霉病表型鑒定是在長(zhǎng)江中下游地區(qū)揚(yáng)州的彌霧保濕圃內(nèi)進(jìn)行，小麥開花至灌漿時(shí)期滿足高溫高濕的赤霉病誘發(fā)條件，因此，赤霉病抗性鑒定表現(xiàn)為中感及以上水平的品種(系)可以被認(rèn)定為赤霉病發(fā)病較輕、抗性較好的種質(zhì)資源。抗赤霉病基因/QTL緊密連鎖標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果顯示，國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的赤霉病抗性最好的蘇麥3號(hào)同時(shí)攜有Fhb1、Fhb2基因和QFhs.crc-2DL位點(diǎn)，說明抗病基因/位點(diǎn)的聚合效應(yīng)顯著。本研究還發(fā)現(xiàn)，可能同時(shí)攜有Fhb1基因和QFhs.crc-2DL位點(diǎn)的品種有徐麥DH9和淮麥40，赤霉病抗性分別達(dá)到中抗和中感，系譜分析表明，徐麥DH9的赤霉病抗性來源于H35，而淮麥40來自太谷核不育輪回選擇，其抗病基因的來源尚不清楚；皖麥32和明麥16可能僅攜帶QFhs.crc-2DL抗性位點(diǎn)，對(duì)赤霉病分別表現(xiàn)為中抗和中感，其中皖麥32的赤霉病抗性來自揚(yáng)麥158，而揚(yáng)麥158攜有多個(gè)抗赤霉病位點(diǎn)[4]；明麥16的親本為徐3-01和矮抗58，但其抗病基因的來源尚不清楚。上述結(jié)果顯示，相同的抗病基因在不同的品種中表現(xiàn)的效應(yīng)不同，說明赤霉病抗性基因的表達(dá)與品種本身的遺傳背景等有關(guān)[6]，即使攜帶抗赤霉病主效基因Fhb1，該品種也不一定抗赤霉病，因此在抗赤霉病育種中不是單純的導(dǎo)入某1個(gè)或者2個(gè)抗病基因/QTL就能顯著提高該品種的赤霉病抗性，要同時(shí)注重遺傳背景和抗性基因/QTL的相互選擇。太麥198可能攜帶Fhb4，抗性達(dá)到中感水平，其親本為良星619和山農(nóng)17，但其抗病基因的來源尚不清楚。其他中抗或中感赤霉病的品種(系)中均未檢測(cè)到Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5基因和QFhs.crc-2DL位點(diǎn)，推測(cè)它們可能攜帶其他抗赤霉病基因/QTL，小麥抗赤霉病基因/QTL的挖掘和機(jī)理機(jī)制的研究還有待進(jìn)一步深入進(jìn)行。小麥抗赤霉病屬于復(fù)雜的多基因控制性狀，本研究中僅有6個(gè)品種(系)攜帶1～3個(gè)所檢測(cè)抗病基因/QTL，因此無法用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析基因/QTL對(duì)小麥赤霉病抗性的單位點(diǎn)效應(yīng)或者聚合效應(yīng)，下一步擬增加供試材料，選擇黃淮麥區(qū)近幾年育成的其他主栽品種繼續(xù)進(jìn)行研究，深入解析遺傳背景和抗性基因的相互影響。

4 結(jié) 論

本研究于2016-2017和2017-2018兩年度分別對(duì)71個(gè)黃淮麥區(qū)的小麥品種(系)采用單花滴注接種的方法進(jìn)行赤霉病抗擴(kuò)展性鑒定，沒有發(fā)掘到高抗赤霉病的品種(系)，西農(nóng)511、徐麥DH9、皖麥32、皖麥31、新鄉(xiāng)289、淮麥30、淮麥40、連麥2號(hào)、淮麥21、淮麥44、淮麥33、淮麥38、徐農(nóng)029、明麥16、江麥23、淮麥36、皖麥33、偃展4110、新鄉(xiāng)197、新鄉(xiāng)280、鄭1860和太麥198對(duì)赤霉病的抗性達(dá)到中抗或中感水平。徐麥DH9和淮麥40可能同時(shí)攜帶Fhb1基因和QFhs.crc-2DL位點(diǎn)；明麥16、皖麥32可能僅攜帶QFhs.crc-2DL位點(diǎn)；太麥198可能僅攜帶Fhb4。研究結(jié)果可為黃淮麥區(qū)的小麥抗赤霉病育種提供遺傳資源與信息。

致謝：感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所夏先春研究員和董亞超技術(shù)員在KASP基因分型方面提供的技術(shù)支持。