張世忠，陳秀琴,2，陳盛星，江 斌，高炳輝，藍(lán)豪杰，吳建耀，劉 景

[1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013；2. 福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013；3. 中鯊動物保健品（廈門）有限公司，福建 廈門 361028]

0 引言

【研究意義】單寧是一類水溶性多酚類物質(zhì)，廣泛分布于油菜、高粱和豆科植物中[1]。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，分為三大類，即水解單寧、縮合單寧和褐藻多酚[2]。單寧酸（tannic acid, TA）是單寧的次生代謝物，是水解單寧中最典型的物質(zhì)[3]。TA具有收斂抗腹瀉[4-5]、抗菌[6]、抗病毒[6]、抗寄生蟲[2]等作用，因此將TA開發(fā)作為飼料添加劑具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】TA可應(yīng)用于反芻動物和單胃動物。例如，TA可減少泡沫性瘤胃鼓氣和控制消化道寄生蟲[2]。飼糧中添加低劑量的單寧可以提高單胃動物的健康度和生長性能[7-8]。此外，TA具有改善腸道結(jié)構(gòu)的功能。有文獻(xiàn)報(bào)道，添加2.5 mg·kg-1TA可改善小鼠的空腸形態(tài)學(xué)，促進(jìn)緊密連接蛋白ZO-1基因的表達(dá)[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)、提取來源和添加濃度均會導(dǎo)致TA應(yīng)用效果的差異[10]。此外，TA能夠與蛋白質(zhì)、淀粉、礦物質(zhì)和消化酶結(jié)合，通常被認(rèn)為是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子[11]，其在畜禽上的應(yīng)用存在爭議。關(guān)于TA對肉雞的生長性能、屠宰性能和腸道菌群的影響有待深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)旨在研究飼糧中添加TA對肉雞的生長性能、屠宰性能和腸道菌群的影響，為TA在家禽生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

TA由中鯊動物保健品（廈門）有限公司提供，由五倍子水解TA提純至鞣酸含量98%，再將98%的TA添加沸石粉稀釋至TA含量50%。

1.2 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1日齡白羽肉雞（公）購于福建圣農(nóng)集團(tuán)有限公司。試驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì)，將384只1日齡健康且體重相近的肉雞隨機(jī)分成4個(gè)組，每組12個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8只。空白對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加100、150、200 mg·kg-1的TA。試驗(yàn)期為42 d。

1.3 基礎(chǔ)飼糧及飼養(yǎng)管理

采用玉米-豆粕型粉狀飼糧，參照NRC（1994）和NY/T 33-2004肉仔雞營養(yǎng)需求配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)試驗(yàn)基地開展。試驗(yàn)雞采用籠養(yǎng)模式（95 cm×60 cm×65 cm）。入雛前一天將雞舍溫度升高至32～35 ℃，隨后溫度每周降低2～3 ℃，直至降至23～25 ℃為止。光照、通風(fēng)和免疫程序等其他管理措施按照白羽肉雞生產(chǎn)管理手冊執(zhí)行。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet used in trial (on air-dry basis) %

1.4 指標(biāo)測定與方法

1.4.1 生長性能測定 試驗(yàn)第3和6周，禁食10 h后，以重復(fù)為單位稱量雞只重量，統(tǒng)計(jì)耗料量，計(jì)算肉雞不同生長階段的平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）、料重比（F/G）。

1.4.2 屠宰性能 試驗(yàn)第42 d，肉雞禁食12 h后，各組每個(gè)重復(fù)選取接近平均體重的4只雞，稱重后頸靜脈放血致死，按照相關(guān)手冊進(jìn)行屠宰測定，計(jì)算屠宰率、全凈膛率、胸肌率和腿肌率。

1.4.3 盲腸微生物多樣性分析 試驗(yàn)第42 d，每個(gè)重復(fù)選取接近平均體重的4只雞進(jìn)行屠宰，將盲腸內(nèi)容物擠壓至無菌離心管中。液氮速凍后運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，置-70 ℃冰箱保存。

采 用E.Z.N.A.?soil DNA Kit（Omega Bio-tek,Norcross, GA, U.S.）提取盲腸內(nèi)容物中的微生物基因組DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。對擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因的高度可變的V3-V4區(qū)進(jìn)行測序。引物分別為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。反應(yīng)體系：20 μL mixture containing，4 μL 5 × FastPfu Buffer，2 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1），上下游引物各0.8 μL（5 μmol·L-1），0.4 μL FastPfu Polymerase，1 μL模板DNA，雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 45 s，共27個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后，通過Illumina Mi Seq PE 300平臺進(jìn)行高通量測序，測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

分別使用FLASH軟件和Trimmonmatic軟件對每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，隨后用UCHIME軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到有效的數(shù)據(jù)用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。測序片段在97%相似度的，再用QIIME軟件進(jìn)行聚類、劃分操作分類單元（operational taxonomic units, OTU），利用Silva分類學(xué)數(shù)據(jù)庫得到每個(gè)OTU的分類學(xué)信息?；谝陨辖Y(jié)果，再進(jìn)行其他分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），組間采用Duncan's法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 TA對肉雞生長性能的影響

