李衛(wèi)先，李達(dá)

（湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，湖南 株洲 412012)

腦缺血再灌注損傷是指腦缺血恢復(fù)血液灌流之后，缺血區(qū)出現(xiàn)由血流再通所致的一系列病理?yè)p傷過(guò)程，其致死率和致殘率高，是危害人類健康的重要疾病之一。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是清代名醫(yī)王清任創(chuàng)立的益氣活血名方，是目前治療腦缺血病應(yīng)用最多的方劑［1］，全方由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁等7味中藥組成。該方具有良好的抗腦缺血損傷作用。方中黃芪有生黃芪、蜜黃芪，當(dāng)歸、赤芍、川芎、地龍等藥除有生品外，還有酒制品等炮制品，但原方并未闡明方中各藥所用的具體炮制品。各飲片在方中炮制品的選擇是本方療效發(fā)揮的關(guān)鍵問(wèn)題，因此找出特定藥效條件下的補(bǔ)陽(yáng)還五湯中黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎、地龍所應(yīng)運(yùn)用的具體炮制品，并對(duì)其抗腦缺血損傷作用進(jìn)行比較研究，為臨床上該方防治缺血性腦血管疾病提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年健康清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量250～320 g，均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心代購(gòu)。

1.2 藥物與試劑實(shí)驗(yàn)所用藥材黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁等均由湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬一醫(yī)院提供，按《中國(guó)藥典》 （2020一部)鑒定為合格藥材。硫酸氫氯吡格雷片（75 mg/片)，由賽諾菲制藥有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 樣品的分組及提取

2.1.1 樣品的分組 補(bǔ)陽(yáng)還五湯按《方劑學(xué)》教材規(guī)定的劑量稱取。各藥用量為：黃芪120 g、當(dāng)歸尾6 g、赤芍4.5 g、地龍3 g、川芎3 g、紅花3 g、桃仁3 g，水煎液。方劑1組：各組成成分均為生品組方的補(bǔ)陽(yáng)還五湯；方劑2組：黃芪蜜炙，當(dāng)歸、赤芍、川芎、地龍均酒炙，其他藥物均為生品組方的補(bǔ)陽(yáng)還五湯；方劑3組：黃芪蜜炙，其他藥物均為生品組方的補(bǔ)陽(yáng)還五湯；方劑4組：當(dāng)歸、赤芍、川芎、地龍均酒炙，其他藥物均為生品組方的補(bǔ)陽(yáng)還五湯。

2.1.2 樣品的提取 以上各組按量稱取各藥后常溫（25℃)加蒸餾水2 000 mL浸泡30 min，煮沸后文火煎30 min過(guò)濾藥液，藥渣加1 000 mL蒸餾水再煎煮25 min，合并兩次濾液，濃縮至補(bǔ)陽(yáng)還五湯約2.0 g/mL，放入4℃冰箱備用。

2.2 腦缺血再灌注模型制備腦缺血再灌注模型制備［2］按以下方法：給藥2周后大鼠不禁水禁食12 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠（0.3 mL/100 g)，頸部正中切口，鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA)、左頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA)和左頸外動(dòng)脈（ECA)，用微血管夾將頸總動(dòng)脈在近分叉處夾閉，將直徑0.2 mm涂有硅酮的尼龍線從頸外動(dòng)脈插入至頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)端，阻斷大腦中動(dòng)脈血流，然后將微血管夾取掉，將頸外動(dòng)脈結(jié)扎，使大鼠腦缺血（判斷遠(yuǎn)端結(jié)扎無(wú)血流的方法：大鼠臉呈蒼白色，瞳孔放大，翻正反射消失，說(shuō)明產(chǎn)生前腦缺血)，留約1 cm的線頭在外側(cè)，于缺血2 h時(shí)輕提尼龍線，使其球端回至頸外動(dòng)脈內(nèi)，即可恢復(fù)大腦中動(dòng)脈（MCA)血供。假手術(shù)組ICA不插線栓，僅分離血管。以上過(guò)程均在室溫恒定（24℃～25℃)情況下進(jìn)行，以利于評(píng)價(jià)腦缺血情況。

