陳榮珠，王小平，林美珍，賴(lài)鐘雄

（1. 漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，福建 漳州 363000；2. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】龍眼（Dimocarpus longanLour.）是無(wú)患子科龍眼屬的常綠喬木，主要分布于我國(guó)熱帶及亞熱帶地區(qū)，因其果肉富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及維生素，是藥食兩用的佳品，素有“北人參南桂圓”的美稱(chēng)。龍眼胚胎發(fā)育的情況關(guān)系到其果核大小、坐果率、果實(shí)品質(zhì)及產(chǎn)量，龍眼胚胎發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)和遺傳調(diào)控的研究是目前龍眼研究的熱點(diǎn)[1]。【前人研究進(jìn)展】研究表明植物體胚發(fā)生過(guò)程中基因表達(dá)的時(shí)空特異性，不僅受特異的DNA序列調(diào)控，還受表觀遺傳調(diào)控，尤其是DNA甲基化修飾[2-4]。一定程度的DNA甲基化水平有利于植物體胚的正常發(fā)育，相對(duì)于非胚性愈傷組織，較低水平的DNA甲基化水平使胚性愈傷組織有更多的基因處于活躍轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，從而保證植物胚胎發(fā)生能力的實(shí)現(xiàn)[5-6]。在水稻研究中發(fā)現(xiàn)AGO、DCL和RDR蛋白共同參與DNA甲基化，調(diào)控其體胚的發(fā)生[7]。其中Argonaute（AGO）蛋白是一類(lèi)廣泛存在于真核生物中高度保守的蛋白家族，其家族成員生物學(xué)功能多樣，如參與RNA誘導(dǎo)沉默途徑[8]，能與不同類(lèi)型的小RNA結(jié)合并對(duì)對(duì)靶基因進(jìn)行切割，在頂端分生組織干細(xì)胞的分化過(guò)程中具有維持作用，對(duì)病毒具有防御拮抗作用，參與DNA甲基化途徑[9-10]。擬南芥AGO5（AtAGO5）是水稻MEL1的同源基因，可能參與DNA甲基化和染色質(zhì)修飾，被認(rèn)為在配子發(fā)生過(guò)程中起作用[11]。水稻AGOMEL1能調(diào)節(jié)孢子體生殖細(xì)胞發(fā)育和減數(shù)分裂，MEL1功能缺失會(huì)導(dǎo)致水稻孢子母細(xì)胞在減數(shù)分裂早期發(fā)生異常，阻礙染色體凝聚，從而導(dǎo)致種子完全不育[12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前僅有少量關(guān)于AGOMEL1基因的功能研究，本課題組研究發(fā)現(xiàn)，龍眼AGO基因家族中DlAGO4、DlAGO6、DlAGO10在龍眼體胚不同發(fā)育階段中均有不同程度的表達(dá)[13-15]，但龍眼AGOMEL1的功能尚不清楚，該基因是否參與龍眼體胚發(fā)生過(guò)程的調(diào)控也未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究基于龍眼基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，從中鑒定出龍眼基因組中AGO基因家族含有10個(gè)成員[16]，借助龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)，以龍眼DlAGOMEL1為目的基因，采用RT-PCR對(duì)其CDS及5′端上游啟動(dòng)子序列進(jìn)行克隆，對(duì)該基因的亞細(xì)胞定位進(jìn)行研究，并明確其在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)模式，為后續(xù)該基因的功能研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

龍眼紅核子品種體胚發(fā)生不同階段的材料：非胚性愈傷組織（NEC）、愈傷組織（EC）、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)（IcpEC）、球形胚（GE）和子葉形胚（EC）[17]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA、DNA提取及cDNA逆轉(zhuǎn)錄 采用Tripue（Transgen，China）試劑盒對(duì)其總RNA提取，提取完的RNA濃度用核酸微量檢測(cè)儀（Thermo Fisher，USA）檢 測(cè)。分 別 用SMARTer RACE 5′/3′Kit和YEASEN反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Hifair? Ⅱ 1st Stand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR）進(jìn)行RT-PCR和qRTPCR逆轉(zhuǎn)錄。龍眼胚性愈傷組織的DNA提取采用傳統(tǒng)的CTAB法。

