徐麗群，張麗君，李高志，張曉雁，王藝璇，胡澤兵，曹新生，石 菲，張 舒

空軍軍醫(yī)大學(xué) 航空航天生物動(dòng)力學(xué)教研室，航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710032

機(jī)械刺激在維持骨骼重塑和平衡中起著至關(guān)重要的作用[1-2]。長期臥床休息或太空飛行會導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)流失，引發(fā)骨質(zhì)疏松癥和骨折[3-4]。成骨細(xì)胞可以響應(yīng)機(jī)械刺激的變化，并轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的生化信號調(diào)節(jié)基因表達(dá)，影響成骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[5-6]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶Ⅰ(silent information regulator 1，SIRT1)，是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide +，NAD+)依賴性組蛋白去乙酰化酶參與調(diào)控多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞周期、晝夜節(jié)律、細(xì)胞衰老、血管生成、能量代謝等[7]。大量研究已表明SIRT1通過調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖、分化及凋亡在骨骼發(fā)育和重塑中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[8-9]。但其能否在模擬失重下影響成骨細(xì)胞功能及上游調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，通過靶向mRNA抑制基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯發(fā)揮作用[10-11]。研究表明miRNA對骨穩(wěn)態(tài)和骨骼重塑至關(guān)重要，可通過激活或抑制大量與骨形成相關(guān)的基因和信號通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[5,10,12]。此外，已報(bào)道大量miRNA對失重敏感，并且對成骨細(xì)胞功能有顯著影響，如miR-132-3p、miR-139-3p、miR-320-3p等[13-15]。最近研究表明，miR-138-5p是一種機(jī)械敏感的miRNA，可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能[16]。本研究以MC3T3-E1前成骨細(xì)胞為研究對象，檢測了SIRT1和miR-138-5p在模擬失重下的表達(dá)，探究失重性或廢用性骨質(zhì)疏松癥發(fā)生機(jī)制，為治療靶點(diǎn)的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 材料 小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(四季青公司)，青-鏈霉素雙抗(Gibco公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，2D回轉(zhuǎn)器(中國航天員科研訓(xùn)練中心)，mimic-138-5p、inhibitor-138-5p、si-SIRT1、pcDNA3.1(+)-SIRT1及相應(yīng)的陰性對照(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，RNAiso Plus細(xì)胞裂解液，SYBR?Premix Ex TaqTM、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit、Prime Script?RT reagent Kit(TaKaRa公司)，PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)，M-PER哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑(Thermo Fisher Scientific公司)，預(yù)制膠(美國Invitrogen公司)，PVDF膜(美國Invitrogen公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國Sigma公司)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測試盒(南京建成生物工程研究所)，BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒(中國Beyotime公司)，qRT-PCR儀(美國Bio-Rad公司)，ECL發(fā)光檢測試劑盒(Merck Millipore公司)，PBS緩沖溶液(Gibco公司)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)，化學(xué)發(fā)光儀(Tanon-4 200，上海天能科技有限公司)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和體外分化 用含有10%胎牛血清(Gibco)、1%青霉素和1%鏈霉素(Gibco)的α-MEM培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)箱(5% CO2，95%濕度)中常規(guī)培養(yǎng)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞系。為了研究成骨細(xì)胞分化，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞(成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分：10%胎牛血清，1%青霉素，1%鏈霉素，100 nmol/L地塞米松，50 μg/mL抗壞血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸)。實(shí)驗(yàn)均用第8～12代的細(xì)胞，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

3 細(xì)胞模擬失重實(shí)驗(yàn) 2D回轉(zhuǎn)器用于模擬地面細(xì)胞的失重環(huán)境，將MC3T3-E1細(xì)胞以5 × 105/瓶的密度接種在25 cm2專用回轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁并融合后，在培養(yǎng)瓶中灌滿培養(yǎng)基并加塞，此過程確保完全去除氣泡。最后，將培養(yǎng)瓶置于2D回轉(zhuǎn)器，圍繞其水平軸以24 r/min旋轉(zhuǎn)24 h、48 h和72 h，獲得的細(xì)胞為失重組( Clino)。對照組(Con)置入37℃孵箱中普通培養(yǎng)。

4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將MC3T3-E1細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏葌髦亮装?，并用有血清無雙抗的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)過夜，當(dāng)細(xì)胞密度為60%～80%時(shí)轉(zhuǎn)染。使用Lipofectamine 2000將miR-138-5p mimic (40 nmol/L)、miR-138-5p inhibitor (80 nmol/L)及其相應(yīng)的陰性對照轉(zhuǎn)染到MC3T3-E1細(xì)胞中；使用Lipofectamine 3000，將pEX-SIRT1 (100 ng/μL)及陰性對照pEX分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，無血清無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)6 ~ 8 h后 更換為有血清無雙抗培養(yǎng)基。