2.3 分組與給藥將大鼠隨機(jī)分為7組，每組25只。即假手術(shù)組、模型組、氫氯吡格雷組以及不同炮制品組方的補(bǔ)陽(yáng)還五湯方劑1、2、3、4組。適應(yīng)性飼養(yǎng)各組大鼠1周后，參照動(dòng)物與人體等效換算標(biāo)準(zhǔn)換算［3］，給予相應(yīng)的藥物。方劑組按13 g·kg-1·d-1量灌胃，氫氯吡格雷組給予0.68 mg/mL氫氯吡格雷水溶液灌胃，模型組與假手術(shù)組均給予等量生理鹽水灌胃，每天2次，連續(xù)2周。

2.4 大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血行為評(píng)分法造模24 h后，參考Zea Longa的5級(jí)4分評(píng)分法評(píng)估大鼠腦神經(jīng)功能損傷，觀察大鼠四肢的活動(dòng)能力及反應(yīng)能力并進(jìn)行評(píng)分（評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)神經(jīng)病學(xué)征象記為0分，提尾時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢不能完全伸直為1分，向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分，向病灶對(duì)側(cè)跌倒為3分，無(wú)自發(fā)活動(dòng)及意識(shí)障礙為4分)，正常評(píng)分為0分，最高評(píng)分為4分。積分越高說(shuō)明動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。

2.5 血清各指標(biāo)的測(cè)定

2.5.1 ELISA法檢測(cè)血清PAF、CD62p、CD63含量 大鼠麻醉后用普通真空管腹主動(dòng)脈取血約10 mL，3 000 r/min，離心30 min，吸取上層血清，置于-80℃冰箱備測(cè)。采用酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)大鼠血清PAF、CD62p、CD63含量。操作過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

2.5.2 檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平和LDH活性 按上述方法取血清，ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平；按試劑盒方法測(cè)定血清MDA水平及LDH活性［4］，具體步驟嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書操作。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包中One-Way ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。方法以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀評(píng)分及對(duì)急性腦缺血再灌注大鼠血清PAF、CD62p、CD63含量的影響表1結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組的所有試驗(yàn)動(dòng)物均出現(xiàn)了不同程度的行為障礙，模型組血清PAF、CD62p、CD63表達(dá)顯著升高（P＜0.05)；與模型組比較，氫氯吡格雷組與不同炮制品組方的補(bǔ)陽(yáng)還五湯方劑1、2、3、4組均能顯著抑制血清PAF、CD62p、CD63表達(dá)（P＜0.05)，表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯能顯著抑制血小板活化，且各組的效果均強(qiáng)于方劑1組（P＜0.05)，其中方劑2組的效果強(qiáng)于方劑3組、方劑4組、氫氯吡格雷組（P＜0.05)，方劑3組、方劑4組、氫氯吡格雷組間無(wú)顯著差異（P＞0.05)。

表1 各組腦缺血再灌注大鼠PAF、CD62p、CD63含量及術(shù)后評(píng)分的影響（±s）

表1 各組腦缺血再灌注大鼠PAF、CD62p、CD63含量及術(shù)后評(píng)分的影響（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與方劑1組比較，##P＜0.01，#P＜0.05。

組別 n CD63（ng/mL) PAF CD62p 術(shù)后評(píng)分（分)假手術(shù)組 25 0.738±0.146 0.012±0.002 0.106±0.015 0模型組 25 1.586±0.253△ 0.215±0.012△ 0.196±0.008△ 3.26±0.48△氫氯吡格雷組 25 0.813±0.167** 0.145±0.014** 0.132±0.021** 2.74±0.51**方劑1組 25 1.316±0.154* 0.171±0.006* 0.162±0.013* 2.68±0.37*方劑2組 25 0.741±0.162**## 0.131±0.011**## 0.116±0.018**## 1.83±0.21**##方劑3組 25 0.923±0.158*# 0.155±0.006*# 0.141±0.006*# 2.43±0.43*#方劑4組 25 0.835±0.138*# 0.142±0.008*# 0.134±0.005*# 2.24±0.28*#

3.2 各組對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠血清LDH活性和MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響表2結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組的大鼠血清LDH活性和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高（P＜0.01)。與模型組比較，氫氯吡格雷組和不同炮制品組方的補(bǔ)陽(yáng)還五湯方劑1、2、3、4組均可顯著抑制大鼠血清中LDH活性和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平的升高（P＜0.05，P＜0.01)，且各組的效果均強(qiáng)于方劑1組（P＜0.05)，其中方劑2組的效果強(qiáng)于方劑3組、方劑4組、氫氯吡格雷組（P＜0.05)，方劑3組、方劑4組、氫氯吡格雷組間無(wú)顯著差異（P＜0.05)。

表2 各組對(duì)腦缺血再灌注大鼠血清LDH、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響（±s）