1.2.2 龍眼DlAGOMEL1基因CDS序列的獲取與驗(yàn)證 從龍眼基因組數(shù)據(jù)庫(kù)提取DlAGOMEL1基因的CDS序列，用在線(xiàn)軟件Primer3.0設(shè)計(jì)特異性引物（表1），引物序列委托上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。以龍眼胚性愈傷組織cDNA為模板，進(jìn)行該基因CDS序列的擴(kuò)增。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，使用GeneJET Plasmid Miniprep Kit（ThermoScientific，USA）回收目的片段。將回收產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化后并進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，最后選擇陽(yáng)性克隆子委托上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 生物信息學(xué)分析 DlAGOMEL1蛋白的生物信息學(xué)分析包括信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)、氨基酸多序列比對(duì)、分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、啟動(dòng)子順式作用元件分析，具體分析方法及網(wǎng)站參照陳榮珠論文中的分析方法[18]。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用DNAMAN6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，以EIF-4a、EF-1a和Fe-SOD為內(nèi)參基因，用Roche LightCycler 480進(jìn)行qRT- PCR[19]。使用Excel、SPSS19.0和GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析和圖像繪制。

1.2.5 融合表達(dá)載體的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位分析 首先對(duì)DlAGOMEL1的CDS序列進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶分析，用primer 5設(shè)計(jì)上下游引物，進(jìn)行帶有Eco31I酶切位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增。挑選陽(yáng)性克隆子送鉑尚生物（上海）有限公司測(cè)序，提取質(zhì)粒DNA。用Eco31I單酶切帶有酶切位點(diǎn)的DlAGOMEL1和pCAMBIA1300載體，回收純化載體片段和目的基因片段。將酶切后的目的片段和載體片段連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)T1大腸桿菌感受態(tài)，然后涂LB板（添加Kan）過(guò)夜培養(yǎng)，挑選陽(yáng)性克隆子送測(cè)，擴(kuò)繁菌液后進(jìn)行重組質(zhì)粒的提取，用Eco31I酶切pCAMBIA1300-DlAGOMEL1-35S-GFP進(jìn)行酶切驗(yàn)證。用凍融法將重組質(zhì)粒及空載體轉(zhuǎn)化EHA105農(nóng)桿菌，然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法注射侵染洋蔥內(nèi)表皮并進(jìn)行GFP熒光觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍眼DlAGOMEL1基因CDS和啟動(dòng)子的克隆及融合表達(dá)載體的構(gòu)建

以龍眼胚性愈傷組織cDNA為模板，DlAGOMEL1-CF和DlAGOMEL1-CQ為上下游引物，進(jìn)行DlAGOMEL1基因CDS的PCR擴(kuò)增，電泳圖如圖1-A所示。將測(cè)序結(jié)果與基因組序列進(jìn)行比對(duì)，序列完全一致，最后獲得該基因CDS序列全長(zhǎng)為2655bp。以龍眼胚性愈傷組織DNA為模板，以pro-AGOMEL1-F和pro-AGOMEL1-R為特異性引物，克隆獲得DlAGOMEL1基因5′端上游啟動(dòng)子序列長(zhǎng)度為1512bp（圖1-B）。

對(duì)克隆獲得的DlAGOMEL1CDS序列進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶分析，發(fā)現(xiàn)DlAGOMEL1未被Eco31I酶切割。利用Primer5.0軟件在酶切位點(diǎn)計(jì)上下游設(shè)計(jì)引物，克隆獲得帶酶切位點(diǎn)的產(chǎn)物，用Eco31I單酶切帶有酶切位點(diǎn)的DlAGOMEL1和pCAMBIA1300，最后進(jìn)行融合表達(dá)載體構(gòu)建（圖1-C）并對(duì)融合表達(dá)載體進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

