魏佳樂，劉鑫奕，陸紹永，蘆雪峰，張 健#

1.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)與生物信息學(xué)中心，上海 200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞分化與凋亡教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200025；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院輔助生殖科，上海 200011

目前，不孕癥的醫(yī)學(xué)定義為有1年以上未采取任何避孕措施的正常性生活而不能成功妊娠［1］，其根據(jù)發(fā)病因素可分為男性不育和女性不孕。許多疾病都可以導(dǎo)致不孕不育，例如低促性腺素性功能減退癥、早發(fā)性卵巢功能不全、無精子癥、子宮內(nèi)膜異位等［2］。盡管不孕癥的治療是研究熱點(diǎn)和亟待解決的問題，但在分子層面研究其致病機(jī)制仍是新興領(lǐng)域，許多不孕癥的發(fā)病原因并不清楚［3］。為了促進(jìn)系統(tǒng)研究，我們率先建立了不孕癥疾病數(shù)據(jù)庫（Infertility Disease Database，IDDB）的大數(shù)據(jù)平臺。這是一個(gè)不孕癥相關(guān)遺傳致病因素的數(shù)據(jù)庫［4］，但蘊(yùn)藏在大數(shù)據(jù)中的基因規(guī)律及致病因素仍有待挖掘。本研究擬在搜集的大數(shù)據(jù)病例致病基因突變的頻數(shù)層面，初步探索不孕癥患者的基因突變特點(diǎn)。

不孕癥是多因素控制的復(fù)雜疾病，解剖學(xué)上表現(xiàn)的缺陷、精卵發(fā)生的功能障礙、內(nèi)分泌失調(diào)、免疫疾病等都是造成不孕癥的關(guān)鍵因素［5］。其中，內(nèi)分泌系統(tǒng)至關(guān)重要，在生殖、生育過程中，它不僅調(diào)控精子形成與睪丸功能，還與正常的卵泡發(fā)育和排出有密切關(guān)系［5-6］。有研究指出，類固醇在人類生殖系統(tǒng)復(fù)雜的功能中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，對男性和女性的生育都有重要影響［7］。當(dāng)然，雄激素和雌激素這些關(guān)鍵的生殖激素也包括在類固醇激素中，主要在性腺中合成。類固醇激素相關(guān)的疾病，例如先天性腎上腺增生癥，主要是由于合成所必需的酶存在缺陷致使皮質(zhì)激素合成不正常，在影響生育的遺傳性腎上腺類固醇紊亂疾病中是最常見的［8］。類固醇激素體內(nèi)生成過程主要在腎上腺、性腺以及胎盤進(jìn)行［9］，其中許多相關(guān)基因的突變會導(dǎo)致不孕癥。在此之前，相關(guān)研究主要針對單一癥狀的個(gè)別致病基因進(jìn)行不孕癥研究；而本研究基于IDDB大數(shù)據(jù)系統(tǒng)分析人類不孕癥致病基因，揭示重要的蛋白類別及通路。此外，小鼠中導(dǎo)致不孕癥的同源基因?qū)θ祟愐簿哂兄匾膯⑹咀饔茫?0］，因此，本研究計(jì)劃以小鼠為切入點(diǎn)評估新的潛在致病基因。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)及分析工具

人類不孕癥大數(shù)據(jù)來源于IDDB，不孕癥基因的蛋白分類映射采用UniProt數(shù)據(jù)庫中的Keyword本體系統(tǒng)（https：//www.uniprot.org）［11］，功能和通路分析使用生物信 息 注 釋 分 析 庫 （the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）（https：//david.ncifcrf.gov/）［12］和 京 都 基 因 與 基 因 組 百 科 全 書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）（https：//www.kegg.jp/）［13］，小鼠的同源基因及不孕癥信息 來 自MGI數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.informatics.jax.org/）［14］，基因互作分析使用蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫（Search Tool for Recurring Instances of Neighbouring Genes，STRING）（https：//string-db.org/）［15］及Cytoscape工具［16］，數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)繪圖使用Python及OmicShare Tools工具（https：//www.omicshare.com/tools）。