表2 各組對(duì)腦缺血再灌注大鼠血清LDH、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與方劑1組比較，##P＜0.01，#P＜0.05。

組別 n LDH（U/L) MDA（nmol/mL) TNF-α（ng/L) IL-1β（ng/L) IL-6（ng/L)假手術(shù)組 25 2783±274 3.61±1.14 43.4±3.8 22.6±1.3 24.5±1.3模型組 25 4672±512△ 8.76±1.32△ 49.5±4.1△ 31.5±2.2△ 29.7±1.6△氫氯吡格雷組 25 3547±604** 6.54±0.76** 45.7±3.2** 25.8±1.7** 26.3±1.2**方劑1組 25 3563±536* 7.25±1.02* 47.4±2.9* 29.3±1.5* 27.5±2.4*方劑2組 25 2935±328**## 5.37±0.87**## 43.6±2.1**## 23.1±0.8**## 25.1±1.8**##方劑3組 25 3272±457*# 6.83±0.53*# 46.1±3.4*# 27.4±2.3*# 26.8±2.1*#方劑4組 25 3161±388*# 6.57±0.91*# 45.6±2.5*# 26.1±1.6*# 26.6±1.9*#

4 討論

腦缺血后的再灌注是神經(jīng)功能恢復(fù)的基本條件，但也會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞和微血管損傷，由于腦組織急性缺血缺氧產(chǎn)生大量的自由基，與腦組織細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，釋放大量的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA、LDH及炎性因子和細(xì)胞凋亡因子［5-6］，從而使腦組織損傷進(jìn)一步加重，造成嚴(yán)重的遲發(fā)性神經(jīng)功能損害［7］。TNF-α具有增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，誘導(dǎo)細(xì)胞黏附因子表達(dá)等作用，在腦缺血早期TNF-α分泌或合成的增加是腦梗死形成的主要原因。IL-1β是一種內(nèi)源性致熱源，其表達(dá)升高可以通過(guò)刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞粘附分子，使白細(xì)胞聚集在缺血腦組織，加重腦缺血再灌注損傷程度。IL-6參與機(jī)體免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)，是急性缺血期腦損傷程度的一個(gè)標(biāo)志［8］。本研究中，模型大鼠的血清LDH活性、MDA以及NF-α、IL-1β和IL-6相關(guān)細(xì)胞因子水平均升高，表明腦缺血后誘導(dǎo)模型大鼠炎性細(xì)胞因子的分泌和表達(dá)，引起缺血后炎性反應(yīng)。不同炮制品組方的補(bǔ)陽(yáng)還五湯均可不同程度改善大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能癥狀，并顯著抑制大鼠血清LDH活性的升高，降低血清MDA和TNF-α、IL-1β、IL-6水平，且各組均優(yōu)于方劑1組（生品組)，其中黃芪蜜炙，當(dāng)歸、赤芍、川芎、地龍均酒炙組方的補(bǔ)陽(yáng)還五湯組抑制作用更顯著。

PAF和CD62p、CD63均可促進(jìn)血小板的活化和聚集，腦缺血再灌注時(shí)PAF和CD62p、CD63大量釋放，促進(jìn)血小板聚集并觸發(fā)炎性反應(yīng)，誘導(dǎo)血栓形成，加重腦缺血對(duì)神經(jīng)元造成的損傷。本研究結(jié)果顯示，不同炮制品組方的補(bǔ)陽(yáng)還五湯均可不同程度降低血清PAF和CD62p、CD63表達(dá)水平，且各組均優(yōu)于方劑1組（生品組)，其中黃芪蜜炙，當(dāng)歸、赤芍，川芎、地龍均酒炙組方的補(bǔ)陽(yáng)還五湯組降低作用更顯著。

綜合文獻(xiàn)報(bào)道及本研究，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組方中黃芪用蜜炙品，當(dāng)歸、赤芍，川芎、地龍均用酒炙品，抗腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用最顯著，這與文獻(xiàn)中記載的黃芪蜜炙可增強(qiáng)免疫功能、抗氧化、增加冠脈流量對(duì)心功能起到保護(hù)作用，當(dāng)歸、赤芍、川芎、地龍酒炙能增強(qiáng)活血通絡(luò)、溶血栓、抗炎、止痛作用是一致的，其機(jī)制與抑制血小板活化、抑制炎性因子分泌和表達(dá)及減輕腦組織炎性反應(yīng)有關(guān)。