陳祖旺，林 晶,陳雅君,黃志鵬,王 斌

骨肉瘤是青少年較常見(jiàn)的原發(fā)于骨間充質(zhì)的惡性腫瘤，化療是其主要治療方法，可以使患者的保肢率>68%[1]，但原發(fā)或者繼發(fā)的腫瘤多藥耐藥常阻礙化療藥物療效的發(fā)揮，且機(jī)制復(fù)雜多樣[2]，近期的研究[3]顯示，自噬在腫瘤多藥耐藥中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。姜黃素是一種從姜科植物姜黃根莖中提取得到的酚性色素，可以通過(guò)多種通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和凋亡[4]，甚至在一些腫瘤多藥耐藥細(xì)胞中也能發(fā)揮抗腫瘤活性，是一種具有良好開(kāi)發(fā)前景的抗腫瘤藥物[5]。本研究觀察姜黃素抑制自噬對(duì)骨肉瘤耐藥細(xì)胞增殖、凋亡的影響，旨在為腫瘤多藥耐藥骨肉瘤患者尋找新的潛在治療藥物。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源、試劑和儀器人骨肉瘤MG-63 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。姜黃素、四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)、胰蛋白酶、二甲基亞砜購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)于Gibco公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；微管相關(guān)蛋白Ⅰ/Ⅱ輕鏈3(LC3Ⅰ/Ⅱ)抗體、內(nèi)參GAPDH抗體購(gòu)自Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自SANYO公司；Elx800全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio Tek公司；Quanta SC流式細(xì)胞儀購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.2 順鉑耐藥細(xì)胞的構(gòu)建采用藥物濃度遞增誘導(dǎo)法[6]構(gòu)建MG-63順鉑耐藥細(xì)胞株(MG-63/DDP)，步驟如下：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG-63細(xì)胞接種于6孔板，每孔105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)于10% FBS、100 U/ml 青霉素和100 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞貼壁后，更換含0.5 μmol/L順鉑培養(yǎng)液，約1個(gè)月細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，增加順鉑濃度為1 μmol/L，依次逐漸增加到2 μmol/L，直到MG-63細(xì)胞可以在2 μmol/L順鉑環(huán)境中穩(wěn)定生長(zhǎng)和傳代4～6個(gè)月，此細(xì)胞為MG-63/DDP細(xì)胞。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG-63細(xì)胞和MG-63/DDP細(xì)胞，接種到96孔板，每孔103個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜細(xì)胞貼壁后，加入0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L對(duì)倍稀釋的順鉑，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入0.5 g/L MTT，繼續(xù)孵育培養(yǎng)4 h，吸去上清液，每孔加入100 μl二甲基亞砜溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀570 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔光密度值，計(jì)算順鉑對(duì)MG-63細(xì)胞和 MG-63/DDP細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50值)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Excel軟件，采用Bliss法計(jì)算IC50。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分為A、B、C、D 4組：① A組——將MG-63細(xì)胞接種到6孔板，每孔105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后加入10 μmol/L順鉑；② B組——將MG-63/DDP細(xì)胞接種到6孔板，每孔105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后加入10 μmol/L順鉑；③ C組——將MG-63/DDP細(xì)胞接種到6孔板，每孔105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后加入2 μmol/L姜黃素；④ D組——將MG-63/DDP細(xì)胞接種到6孔板，每孔105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后加入2 μmol/L姜黃素+10 μmol/L順鉑。培養(yǎng)48 h后，4組均用胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌2次，使用凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率的變化。膜聯(lián)蛋白V(Annexin V+)以及Annexin V+碘化丙啶(PI+)細(xì)胞均為凋亡細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞占比。

1.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)4組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，100 ℃水浴20 min，每個(gè)樣品取10 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到陽(yáng)離子尼龍膜，孵育LC3Ⅰ、LC3Ⅱ或GAPDH一抗，過(guò)夜，4 ℃孵育二抗1 h，X線下曝光，AI600 Images軟件檢測(cè)目的條帶，以內(nèi)參為對(duì)照計(jì)算LC3Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量與LC3Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)量的比值(LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ)。

2 結(jié)果

2.1 順鉑對(duì)MG-63細(xì)胞和MG-63/DDP細(xì)胞增殖抑制的影響見(jiàn)圖1。順鉑對(duì)MG-63細(xì)胞和MG-63/DDP細(xì)胞的IC50值分別為4.04～7.62(5.14±1.02)、10.63～14.25(12.42±1.52) μmol/L，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.315，P<0.01)。