1.2 分析方法

1.2.1 致病基因的分類統(tǒng)計(jì) 在IDDB中獲取307個(gè)致病基因，它們均為由文獻(xiàn)證實(shí)的不孕癥致病基因，而經(jīng)高通量測序或者大樣本統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到的基因不納入其中。使用UniProt數(shù)據(jù)庫的Keywords本體系統(tǒng)對307個(gè)基因進(jìn)行蛋白分類，并統(tǒng)計(jì)每類基因具有PDB三維結(jié)構(gòu)格式文件的數(shù)目［17］。

1.2.2 致病基因的突變頻數(shù)統(tǒng)計(jì) 分析IDDB中2 245條不孕癥患者臨床樣本突變數(shù)據(jù)。對每類基因，計(jì)算樣本中出現(xiàn)的總突變頻數(shù)，并統(tǒng)計(jì)其中已具有PDB三維結(jié)構(gòu)的基因所出現(xiàn)的突變頻數(shù)。

1.2.3 氧化還原酶通路分析 將11個(gè)人類不孕癥相關(guān)氧化還原酶映射至KEGG通路［13］。使用Omicshare Tools進(jìn)行富集分析及圖片繪制，按照格式要求輸入氧化還原酶基因，選用人類的背景基因，對應(yīng)合適的版本進(jìn)行提交。1.2.4 涉及內(nèi)分泌系統(tǒng)的致病基因的聚類分析 基于IDDB人類不孕不育致病基因KEGG富集分析，對34個(gè)與內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)的基因在DAVID網(wǎng)站進(jìn)行聚類分析。提交標(biāo)準(zhǔn)基因名，基因背景設(shè)置為“人類”，設(shè)置高置信度，選取打分最高的基因聚類簇。

1.2.5 人類類固醇激素生成通路的基因及小鼠同源基因信息獲取 在KEGG網(wǎng)站獲得類固醇激素生成通路（通路ID：map00140）涉及的所有基因，保留通用通路中屬于人類的通路相關(guān)基因，在MGI數(shù)據(jù)庫中查找對應(yīng)的小鼠同源基因及其突變與生殖系統(tǒng)的相關(guān)情況。構(gòu)建人類與小鼠同源基因列表，其中已知的人類致病基因直接標(biāo)注，直接影響小鼠生殖而于人類尚未確定或發(fā)現(xiàn)的基因也進(jìn)行標(biāo)注，作為潛在基因。

1.2.6 通路及基因互作分析 通過查閱文獻(xiàn)獲得在此通路中與不孕不育相關(guān)的關(guān)鍵分子，并通過KEGG分析對應(yīng)分子的合成路徑。分析聚集于此通路的已知的8個(gè)人類不孕不育致病基因，通過使用KEGG Mapper工具映射在合成路徑里，結(jié)合類固醇激素合成的文獻(xiàn)［18］繪制通路圖，尋找規(guī)律，對小鼠致病的潛在基因進(jìn)行評估。同時(shí)，借助STRING對此通路已知不孕不育致病及潛在基因進(jìn)行相互作用分析，采用高置信度，互作結(jié)果經(jīng)過Cytoscape基于結(jié)合分?jǐn)?shù)的Prefuse Force Directed Layout的加工，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)尋找已知基因的互作規(guī)律，最終在潛在基因里篩選出最可能引起人類不孕不育的基因。

2 結(jié)果

2.1 人類不孕癥致病基因的分類總覽及突變頻數(shù)統(tǒng)計(jì)

獲得的307個(gè)基因，除外Others類149個(gè)無法歸類的基因，其余基因分為13類。Lyase與Initiation Factor類的所有基因都有PDB文件解析。氧化還原酶類基因解析率次高（圖1A），此類基因涉及的所有致病突變頻數(shù)最高（圖1B），達(dá)到450個(gè)。氧化還原酶類只有11個(gè)基因，基因個(gè)數(shù)少，平均突變頻數(shù)最高，突變頻率最高；說明根據(jù)IDDB搜集的已有數(shù)據(jù)來看，氧化還原酶類基因是不孕癥最常見的突變基因類型，不孕癥可能最易涉及此類基因的突變。