圖1 龍眼DlAGOMEL1基因CDS和啟動(dòng)子序列PCR擴(kuò)增及融合表達(dá)載體的構(gòu)建Fig. 1 Electrophoretograms of CDS of DlAGOMEL1 and promoter by PCR and fusion expression vector in longan

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 DlAGOMEL1蛋白的基本性質(zhì)分析 信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，DlAGOMEL1蛋白不含有信號(hào)肽，因此是一個(gè)非分泌蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，DlAGOMEL1蛋白含有1個(gè)顯著的由內(nèi)向外跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域，位于434～452 aa，長(zhǎng)度為19個(gè)氨基酸，其值為821，因此，DlAGOMEL1蛋白的跨膜模型可能為N-末端向內(nèi)向外。磷酸化和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，DlAGOMEL1蛋白含有86個(gè)磷酸化位點(diǎn)（Ser:49，Thr:28，Tyr:9），4個(gè)糖基化位點(diǎn)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，DlAGOMEL1占比最多為無(wú)規(guī)則卷曲（44.12%），其次為α-螺旋（35.97%），β-折疊占比最少，僅為3.51%，并對(duì)該蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果一致（圖2）。利用SMART對(duì)DlAGOMEL1蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示，該蛋白含有N-末端、DUF1785、PAZ、ArgoL2、Mid和Piwi保守結(jié)構(gòu)域。

圖2 龍眼DlAGOMEL1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 2 Predicted tertiary structure of DlAGOMEL1

圖3 龍眼DlAGOMEL1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig. 3 Predicted functional domains of DlAGOMEL1

2.2.2 龍眼DlAGOMEL1基因編碼蛋白的同源性分析 將龍眼AGOMEL1基因編碼的氨基酸序列提交NCBI-blastp比對(duì)，結(jié)果表明，龍眼AGOMEL1與以下9種植物具有較高的同源性，分別為漾濞槭（Acer yangbiense）、蜜柑（Citrus unshiu）、阿月渾子（Pistacia vera）、銀白楊（Populus alba）、克萊門(mén)柚（Citrus clementina）、胡 楊（Populus euphratica）、毛 果 楊（Populus trichocarpa）、甜橙（Citrus sinensis）、藍(lán)花耬斗菜（Aquilegia coerulea）。再利用DNAMAN 6.0軟件將龍眼等以上10種植物的AGOMEL1的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果如圖4所示，顯示該基因在多種物種中高度保守。

圖4 AGOMEL1基因編碼氨基酸多序列比對(duì)Fig. 4 Multiple sequence alignment of AGOMEL1

2.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中胡楊、蘋(píng)果、甜橙、水稻、玉米等10多條AGOMEL1氨基酸序列，采用Mega5.05軟件的Neighbor-Joining構(gòu)建核苷酸序列的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（P-distance法），并用bootstrap法（重復(fù)1000 次）評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果如圖5所示，根據(jù)種屬進(jìn)化樹(shù)的關(guān)系可知，龍眼DlAGOMEL1與雙子葉植物胡楊A(yù)GOMEL1的親緣關(guān)系最近，與單子葉玉米、水稻等AGOMEL1的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖5 AGOMEL1蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig. 5 Phylogenetic analysis on DIAGOMEL1 from longan and other plants

2.2.4 龍眼DlAGOMEL1基因的啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè) 將克隆獲得的DlAGOMEL1基因的啟動(dòng)子序列提交至Plantcare在線(xiàn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，該序列除了含有多個(gè)TATA-box和CAAT-box核心啟動(dòng)子元件外，還含有響應(yīng)脫落酸的ABRE元件、大量的光響應(yīng)元件（Box 4、G-Box等）、高溫和低溫響應(yīng)元件、與分生組織表達(dá)相關(guān)的CAT-box順式作用調(diào)控元件（表2）。

