費(fèi)曉影，王思農(nóng)，王亞紅，李丹

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000）

濕疹又稱特應(yīng)性皮炎，是一種復(fù)雜的慢性皮膚病，兒童患病率高達(dá)30%，通常會持續(xù)到成年期［1］。有研究發(fā)現(xiàn)濕疹屬于基因性疾病，遺傳因素是構(gòu)成濕疹發(fā)病的重要原因，加之皮膚屏障破壞、功能受損導(dǎo)致變應(yīng)原侵入和細(xì)菌定植［2］，引發(fā)皮膚異常的免疫反應(yīng)和炎癥。慢性濕疹主要是以Th2為主的異常免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能障礙、免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）過度產(chǎn)生和嗜酸粒細(xì)胞增高等［3］，從而導(dǎo)致器官的變態(tài)反應(yīng)炎癥，一般伴有持續(xù)的瘙癢和皮膚組織的炎癥反應(yīng)，如慢性濕疹皮膚樣變。有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，IgE介導(dǎo)的慢性濕疹的發(fā)病和全病程均有趨化因子CCL17、CCL18 參與。本研究主要基于血清趨化因子CCL17和CCL18研究探討藏藥二十五味兒茶凝膠方對慢性濕疹模型大鼠的影響，從而明確其治療慢性濕疹的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（甘）2015－001。在SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心統(tǒng)一飼養(yǎng)環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)要求下進(jìn)行喂養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑及藥物

青鵬軟膏（西藏奇正藏藥股份有限公司，批號：2011271）；醫(yī)用白凡士林（山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司，批號：201203）；2，4－二硝基氯苯（DNCB，上海中秦化學(xué)試劑有限公司，批號：150409）；丙酮（上海久德化學(xué)試劑有限公司，批號：140916）；CCL17、CCL18 ELISA試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）。

1.3 動物分組及造模

采用隨機(jī)數(shù)字表法將60 只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥物組（對照組）、藏藥二十五味兒茶凝膠低劑量組（低劑量組）、藏藥二十五味兒茶凝膠中劑量組（中劑量組）和藏藥二十五味兒茶凝膠高劑量組（高劑量組），每組10 只。除空白組外，其余各組大鼠以致敏物質(zhì)DNCB 反復(fù)多次激發(fā)，按照文獻(xiàn)［4］制備濕疹動物模型。大鼠在實(shí)驗(yàn)前1日于背部取3 cm×3 cm的面積進(jìn)行脫毛處理，次日脫毛區(qū)外涂5%DNCB 50 μL進(jìn)行第1 次致敏。2 周后剪毛區(qū)再次去毛，次日外涂1%DNCB 100 μL，進(jìn)行第2次致敏。此后繼續(xù)致敏，每周1次，連續(xù)4周。第4周致敏結(jié)束3 d后觀察各組實(shí)驗(yàn)大鼠背部的皮膚狀態(tài)，出現(xiàn)紅斑、丘疹、水腫、抓痕、脫屑，即為造模成功。隨后各組開始治療干預(yù)。

1.4 給藥治療

根據(jù)大鼠背部面積與人臉面積之間外用藥物劑量等效換算公式計(jì)算給藥劑量。對照組大鼠涂抹青鵬軟膏0.02 g/（cm2·d），模型組大鼠涂抹凡士林0.02 g/（cm2·d），高、中、低劑量組分 別 涂抹0.01、0.005、0.002 5 g/（cm2·d）劑量的藏藥二十五味兒茶凝膠，空白組不予處理。每日給藥1次，連續(xù)給藥10 d。

1.5 評價(jià)指標(biāo)

1.5.1 大鼠背部濕疹皮損程度評分

各組大鼠于末次給藥24 h 后，按照濕疹皮損程度評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行皮損程度計(jì)分［4］。見表1。