由表2可知，飼糧中添加200 mg·kg-1TA的末重顯著大于其他各組（P＜0.05）。1～3周齡，與對照組相比，各試驗(yàn)組的ADG、ADFI和F/G差異均不顯著（P＞0.05）。4～6周齡，與對照組相比，添加200 mg·kg-1TA的組別的ADFI顯著大于對照組（P＜0.05）；與對照組相比，添加200 mg·kg-1TA的組別的F/G顯著低于對照組（P＜0.05）；各組間ADG差異均不顯著（P＞0.05）。1～6周齡，與對照組相比，添加200 mg·kg-1TA的ADFI顯著高于對照組（P＜0.05），各組間的ADG和F/G差異均不顯著（P＞0.05）；隨著TA添加量的增加（100～200 mg·kg-1），ADFI呈現(xiàn)上升的趨勢，F(xiàn)/G呈現(xiàn)下降的趨勢?？梢?，飼糧中添加200 mg·kg-1的TA可顯著提高肉雞的生產(chǎn)性能。

表2 TA對白羽肉雞生長性能的影響Table 2 Effect of feeding TA-containing diets on growth of broilers

2.2 TA對肉雞屠宰性能的影響

由表3可知，與對照組相比，各試驗(yàn)組肉雞的屠宰重、屠宰率、全凈膛率和胸肌率差異均不顯著（P＞0.05）；飼糧中添加150 mg·kg-1TA的腿肌率顯著高于其他各組（P＜0.05），其他各組間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 TA對肉雞屠宰性能的影響Table 3 Effect of dietary TA supplement on slaughter performance of broilers

2.3 TA對肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 Alpha多樣性分析 由表4可知，各樣品的覆蓋度指數(shù)均大于0.999，說明該測序結(jié)果已經(jīng)基本覆蓋樣本的多樣性。與對照組相比，各試驗(yàn)組肉雞的ACE指數(shù)、Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）。表明，在基礎(chǔ)飼糧中添加TA對肉雞的盲腸微生物的Alpha多樣性無顯著影響。

表4 TA對肉雞腸道微生物Alpha多樣性指數(shù)的影響Table 4 Effect of dietary TA supplement on α diversity of enteric microbiota in broilers

2.3.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)組成 在門分類水平上，4個(gè)組的腸道菌群均主要由擬桿菌門Bacteroidetes、厚壁菌門Firmicutes、放線菌門Actinobacteria和軟壁菌門Tenericutes組成，其中擬桿菌門的相對豐度最高，擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度總和達(dá)到90%以上（圖1）。在科分類水平上，4個(gè)組的腸道菌群主要由理研菌 科Rikenellaceae、Barnesiellaceae、疣 微 菌科Ruminococcaceae、毛螺菌科Lachnospiraceae、乳桿菌科Lactobacillaceae、梭菌科Clostridiales_vadinBB60_group和擬桿菌科Bacteroidaceae組成（圖2）。

圖1 肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)在門分類水平上的組成Fig. 1 Composition of enteric microbiota in broilers at phylum level

圖2 肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)在科分類水平上的組成Fig. 2 Composition of enteric microbiota in broilers at family level

在屬分類水平上，4個(gè)組的腸道菌群主要由理研菌屬Alistipes、Barnesiella、疣微菌屬Ruminococcaceae_UCG014、瘤胃球菌屬Ruminococcus1_torques_group、乳酸菌屬Lactobacillus、梭菌屬norank_f_Clostridiales_vadinBB60_group、理研菌科中未分類的屬unclassified-1-Rikenellaceae和糞桿菌屬Faecalibacterium組成（圖3）。

圖3 肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)在屬分類水平上的組成Fig. 3 Composition of enteric microbiota in broilers at genus level

2.3.3 差異物種分析 LefSe用于尋找組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的物種。由圖4可知，經(jīng)LefSe分析，在科分類水平上，飼糧中添加150 mg·kg-1的TA可顯著提高Family_XIII的相對豐度。添加200 mg·kg-1TA的組別在綱、目、科、屬的分類水平上都發(fā)現(xiàn)了差異顯著的腸道菌群，其中，科和屬的分類水平的腸道菌群中，乳桿菌科Lactobacillaceae和乳桿菌屬Lactobacillus的相對豐度顯著升高。