5 挽救實(shí)驗(yàn) 將MC3T3-E1細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏葌髦?5 cm2專用回轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，并用有血清無雙抗的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)過夜，當(dāng)細(xì)胞密度為60%時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染12 h后在培養(yǎng)瓶中灌滿培養(yǎng)基并加塞，將培養(yǎng)瓶置于2D回轉(zhuǎn)器并圍繞其水平軸以24 r/min旋轉(zhuǎn)48 h，獲得的細(xì)胞為失重組(Clino)。對照組( Con)置入37℃孵箱中普通培養(yǎng)。

6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用RNAiso Plus裂解細(xì)胞并提取MC3T3-E1細(xì)胞的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)。使用Prime ScriptTMRT Master Mix Kit按照以下步驟對mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：37℃15 min，85℃ 5 s，4℃保存；使用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit按照以下步驟對miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：37℃ 1 h，85℃ 5 min，4℃保存。以GAPDH或U6作為內(nèi)參。使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ和CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)通過qRT-PCR檢測mRNA的表達(dá)。PCR引物序列見表 1。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

7 蛋白質(zhì)印跡分析 胰酶消化收集細(xì)胞后加入含有10%蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液提取MC3T3-E1細(xì)胞總蛋白。超聲裂解后在4℃下12 000 r/min離心10 min，吸取上清即為蛋白樣品。使用PierceTMBCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒和紫外分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白定量。按照Western blot常規(guī)操作進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下，用5%脫脂奶將膜封閉2 h，并在4℃下與特異性一抗孵育過夜。使用一抗如下：GAPDH(1∶1 000；Cell Signaling Technology，美國)，Runx2(1∶1 000；Cell Signaling Technology，美國)，Osx(1∶1 000；Cell Signaling Technology，美國)，SIRT1(1∶1 000；Proteintech，美國)。然后，將膜與二抗孵育2 h(1∶5 000；ZS-GB-BIO公司)，并使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。使用 Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

8 堿性磷酸酶活性測定 將MC3T3-E1細(xì)胞胰酶消化收集后加入含有10%蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，超聲裂解后在4℃下12 000 r/min離心10 min吸取上清。使用ALP檢測試劑盒檢測上清液中的ALP活性。上清液加入顯色劑37℃孵育15 min后，以苯酚為標(biāo)準(zhǔn)溶液，ddH2O作為空白對 照溶液測定溶液520 nm處的吸光度值。

9 堿性磷酸酶染色 使用BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒進(jìn)行堿性磷酸酶染色。細(xì)胞用PBS沖洗后用4%多聚甲醛固定15 min。將固定的細(xì)胞再次用PBS沖洗3次，然后將BCIP/NBT染色工作液加到每個(gè)孔中，室溫避光孵育30 min后用ddH2O洗 滌終止顯色反應(yīng)。數(shù)碼相機(jī)拍照。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS22.0軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以 xˉ± s表示，t檢驗(yàn)用于兩樣本間比較，One-way ANOVA用于多樣本間比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

結(jié) 果

1 SIRT1在模擬失重下的表達(dá) 與Con組相比，模擬失重24 h、48 h、72 h后，qRT-PCR結(jié)果表明MC3T3-E1細(xì)胞中Runx2、SIRT1 mRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)(圖1A)，Western blot結(jié)果也顯示模擬失重48 h后SIRT1蛋白水平下 調(diào)(P＜0.01)(圖1B)。

圖1 模擬失重下MC3T3-E1細(xì)胞SIRT1的表達(dá)(aP ＜ 0.05, bP ＜ 0.01, vs Con組)A：模擬失重24 h、48 h、72 h后MC3T3-E1細(xì)胞的Runx2及SIRT1 mRNA表達(dá)；B：模擬失重48 h后MC3T3-E1細(xì)胞的SIRT1蛋白表達(dá)Fig.1 Expression level of SIRT1 in MC3T3-E1 cells cultured in simulated microgravity (aP ＜ 0.05, bP ＜ 0.01, vs Con group)A: Runx2 and SIRT1 mRNA expression levels in MC3T3-E1 cells after simulated weightlessness for 24 h, 48 h and 72 h; B: SIRT1 protein expression level in MC3T3-E1 cells after simulated weightlessness for 48 h