表1 濕疹皮損程度評分

1.5.2 大鼠血清趨化因子CCL17和CCL18水平

根據(jù)試劑盒要求，采用ELISA 法檢測各組大鼠血清中趨化因子CCL17 和CCL18 水平。檢測過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用SPSS 24.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05 代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠背部組織皮損程度及評分比較

與空白組大鼠相比，模型組大鼠背部皮膚糜爛、紅斑、水腫、滲出、角化結(jié)痂等皮損程度明顯，皮損程度評分增加（P<0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組大鼠背部皮膚糜爛、紅斑、水腫等癥狀普遍減輕或消失不見，角化、滲出等現(xiàn)象普遍減輕，皮損程度評分降低（P<0.05）；低、中、高劑量組治療效果呈劑量依賴性；與對照組相比，高劑量組皮損程度及評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 各組大鼠背部濕疹皮損程度評分結(jié)果比較（±s）

表2 各組大鼠背部濕疹皮損程度評分結(jié)果比較（±s）

注：與空白組相比，*P < 0.05；與模型組相比，#P < 0.05；與低劑量組相比，@P<0.05；與中劑量組相比，&P<0.05。

組別空白組模型組對照組低劑量組中劑量組高劑量組n 10 10 10 10 10 10劑量［g/（cm2·d）］0.02 0.02 0.02 0.002 5 0.005 0.01皮損程度評分（分）0 4.81±0.17*1.92±0.33*#@&3.80±0.28*#3.20±0.29*#@1.93±0.27*#@&

2.2 各組大鼠血清趨化因子CCL17、CCL18表達(dá)比較

與空白組相比，模型組大鼠血清中CCL17、CCL18水平明顯升高（P< 0.05）；與模型組相比，各治療組CCL17、CCL18 水平均下降（P< 0.05）；低、中、高劑量組對CCL17、CCL18 的影響呈劑量依賴性；與對照組相比，高劑量組大鼠血清CCL17、CCL18 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清中CCL17，CCL18的表達(dá)水平（±s，pg/mL）

表3 各組大鼠血清中CCL17，CCL18的表達(dá)水平（±s，pg/mL）

注：與空白組相比，*P < 0.05；與模型組相比，#P < 0.05；與低劑量組相比，@P<0.05；與中劑量組相比，&P<0.05。

組別空白組模型組對照組低劑量組中劑量組高劑量組n 10 10 10 10 10 10 CCL17 89.5±4.8 157.6±7.9*110.6±6.2*#@&144.9±13.9*#125.5±5.5*#109.9±5.4*#@&CCL18 152.6±7.1 207.6±6.7*158.1±6.8*#@&193.1±7.0*#185.5±6.0*#157.1±6.9*#@&