圖1 人類不孕癥基因的分類及突變頻數(shù)統(tǒng)計(jì)Fig 1 Classification and statistics of mutation frequency for infertility-causative genes in human

2.2 氧化還原酶類基因的聚集通路及與內(nèi)分泌系統(tǒng)的相關(guān)性

對致病的氧化還原酶類基因（CYP21A2、CYP17A1、POR、HSD3B2、CYP11B1、CYP19A1、SRD5A2、CYP11A1、HSD17B3、ALOX15、HSD17B4）通路映射的結(jié)果顯示：聚集通路中類固醇激素合成的顯著性最高，基因主要集中于此通路，包括8個(gè)基因（圖2A）。此類基因的KEGG分級通路數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，其基本屬于脂質(zhì)代謝通路，通過脂質(zhì)代謝影響生育，而過半的基因又與內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)（圖2B）。男女共致病基因與內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)，將涉及內(nèi)分泌系統(tǒng)的34個(gè)已知基因聚類分析［4］，顯著性最高的通路為類固醇激素生成（圖2C）；說明涉及的內(nèi)分泌基因與合成類固醇激素緊密相關(guān)，主要通過此途徑的基因突變致病。

圖2 氧化還原酶類基因的KEGG通路富集分析及與內(nèi)分泌系統(tǒng)的關(guān)系Fig 2 Oxidoreductase genes of KEGG pathway enrichment analysis and its correlation with endocrine system

2.3 類固醇激素生成通路中同源小鼠不孕癥的潛在基因評估

分析人類類固醇激素生成通路，發(fā)現(xiàn)的其中與不孕不育相關(guān)的關(guān)鍵分子有睪酮、雌二醇、孕酮、皮質(zhì)醇等；其中已知致病基因基本落在關(guān)鍵分子的合成主途徑上（圖3A），大多為限速酶，SRD5A2負(fù)責(zé)5α-雙氫睪酮（5α-dihydro-testosterone，DHT）合成。6個(gè)潛在基因（表1）中，只有Akr1c18的人類同源基因AKR1C3（醛酮還原酶家族1成員C3，aldo-keto reductase family 1 member C3）落在雌激素與雄激素相互轉(zhuǎn)化的主路徑上（圖3A），缺失催化反應(yīng)中輔因子結(jié)合位點(diǎn)的Akr1c18小鼠模型，其發(fā)情周期、懷孕期明顯延長，存活幼崽數(shù)顯著減少［19］。缺失Akr1c18部分活性位點(diǎn)的小鼠，孕酮水平持續(xù)較高，造成妊娠延遲，胎鼠死亡［20］。因此，Akr1c18基因突變的小鼠會產(chǎn)生長妊娠期、分娩失敗等生殖問題。同時(shí)，Akr1c18的同源基因AKR1C3的基因互作分析顯示：已知的不孕癥基因相互結(jié)合、相互連接，致病基因具有聚集的趨勢；而AKR1C3符合這一特點(diǎn)，也與這些已知基因相互結(jié)合（圖3B）。因此，AKR1C3被評估為在類固醇激素生成通路借助小鼠發(fā)現(xiàn)的潛在基因中最有可能導(dǎo)致人類不孕不育的基因。

圖3 已知不孕癥基因在類固醇激素生成通路及互作分析中的規(guī)律Fig 3 Regularity of known infertility genes in steroid hormone biosynthesis and interaction analysis

表1 類固醇激素生成通路中人類與小鼠同源基因致病情況Tab 1 Pathogenicity for human and mouse orthology genes in the pathway of steroid hormone biosynthesis