2 miR-138-5p在模擬失重下表達(dá)上調(diào)并抑制骨分化 為了驗(yàn)證miR-138-5p是否在模擬失重下差異表達(dá)且發(fā)揮作用，將MC3T3-E1細(xì)胞在2D回轉(zhuǎn)器中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后進(jìn)行 檢測。qRTPCR結(jié)果表明，在模擬失重過程中，miR-138-5p水平升高(P＜0.05或P＜0.01)(圖2A)。為了探究miR-138-5p在成骨細(xì)胞分化中的作用，向成骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimic、inhibitor或陰性對照。qRT-PCR結(jié)果表明，與mimic-NC組相比，mimic組Runx2、Osx、ALP mRNA水平表達(dá)顯著下降，且Runx2、Osx蛋白水平也顯著下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)；與inhibitor-NC組相比，inhibitor組Runx2、Osx、ALP mRNA水平表達(dá)無明顯變化，但Runx2、Osx蛋白水平顯著上調(diào)(P＜0.01)(圖2B，圖2C)。ALP活性檢測及ALP染色檢測結(jié) 果與qRT-PCR、Western blot結(jié)果一致(圖2D)。

圖2 miR-138-5p在模擬失重下表達(dá)上調(diào)并抑制骨分化(aP ＜ 0.05, bP ＜ 0.01, vs Con組)A：模擬失重下MC3T3-E1細(xì)胞miR-138-5p的表達(dá)；B：轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimic、inhibitor或陰性對照后Runx2、Osx及ALP的mRNA表達(dá)；C：轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimic、inhibitor或陰性對照后Runx2和Osx蛋白的表達(dá)；D：ALP染色Fig.2 Expression level of miR-138-5p was up-regulated and then inhibited bone differentiation under simulated microgravity (aP ＜ 0.05, bP ＜0.01, vs Con group)A: Expression level of miR-138-5p in MC3T3-E1 cells cultured in simulated microgravity; B: mRNA expression levels of Runx2, Osx and ALP after transfection with mimic-138-5p, inhibitor-138-5p and negative control; C: Protein expression levels of Runx2 and Osx after transfection with mimic-138-5p, inhibitor-138-5p and negative control; D: Representative staining images of ALP in osteoblasts

3 miR-138-5p依賴SIRT1負(fù)調(diào)控成骨細(xì)胞分化 為了驗(yàn)證miR-138-5p是否通過靶向SIRT1調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞功能，將miR-138-5p mimic和pEXSIRT1或其陰性對照共轉(zhuǎn)染到MC3T3-E1細(xì)胞中。與Con組相比，mimic組的成骨細(xì)胞分化能力顯著降低(P＜0.01)；而在轉(zhuǎn)染pEX-SIRT1后，細(xì)胞中SIRT1、Runx2、Osx、ALP mRNA水平顯著升高，且SIRT1、Runx2、Osx蛋白水平也明顯升高(P＜0.01)；ALP染色檢測得到了相同的結(jié)果(圖3)。轉(zhuǎn)染pEX-SIRT1后明顯改善miR-138-5p mimic導(dǎo)致的MC3T3-E1細(xì)胞分化抑制，提示pEX-SIRT1能夠部分抵消成骨細(xì)胞分化抑制，且m iR-138-5p依賴SIRT1負(fù)調(diào)控成骨細(xì)胞分化。

圖3 miR-138-5p依賴SIRT1負(fù)調(diào)控成骨細(xì)胞分化(aP ＜ 0.05, bP ＜ 0.01, vs Con組)A：miR-138-5p mimic和pEX-SIRT1或其陰性對照共轉(zhuǎn)染到MC3T3-E1細(xì)胞后Runx2、Osx及ALP的mRNA的表達(dá)；B：miR-138-5p mimic和pEX-SIRT1或其陰性對照共轉(zhuǎn)染后，Runx2和Osx蛋白的表達(dá)；C：ALP染色Fig.3 SIRT1 is essential for miR-138-5p to inhibit osteoblast differentiation (aP ＜ 0.05, bP ＜ 0.01, vs Con group)A: mRNA expression levels of Runx2, Osx and ALP after transfection with mimic-138-5p and pEX-SIRT1 or negative control; B: Protein expression levels of SIRT1, Runx2 and Osx after transfection with mimic-138-5p and pEX-SIRT1 or negative control; C: Representative staining images of ALP in osteoblasts

4 抑 制miR-138-5p可 緩 解 模 擬 失 重 導(dǎo) 致的MC3T3-E1細(xì)胞分化抑制 為了進(jìn)一步探究模擬失重下通過miR-138-5p/SIRT1是否調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化，我們用miR-138-5p inhibitor轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞12 h后在模擬失重環(huán)境中培養(yǎng)48 h。與Con組相比，抑制miR-138-5p可以部分緩解模擬失重導(dǎo)致的SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)抑制以及成骨分化抑制，表現(xiàn)為促進(jìn)SIRT1、Runx2、Osx、ALP mRNA表達(dá)，促進(jìn)SIRT1、Runx2、Osx蛋白表達(dá)(P＜0.01)(圖4)。提示通過抑制miR-138-5p/SIRT1通路可以減輕模擬失重下成骨細(xì)胞的分化抑制，miR-138-5p可以作為潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。