圖4 LEfSe分析差異物種Fig. 4 LEfSe analysis on different microbes

3 討論與結(jié)論

生長性能是反映動物營養(yǎng)狀態(tài)的重要指標(biāo)。TA對肉雞生長性能的影響存在爭議。有研究報(bào)道，基礎(chǔ)飼糧中添加5 g·kg-1的水解TA可提高肉雞的生長性能[8]?；A(chǔ)飼糧中添加5%或10%的葡萄渣（主要含縮合TA和酚類化合物）對1～21日齡肉雞的生長性能無顯著影響[12]。而基礎(chǔ)飼糧中添加10 g·kg-1的水解TA則降低肉雞的增重和料肉比[13]。有研究表明，添加一定劑量的TA可提高肉雞的生長性能，但是過高劑量的TA反而會抑制生長。這可能是由于適量的TA與腸道細(xì)胞壁結(jié)合形成保護(hù)層，從而阻斷細(xì)菌與腸道受體結(jié)合，改善腸道微生態(tài)內(nèi)環(huán)境，提高蛋白酶活性，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[14]；或者通過影響腸道菌群的組成進(jìn)而提高動物的代謝水平[15]；還有可能通過改善動物的腸道組織形態(tài)，促進(jìn)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[16]。但是飼糧中添加過高劑量的TA則變?yōu)榭範(fàn)I養(yǎng)因子，抑制動物生長[4]。在本試驗(yàn)前期階段（1～3周），基礎(chǔ)飼糧中添加TA對生長性能無顯著影響；在后期階段（4～6周），飼糧中添加200 mg·kg-1的TA可顯著提高日采食量、降低料肉比；在整個(gè)試驗(yàn)階段，飼糧中添加TA呈現(xiàn)提高肉雞體重的趨勢，添加200 mg·kg-1的TA可顯著提高肉雞的日采食量，且呈現(xiàn)降低料肉比的趨勢。由表2可知，基礎(chǔ)飼糧中添加200 mg·kg-1的TA可促進(jìn)肉雞生長。

屠宰性能是衡量胴體品質(zhì)的重要指標(biāo)，其中屠宰率和全凈膛率是反映屠宰性能的兩個(gè)重要指標(biāo)。畜禽的日齡、環(huán)境、營養(yǎng)組成和飼喂方式等因素均可影響屠宰性能[16]。在本試驗(yàn)中，基礎(chǔ)飼糧中添加TA對肉雞屠宰率、全凈膛率和胸肌率無顯著影響，添加150 mg·kg-1的TA能顯著提高腿肌率。由表3可知，飼糧中添加150 mg·kg-1的TA可促進(jìn)養(yǎng)分在肉雞腿部沉積。

動物的生長與腸道內(nèi)的微生物菌群密不可分。動物的腸道中寄居著數(shù)以萬計(jì)的微生物，包括細(xì)菌、古生菌、病毒、真菌，其中大部分是細(xì)菌。這些微生物與宿主共同進(jìn)化，形成互惠共利的關(guān)系[17]。正常的腸道菌群具有多種生理作用，例如，生理營養(yǎng)作用，免疫調(diào)節(jié)作用，拮抗作用，參與代謝等[17]。

Alpha多樣性用于反映樣品間物種的豐富度和多樣性，衡量的指標(biāo)包括ACE指數(shù)、Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)等。ACE指數(shù)和Chao 1指數(shù)反映物種的豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映物種的多樣性[18]。在本試驗(yàn)中，各組間Alpha多樣性的四個(gè)指標(biāo)差異均不顯著，表明TA促進(jìn)白羽肉雞生長并非通過提高腸道菌群的Alpha多樣性而實(shí)現(xiàn)的。

動物的腸道菌群具有相對穩(wěn)定性。有文獻(xiàn)報(bào)道，愛拔益加（AA）父母代肉種雞的腸道菌群中86%以上是由擬桿菌門和厚壁菌門組成，約7%由梭桿菌門和變形菌門組成[19]。蛋雞盲腸菌群的優(yōu)勢菌群為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門[18]。在本試驗(yàn)中，各組的腸道菌群在門水平上均主要由擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和軟壁菌門組成，表明基礎(chǔ)飼糧中添加100～200 mg·kg-1的TA在門水平上不會影響腸道菌群的組成。此外，本試驗(yàn)中白羽肉雞的腸道菌群組成與愛拔益加種雞和蛋雞的腸道菌群組成略有不同，這可能是由于品種、飼料和環(huán)境不同導(dǎo)致的[20]。不同類型的菌群對宿主的作用也不一樣。例如，擬桿菌門具有維持腸道微生態(tài)平衡的作用[18]，而厚壁菌門可促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[21]。LefSe是一種用于尋找不同組間差異顯著物種的分析方法。采用該分析方法，結(jié)果表明，基礎(chǔ)飼糧中添加200 mg·kg-1的TA可使肉雞腸道中的乳酸桿菌科和乳酸桿菌屬的相對豐度顯著升高。有文獻(xiàn)也報(bào)道，在仔豬飼糧中添加TA可促進(jìn)空腸中乳酸桿菌增殖[22]，本研究與前人的研究結(jié)果一致。乳酸桿菌屬是人類和動物腸道重要的生理性菌群之一，具有維持腸道菌群平衡的作用，腸道中的乳酸菌可能通過阻止大腸桿菌的腸受肽和分泌有毒代謝物來抑制大腸桿菌和空腸彎曲桿菌在腸道的定植[23]。因此飼糧中添加適量的TA可促進(jìn)腸道益生菌的定植。

本試驗(yàn)研究表明，飼糧中添加適量TA可促進(jìn)肉雞采食，提高生長性能和腿肌率；添加100～200 mg·kg-1的TA對肉雞的盲腸菌群多樣性無顯著影響，添加200 mg·kg-1的TA可促進(jìn)肉雞腸道中乳酸桿菌屬的生長。