Continued Tab

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在文獻(xiàn)報(bào)道的不孕癥臨床病例基因檢測中，氧化還原酶類基因的突變最廣泛且最頻繁，此類基因主要涉及與內(nèi)分泌相關(guān)的類固醇激素生成途徑。該途徑受到促腎上腺皮質(zhì)激素（adreno-cortico-tropichormone，ACTH）刺激，從膽固醇開始，通過細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）和羥基類固醇脫氫酶這2類氧化還原酶的脫氫、羥化等作用，逐步生成生殖所需要的激素，激素結(jié)合細(xì)胞激素受體調(diào)控生理活動。研究［21］結(jié)果顯示，先天性腎上腺增生癥是此途徑導(dǎo)致不孕癥的重要疾病，絕大多數(shù)的先天性腎上腺增生癥由21-羥化酶缺乏引起，不僅表現(xiàn)激素水平異常，還可出現(xiàn)生殖器官異常。

這些氧化還原酶基因聚集的通路，被StAR（steroidogenic acute regulatory protein）這一關(guān)鍵蛋白快調(diào)節(jié)，這一調(diào)節(jié)蛋白激活時(shí)可以將大量的膽固醇分子從線粒體外膜轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜［22］。而類固醇產(chǎn)生還需要其他因子的輔助，包括轉(zhuǎn)錄因子，如GATA結(jié)合蛋白4（GATA binding protein 4，GATA4）、類 固 醇 生 成 因 子-1（steroidogenic factor-1，SF-1）［9］，這些基因也都屬于不孕癥的致病基因。在分類的氧化還原酶基因中，有3個(gè)不屬于此通路，分別為POR、ALOX15和HSD17B4；其中POR是所有Ⅱ型細(xì)胞色素的關(guān)鍵電子供體，其突變會嚴(yán)重影響CYP17A1、CYP21A2和CYP19A1的活性，進(jìn)而影響類固醇生成。

人類不孕癥有許多尚未明確的發(fā)病原因，遺傳因素有重要影響［5］。然而，在導(dǎo)致男性不育的因素中，已知的遺傳因素只占15%～30%［23］；導(dǎo)致女性不孕的因素更加復(fù)雜，一般表現(xiàn)為多基因致?。?4］。因此，發(fā)現(xiàn)新的致病基因并明確其作用機(jī)制，對于了解生殖系統(tǒng)的功能及調(diào)節(jié)機(jī)制至關(guān)重要。我們試圖依靠重要的模式動物小鼠找出這樣的基因。許多文獻(xiàn)未發(fā)現(xiàn)小鼠的不孕癥基因在人類機(jī)體中也存在突變［3］，因此需要對這些潛在基因進(jìn)行評估。經(jīng)過評估，本研究發(fā)現(xiàn)AKR1C3最有可能導(dǎo)致不孕癥，而其在子宮內(nèi)膜細(xì)胞的表達(dá)對于組織功能障礙發(fā)生有重要作用［25］，可能與子宮內(nèi)膜異位相關(guān)。在子宮內(nèi)膜癌中，存在AKR1C3mRNA或蛋白表達(dá)異常［26］。有研究［27］顯示，在女性中，AKR1C3與患多囊卵巢綜合征的風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性。于男性而言，AKR1C3可能不僅在與隱睪相關(guān)的睪丸下降中發(fā)揮作用，而且與生殖器官的整體男性化也有關(guān)系［28］。AKR1C3作為將體內(nèi)雄烯二酮與睪酮相互轉(zhuǎn)化的重要酶，有很多不同的功能，包括前列腺素、雄激素和雌激素的產(chǎn)生以及調(diào)控。AKR1C3異常表達(dá)與前列腺癌和乳腺癌有關(guān)，卵巢功能障礙和雄激素過多癥也與其相關(guān)聯(lián)［29］。另外，AKR1C3還與一種分娩激素的產(chǎn)生有關(guān)［30］?？偟膩砜?，AKR1C3與不孕癥的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系，但AKR1C3的具體致病機(jī)制，還需要深入探索。

參·考·文·獻(xiàn)

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