圖4 抑制miR-138-5p可緩解模擬失重導(dǎo)致的MC3T3-E1細(xì)胞分化抑制(aP ＜ 0.05, bP ＜ 0.01, vs Con組)A：轉(zhuǎn)染miR-138-5p inhibitor后模擬失重48 h，SIRT1、Runx2、Osx及ALP的mRNA表達(dá)；B：轉(zhuǎn)染miR-138-5p inhibitor后模擬失重48 h，SIRT1、Runx2和Osx的蛋白表達(dá)Fig.4 Silencing miR-138-5p could alleviate the alterations in differentiation of MC3T3-E1 cells under simulated microgravity conditions (aP ＜0.05, bP ＜ 0.01, vs Con group)A: mRNA expression levels of SIRT1, Runx2, Osx and ALP after transfection with miR-138-5p inhibitor by qRT-PCR under microgravity; B: Protein expression levels of SIRT1, Runx2 and Osx after transfection with miR-138-5p inhibitor by Western blotting under microgravity

討 論

骨骼是一種動(dòng)態(tài)組織，成骨細(xì)胞的合成代謝和破骨細(xì)胞的分解代謝使骨骼組織不斷自我更新，并保持適當(dāng)?shù)墓橇亢外}穩(wěn)態(tài)[17]。機(jī)械刺激在維持骨骼重塑方面起著重要作用。同時(shí)，骨骼可以通過調(diào)整自身的質(zhì)量和結(jié)構(gòu)來應(yīng)對力學(xué)條件的變化[1]。失重引起的骨骼系統(tǒng)損傷是中長期航天飛行的主要局限之一。在航天員和地面動(dòng)物模型中，已經(jīng)證實(shí)失重可造成骨量減少、礦化減少和骨基質(zhì)基因表達(dá)降低[18-19]。

SIRT1是基因表達(dá)、細(xì)胞分化和代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)SIRT1可延長小鼠的壽命，并可緩解衰老所致的骨質(zhì)疏松[20]。SIRT1敲除的小鼠小梁骨和骨皮質(zhì)中均出現(xiàn)明顯的缺陷，并隨著年齡增長不斷惡化，表明SIRT1在骨骼重塑中至關(guān)重要[21]。SIRT1可通過抑制PPARγ或激活β-catenin、FoxO和Runx2表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[22-24]，但SIRT1是否在失重環(huán)境下參與骨骼發(fā)育及其上游調(diào)控機(jī)制尚不清楚。越來越多的證據(jù)顯示miRNA參與多種骨骼疾病的預(yù)后和進(jìn)展，并可能成為未來基因治療的靶點(diǎn)[10-12]。miR-138-5p是一種機(jī)械敏感的miRNA，在機(jī)體發(fā)育中起著復(fù)雜而全面的調(diào)節(jié)作用。miR-138作為腫瘤抑制因子，可參與腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，以及DNA損傷反應(yīng)和修復(fù)[25]。此外，miR-138在神經(jīng)元發(fā)育、神經(jīng)疾病、心臟形態(tài)發(fā)生和乳腺發(fā)育中發(fā)揮重要作用[26]。最近研究表明miR-138是骨骼細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控因子，在骨骼疾病中發(fā)揮重要作用，如骨質(zhì)疏松、骨肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、骨關(guān)節(jié)炎和軟骨肉瘤等[27]。SIRT1最近被確定為miR-138的靶基因，可能與神經(jīng)發(fā)育和疾病有關(guān)[28]。然而目前尚未報(bào)道模擬失重下能否通過miR-138-5p/SIRT1通路調(diào)控成骨細(xì)胞分化。

本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)MC3T3-E1細(xì)胞在模擬失重環(huán)境中SIRT1表達(dá)降低，而miR-138-5p表達(dá)水平顯著升高。分別向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-138-5p mimic或inhibitor進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-138-5p能夠顯著減少Runx2、Osx mRNA及蛋白表達(dá)；miR-138-5p inhibitor能夠上調(diào)Runx2、Osx蛋白水平，但對Runx2、Osx、ALP mRNA水平無影響，表明miR-138-5p inhibitor可能通過抑制mRNA的翻譯對SIRT1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，而非調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。此外，抑制miR-138-5p可以緩解模擬失重導(dǎo)致的MC3T3-E1細(xì)胞分化抑制。綜上，miR-138-5p通過直接靶向SIRT1抑制成骨細(xì)胞分化，可能對失重引起的骨質(zhì)丟失具有保護(hù)作用。本研究揭示了miR-138-5p/SIRT1信號通路在成骨細(xì)胞中的功能，為以miR-138-5p為干預(yù)靶點(diǎn)治療失重性骨質(zhì)丟失或廢用性骨質(zhì)疏松癥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。