表2 龍眼AGOMEL1基因啟動(dòng)子序列順式作用元件Table 2 Cis-acting elements of DlAGOMEL1 promoter

2.3 龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中DlAGOMEL1基因的表達(dá)情況

為探究DlAGOMEL1基因在龍眼體胚發(fā)生的調(diào)控作用，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)該基因在龍眼體胚發(fā)生不同階段的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖6所示。DlAGOMEL1基因在龍眼體胚發(fā)生不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量變化較大，先下降后上升，呈“V”字型，非胚性愈傷組織階段（NEC）的相對(duì)表達(dá)量較高，隨著體胚的發(fā)育，其表達(dá)水平降低，到球形胚時(shí)期最低，接著又急劇上升，在子葉胚時(shí)期（CE）其相對(duì)表達(dá)量最高，呈顯著差異。相對(duì)表達(dá)量的顯著差異表明，DlAGOMEL1在龍眼體胚發(fā)生晚期階段可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

圖6 龍眼體胚發(fā)生不同階段DlAGOMEL1的相對(duì)表達(dá)量Fig. 6 Relative expressions of DlAGOMEL1 at different somatic embryogenesis stages of longan

2.4 龍眼DlAGOMEL1基因的亞細(xì)胞定位分析

參照文獻(xiàn)[20]的方法對(duì)重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-35s-DlAGOMEL1-GFP及pCAMBIA1300-35s-GFP進(jìn)行農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化及篩選，然后將菌液注射到洋蔥內(nèi)表皮，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3 d，以注射pCAMBIA1300-35s-GFP的洋蔥內(nèi)表皮為對(duì)照，用熒光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光信號(hào)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入空載的洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，熒光分布于整個(gè)細(xì)胞，而加入DlAGOMEL1的重組載體轉(zhuǎn)入洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，熒光只分布于細(xì)胞質(zhì)中，表明該基因定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖7-A～C），可能在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮功能作用（圖7-D～F）。

圖7 pCAMBIA1300-35s-DlAGOMEL1-GFP蛋白在洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞的亞細(xì)胞定位Fig. 7 Subcellular localization of pCAMBIA1300-35s-DlAGOMEL1-GFP protein in onion

3 討論與結(jié)論

Argonaute（AGO）蛋白是一類(lèi)RNA結(jié)合蛋白，在小RNA介導(dǎo)的基因沉默中起關(guān)鍵作用，該蛋白在真核生物中高度保守，主要含有典型的保守結(jié)構(gòu)域，包括N-端、PAZ、Mid、Piwi[11]。目前，AGO蛋白家族在植物中的研究越來(lái)越多，而關(guān)于AGOMEL1的研究報(bào)道還較少，尤其未見(jiàn)在龍眼體胚中有報(bào)道。本研究以篩選鑒定出的龍眼AGO基因家族為基礎(chǔ)，克隆獲得了長(zhǎng)度為2655 bp的DlAGOMEL1基因CDS全長(zhǎng)序列，編碼884個(gè)氨基酸。同時(shí)，對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DlAGOMEL1蛋白不存在信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白，含有跨膜結(jié)構(gòu)域，富含蘇氨酸和絲氨酸的磷酸化修飾位點(diǎn)，推測(cè)該蛋白可能以蛋白磷酸化方式參與調(diào)控植物細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。龍眼AGOMEL1蛋白含有PAZ、Mid和Piwi 3個(gè)典型的保守結(jié)構(gòu)域，PAZ結(jié)構(gòu)域中含有β-桶亞結(jié)構(gòu)域，該亞結(jié)構(gòu)域可識(shí)別結(jié)合非特異單鏈核酸中3′端突出的2個(gè)堿基[21]；位于C端具有內(nèi)切酶活性的Piwi結(jié)構(gòu)域，能特異性地結(jié)合小RNA 5′-磷酸末端[11]，其含有一個(gè)保守的DDH/H motif催化三聯(lián)體中心，即D760、D845、H986和H798，因此具有切割活性，而分析發(fā)現(xiàn)AGOMEL1蛋白的Piwi結(jié)構(gòu)域中H986缺失，為DD./H，推測(cè)該蛋白可能不具有切割活性。上述結(jié)果說(shuō)明，DlAGOMEL1基因的生物學(xué)功能可能與其結(jié)構(gòu)具有密切的關(guān)系。