3 討論

濕疹在中醫(yī)學(xué)中有“濕瘡”“濕癬”之稱，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為慢性濕疹發(fā)于肌膚，病在脾胃，主要由于稟賦不耐，飲食失節(jié)，或貪嗜辛辣刺激等發(fā)物，以致脾胃運(yùn)化失司，濕熱內(nèi)生，又感風(fēng)濕或暑濕等外邪，內(nèi)外之邪搏結(jié)于肌膚而發(fā)??；或因肝氣郁結(jié)，腎陽不足致水濕泛溢肌膚而發(fā)病。本病以外感六淫之邪為標(biāo)，其本為五臟虛損，分為濕熱蘊(yùn)膚、脾虛濕蘊(yùn)、血虛風(fēng)燥三型，臨床多以清熱利濕止癢為主要治法。本方為甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)試生產(chǎn)階段的院內(nèi)制劑，藏藥二十五味兒茶膏最早記載于《四部醫(yī)典》，其組方主要包括乳香、紅花、兒茶、余甘子、毛訶子、訶子、肉豆蔻、木香、豆蔻、蓽茇、黃精、天冬、甘肅棘豆、黃葵子、決明子、安息香、麝香、水牛角、秦艽花、蒺藜、藏菖蒲、寬筋藤、鐵棒錘、珍珠母、西藏棱子芹等［5］。上述諸藥相和能夠健脾利濕、清熱祛風(fēng)、潤膚養(yǎng)血，加之藏醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，黃水由水谷入于脾胃而形成，人體功能異常失衡時(shí)就會形成“黃水證”，而本方也具有干黃水、消腫毒的作用，因此藏醫(yī)用其治療濕疹、滲出性皮膚病、黃水病等。藏藥二十五味兒茶凝膠是導(dǎo)師在原方的基礎(chǔ)上加減藥味、改良劑型，運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和傳統(tǒng)工藝制成。其中乳香消腫生肌，治療癰腫瘡瘍；紅花活血通脈以化瘀消斑；兒茶止血生肌、收濕斂瘡，治療濕疹、濕瘡；余甘子、訶子、毛訶子配伍使用，是藏藥方中常見的基礎(chǔ)方，稱為藏藥大三果，具有清熱、調(diào)和氣血、化解壞血的功效；木香、肉豆蔻行氣止痛；豆蔻、蓽茇化濕；天冬、黃精養(yǎng)陰潤燥；安息香、人工麝香行氣活血、消腫止痛；蒺藜、秦艽花祛風(fēng)濕、清濕熱，活血止癢，治療皮膚瘙癢；珍珠母解毒生肌、潤膚祛斑從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合；西藏棱子芹是傳統(tǒng)常用的藏藥材資源，能愈合瘡傷。且凝膠劑作為一種新型制劑，具有親和性好、滲透性高、局部見效快、藥物經(jīng)皮吸收快、透氣性好的特點(diǎn)，并可長時(shí)間作用于患處，發(fā)揮藥物作用。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，乳香中含有乳香酸類物 質(zhì)acetyl－l1－keto－β－boswellicacid（AKBA），AKBA 能夠調(diào)節(jié)由產(chǎn)生干擾素γ 的CD4+T（Th1）細(xì)胞和IL－17 產(chǎn)生的CD4+T（Th17）細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾?。?］，可以通過影響炎癥因子以及細(xì)胞分子達(dá)到抗炎免疫的作用。紅花中的紅花多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，可通過TLR4 激活NF－κB 信號通路并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子（IL－1，IL－6，IL－12 和IFN－γ），參與炎癥反應(yīng)［7］。此外，紅花黃色素能夠降低黑色素，作為皮膚美白劑。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)豆蔻中的有效成分2－羥基－3－甲氧基苯甲酸對于活動性全身過敏反應(yīng)，以及由IgE 介導(dǎo)的被動皮膚過敏反應(yīng)具有預(yù)防和保護(hù)作用；此外豆蔻中的1，2，4，5－四甲氧基苯能抑制Th2 細(xì)胞因子在組織中的表達(dá)，還能改善由粉塵螨誘導(dǎo)的過敏性炎癥，其機(jī)制是通過抑制細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，降低血清組胺、炎癥細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的組織滲透［8］。大三果的藥理活性豐富，具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、愈合創(chuàng)面等功效，其醇提取物能抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥，減輕小鼠特應(yīng)性皮炎的臨床癥狀，其機(jī)制可能與降低促炎癥因子釋放及減弱過度激活的免疫功能有關(guān)［9－10］。麝香的主要活性物質(zhì)麝香酮，化學(xué)名為3－甲基環(huán)十五烷酮，臨床療效與天然麝香基本一致，可作為麝香的替代用品抑制炎癥反應(yīng)［11］。安息香可通過降低炎性介質(zhì)LDH、TNF－α 及IL－8 的活性，從而修復(fù)、改善內(nèi)皮細(xì)胞損傷，同時(shí)還可抑制炎癥相關(guān)細(xì)胞因子（IL－1β、IL－6 和TNF－α）的表達(dá)［12］。藏菖蒲的水提取物可通過多重機(jī)制抑制由人體皮膚永生化角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子IL－6和IL－8 形成，從而發(fā)揮抗炎作用，并有可能成為一種新的、有效的皮膚抗炎藥；同時(shí)，菖蒲根中提取出的多糖能刺激M1 極化巨噬細(xì)胞和促進(jìn)小鼠體內(nèi)的Th1 免疫反應(yīng)［13］。秦艽、黃精、甘肅棘豆、決明子、寬筋藤均具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，黃精的主要活性成分黃精多糖、黃精皂苷，能夠調(diào)節(jié)炎癥信號通路；寬筋藤能抑制毛細(xì)血管的通透性、降低炎性因子的滲出率［14－18］。