圖1 順鉑對(duì)MG-63細(xì)胞和MG-63/DDP細(xì)胞增殖抑制的影響

2.2 姜黃素促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)MG-63/DDP細(xì)胞凋亡的檢測(cè)見(jiàn)圖2。細(xì)胞凋亡率A～D組分別為25.54%～36.48%(30.26%±4.15%)、9.26%～13.33%(11.32%±1.64%)、0.82%～2.53%(1.37%±0.34%)和19.24%～27.06%(22.72%±3.36%)，各組整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.814，P<0.01)；細(xì)胞凋亡率D組明顯高于B組(t=11.312，P<0.01)。

圖2 姜黃素促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)MG-63/DDP細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

2.3 姜黃素對(duì)MG-63/DDP細(xì)胞自噬的抑制作用見(jiàn)圖3、4。LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值A(chǔ)～D組分別為0.27～0.45(0.36±0.07)、2.44～4.53(3.54±0.72)、0.52～1.62(1.13±0.46)和0.77～1.91(1.32±0.52)，各組整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.216，P<0.05)；LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值B、C、D組均明顯高于A組(P<0.01)，且B組明顯高于C、D組(P<0.01)。

圖3 LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白的Western blot檢測(cè)

圖4 4組LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值分析 與A組比較：**P<0.01；與B組比較：▲▲P<0.01

3 討論

骨肉瘤化療方案多含有鉑類藥物，其耐藥機(jī)制復(fù)雜[7]，自噬是細(xì)胞程序性死亡的途徑之一，近期研究[8]顯示，自噬可以參與腫瘤耐藥的調(diào)控，長(zhǎng)期使用順鉑可以誘導(dǎo)自噬，激活絲裂原活化蛋白激酶參與骨肉瘤細(xì)胞耐藥[9]，而且抑制骨肉瘤細(xì)胞自噬可以逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥[10]。本研究使用藥物濃度遞增誘導(dǎo)法構(gòu)建MG-63/DDP細(xì)胞株，結(jié)果顯示順鉑對(duì)MG-63/DDP細(xì)胞的IC50值顯著高于MG-63細(xì)胞，說(shuō)明誘導(dǎo)耐藥的產(chǎn)生，MG-63/DDP細(xì)胞可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。LC3Ⅰ和LC3Ⅱ是自噬的標(biāo)志性蛋白，自噬增強(qiáng)時(shí)LC3-Ⅰ可由蛋白酶Atg4切割經(jīng)修飾形成PE結(jié)合型LC3-Ⅱ，使用LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值可以反映出細(xì)胞自噬的激活狀態(tài)[11]。本研究中的自噬蛋白Western blot分析顯示，LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值B、C、D組均顯著高于A組，說(shuō)明了MG-63/DDP細(xì)胞處于自噬激活狀態(tài)。

姜黃素是從姜科植物姜黃的根莖中提取的一種酚性天然色素，研究[12]顯示，姜黃素可以抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在胃癌的研究[13]中發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以調(diào)節(jié)胃癌AGS細(xì)胞的自噬通路發(fā)揮抗腫瘤效果，而且在一些耐藥腫瘤細(xì)胞中也可以發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)自噬通路的調(diào)節(jié)作用[14]。本研究中， LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值C、 D組顯著低于B組，說(shuō)明姜黃素可以抑制MG-63/DDP細(xì)胞自噬通路的激活；細(xì)胞凋亡分析顯示，細(xì)胞凋亡率D組顯著高于B組，提示抑制了MG-63/DDP細(xì)胞自噬激活后，順鉑對(duì)MG-63/DDP細(xì)胞的致凋亡作用顯著增加，上述結(jié)果預(yù)示姜黃素可以克服骨肉瘤細(xì)胞的多藥耐藥。本研究中， 細(xì)胞凋亡率C組只有0.82%～2.53%(1.37%±0.34%)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)劑量的姜黃素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，文獻(xiàn)[15]顯示，姜黃素是一種高效低毒的抗腫瘤藥物，對(duì)人體幾乎沒(méi)有副作用，是一個(gè)有前景的抗腫瘤臨床開(kāi)發(fā)候選藥物。

綜上所述，姜黃素可以抑制MG-63/DDP細(xì)胞自噬激活，促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞多藥耐藥細(xì)胞凋亡。