AGO基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆脅迫、配子體形成和發(fā)育及DNA修復(fù)中發(fā)揮著重要的功能。水稻OsAGOMEL1能與5′末端為C的 21-nt siRNA結(jié)合，調(diào)控配子減數(shù)分裂前期的細(xì)胞分裂，但MEL1與siRNAs結(jié)合對(duì)生殖細(xì)胞發(fā)育的作用機(jī)制還需深入研究[14-15]；在雄配子體的形成、成熟與傳遞過(guò)程中，MET1、DRM2、ROS1、DME和DDM1表達(dá)并一直保持到營(yíng)養(yǎng)核和精細(xì)胞分化的三核花粉期，導(dǎo)致染色質(zhì)的修飾狀態(tài)改變[22]。但是，DlAGOMEL1在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程的作用未見(jiàn)報(bào)道，本研究利用qRT-PCR檢測(cè)其相對(duì)表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中先下降后上升，且在子葉胚時(shí)期有最高的相對(duì)表達(dá)量，由此推測(cè)，DlAGOMEL1可能與龍眼體胚發(fā)生的晚期密切相關(guān)，但是該基因在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的調(diào)控作用有待進(jìn)一步深入研究。

探究蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位可進(jìn)一步系統(tǒng)性地了解該基因的生物學(xué)功能[23]。GFP作為基因表達(dá)的常見(jiàn)報(bào)告因子，其具有易檢測(cè)、高靈敏度及熒光性質(zhì)穩(wěn)定[24]等特點(diǎn)，在越來(lái)越多的物種中被用于研究蛋白的亞細(xì)胞定位。關(guān)于不同物種AGOMEL1及其同源基因AGO5的亞細(xì)胞定位已有一些研究報(bào)道，番茄SlAGO5定位于核膜中[25]；水稻OsAGOMEL1主要定位于生殖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中[11]，參與調(diào)控孢子體生殖細(xì)胞發(fā)育和減數(shù)分裂過(guò)程；在玉米中發(fā)現(xiàn)，AGOMEL1基因定位于細(xì)胞質(zhì)中，參與小孢子期花粉的形成，在生殖細(xì)胞中破壞MEL1穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致phasiRNA靶基因脫靶分裂[14]；龍眼DlAGO5主要定位在細(xì)胞核[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，龍眼DlAGOMEL1雖與DlAGO5在進(jìn)化樹(shù)處于同一分支，但其定位于洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，該基因在龍眼中的生物學(xué)功能是否與單子葉植物水稻和玉米一樣參與調(diào)控減數(shù)分裂過(guò)程有待進(jìn)一步研究。

本研究克隆獲得了龍眼DlAGOMEL1基因的CDS序列及5′端啟動(dòng)子序列，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，龍眼DlAGOMEL1蛋白含有保守結(jié)構(gòu)域PAZ、Mid和Piwi，該蛋白含有大量的磷酸化位點(diǎn)及多個(gè)糖基化位點(diǎn)，與胡楊相似度最高。相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果表明，DlAGOMEL1在龍眼子葉胚時(shí)期可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。亞細(xì)胞定位表明，龍眼DlAGOMEL1基因定位于細(xì)胞質(zhì)中。對(duì)該基因啟動(dòng)子序列順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該序列含有多個(gè)脫落酸響應(yīng)元件和大量光響應(yīng)元件及溫度響應(yīng)元件等，推測(cè)該基因的表達(dá)模式可能受外源激素、光及溫度等的影響。該研究結(jié)果為進(jìn)一步探究AGOMEL1基因在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程的作用提供了參考，也為龍眼分子育種提供了理論依據(jù)。