目前慢性濕疹的病因病機(jī)尚未完全明確，有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)遺傳因素、環(huán)境因素以及免疫功能異常相互作用導(dǎo)致了濕疹的發(fā)生［19］。慢性濕疹是由T 淋巴細(xì)胞浸潤為主的炎癥性疾病，而各種趨化因子參與調(diào)節(jié)和完成了疾病發(fā)病機(jī)制中T 細(xì)胞的遷移和招募的關(guān)鍵過程。CC 趨化因子功能包括趨化、免疫、遷移、炎癥反應(yīng)以及誘導(dǎo)組胺釋放參與過敏反應(yīng)等［20］，在慢性濕疹的發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用。CCL17被稱為胸腺和激活調(diào)節(jié)趨化因子，其生物學(xué)的功能豐富，能夠參與到機(jī)體的炎癥、超敏反應(yīng)及自身免疫性疾病等多種病理生理過程，CCR4 作為CCL17 的受體，其募集的Th2 細(xì)胞可以誘導(dǎo)CCR4 配體在一個(gè)正反饋回路中進(jìn)一步表達(dá)，從而增強(qiáng)過敏性炎癥。并且Th2 細(xì)胞可以通過IL－4、IL－5 和IL－13 促進(jìn)炎癥的發(fā)作，CCL17 誘導(dǎo)Th2 細(xì)胞在趨化過程中發(fā)揮重要作用［21］。因此，CCL17 被認(rèn)為是濕疹發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵趨化因子，是反映濕疹疾病活動性可靠的生物標(biāo)志物之一［22］。CCL18 由Th2 型有關(guān)的細(xì)胞因子IL－4、IL－13 和IL－10誘導(dǎo)產(chǎn)生［23］，CCR8 作為CCL18 的受體高表達(dá)于Th2 淋巴細(xì)胞上，CCR8 能夠招募Th2 型細(xì)胞趨化因子在慢性濕疹中的高度表達(dá)。研究顯示CCL18 通過自分泌或旁分泌的方式作用于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞等參與機(jī)體的免疫和炎癥過程，CCL18 可以作為一種結(jié)構(gòu)性的產(chǎn)物誘導(dǎo)趨化因子或吸引淋巴細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞，使Th1 和Th2 均可參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，特別是耐受性免疫應(yīng)答，如對抗感染、促使傷口愈合或是平衡過度免疫應(yīng)答等［24］，據(jù)此表明CCL18 在慢性濕疹的發(fā)病機(jī)制及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用。

本研究通過ELISA 法檢測各組大鼠血清CCL17、CCL18 的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了血清CCL17 及CCL18 參與、影響慢性濕疹的發(fā)病及預(yù)后，其血清水平與病情的程度聯(lián)系密切。由此結(jié)果可知，藏藥二十五味兒茶凝膠對下調(diào)血清CCL17 和CCL18 表達(dá)有重要作用，這可能是本方治療慢性濕疹的機(jī)制之一。同時(shí)本研究也可證實(shí)，血清中CCL17 和CCL18 的表達(dá)是治療慢性濕疹的又一靶點(diǎn)，值得在基礎(chǔ)研究和臨床治療中予以一定的關(guān)注。