何傳錦，張榮芳，鄒磊，鄭冰潔，宋丹璐，黃景峰，蘭江維

1.蚌埠市公安局，安徽 蚌埠 233040；2.寧波海爾施基因科技有限公司，浙江 寧波 315040；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061；4.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510515

Y 染色體的非重組區(qū)呈嚴(yán)格的父系遺傳，故在同一個(gè)父系家族中，其男性個(gè)體擁有完全相同的Y 染色體單倍型（除突變外）。由于父系遺傳的特性，在一些特定案例中，如與男性有關(guān)的性犯罪、家系排查及父系親緣關(guān)系鑒定實(shí)踐中，Y 染色體短串聯(lián)重復(fù)（YSTR）遺傳標(biāo)記分析具有重要作用。同時(shí)，Y-STR 重組率低、對(duì)遺傳漂變敏感，其等位基因多態(tài)性的分布具有明顯的群體差異，可為法醫(yī)遺傳學(xué)研究提供特有的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，并可用于家族起源、人類(lèi)進(jìn)化、遷徙等群體遺傳學(xué)研究[1-3]。

本研究選取安徽蚌埠地區(qū)漢族人群的41 個(gè)YSTR 基因座進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究，并探討其與16 個(gè)群體間的遺傳結(jié)構(gòu)和群體遺傳學(xué)關(guān)系，為在法醫(yī)遺傳學(xué)方面的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

采集安徽蚌埠345 例健康無(wú)關(guān)的漢族志愿者的外周血樣本，血液保存在FTA 血卡上。在采樣之前，對(duì)每位志愿者進(jìn)行充分的告知，并獲取了每位志愿者親筆簽署的書(shū)面知情同意書(shū)。所有志愿者均聲稱(chēng)其本人為漢族并且其家族在當(dāng)?shù)鼐幼×酥辽偃?。本研究得到了南方醫(yī)科大學(xué)和西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（審批號(hào)：XJTULAC201）。

1.2 PCR-STR 擴(kuò) 增 和Y-STR 分 型

按照SureID?PathFinder Plus 試劑盒（寧波海爾施基因科技有限公司）說(shuō)明書(shū)，對(duì)前述血樣直接進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。在9700 型PCR 儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）上進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10 μL，其中PCR Master Mix 5 μL、Primer Mix 2.5 μL、一片直徑約為1.2 mm的血斑，最后加純水補(bǔ)足10 μL。熱循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，70 ℃30 s，共29 個(gè)循環(huán)；60 ℃15min；4 ℃保溫。取1 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物與0.5 μL內(nèi)標(biāo)SIZE-580和8.5 μL HIDI 甲酰胺混合（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），95 ℃變性3 min 后，迅速放置于冰上冷卻3 min，使用3500xL 基因分析儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型檢測(cè)，GeneMapper?ID-X軟件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）進(jìn)行分型。每批次的檢測(cè)均采用DNA 9948（寧波海爾施基因科技有限公司，5 ng/μL）和去離子水分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)直接計(jì)數(shù)法計(jì)算等位基因和單倍型頻率。基因多態(tài)性（gene diversity，GD）、單倍型多樣性（haplotype diversity，HD）、單倍型匹配概率（haplotype match probability，HMP）和分辨能力（discriminative capacity，DC）均按照既往文獻(xiàn)[4]報(bào)道的公式進(jìn)行計(jì)算。

為了評(píng)估不同Y-STR 基因座分型系統(tǒng)在蚌埠漢族中的法醫(yī)學(xué)效能，本研究進(jìn)一步對(duì)最小單倍型、常用的Y-STR 分型系統(tǒng)［AmpF?STRTMYfiler’ PCR 擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)Applied Biosystems 公司）、YfilerTMPlus PCR 擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、PowerPlex Y 試劑盒和PowerPlex Y23 試劑盒］、AmpF?STRTMYfilerTMPCR 擴(kuò)增試劑盒中的YSTR位點(diǎn)+快速突變Y-STR（DYF387S1、DYS518、DYS449、DYS576、DYS570、DYS627和DYF404S1）、AmpF?STRTMYfilerTMPCR 擴(kuò)增試劑盒中的Y-STR 位點(diǎn)+多拷貝Y-STR（DYF387S1、DYS527、DYF404S1）等多種Y-STR 基因座組合進(jìn)行HD 計(jì)算。

為了研究蚌埠地區(qū)漢族和中國(guó)其他民族之間的群體遺傳學(xué)關(guān)系，通過(guò)YHRD 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得貴州布依族[5]、湖南侗族[6-7]、廣東漢族[8-9]、貴州漢族[10-11]、江蘇漢族[12-13]、江西漢族（登錄號(hào)YA004080、YA004388、YA004570）、上海漢族[14-15]、廣西玉林漢族（登錄號(hào)YA004624）、新疆蒙古族（登錄號(hào)YA004579）、北川地區(qū)羌族（登錄號(hào)YA004633）、青海撒拉族（登錄號(hào)YA003302）、四川阿壩地區(qū)藏族（登錄號(hào)YA004616）、四川藏族[16]、湖南土家族[6]、湖南瑤族[6]、貴陽(yáng)地區(qū)彝族（登錄號(hào)YA004594）共16 個(gè)群體的Y-STR 基因座單倍型分布數(shù)據(jù)作為比對(duì)數(shù)據(jù)。利用YHRD 網(wǎng)站上的“AMOVA&MDS 工具”進(jìn)行分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）和多維尺度分析（multidimensional scaling，MDS）并計(jì)算群體間遺傳距離Rst及其P值，使用MEGA6.0 軟件（https://www.megasoftware.net/）采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建蚌埠地區(qū)漢族與16 個(gè)比對(duì)群體的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 41 個(gè)Y-STR 基因座遺傳多態(tài)性

345 例個(gè)體樣本中共檢出343 種單倍型，其中唯一單倍型共341 種，占總單倍型數(shù)的99.42%，HD 值為0.999 966 3。41 個(gè)Y-STR 基因座上共觀察到386 個(gè)等位基因，其中DYS385a/b、DYF387S1、DYS527、DYF404S1為多拷貝基因座（附表1），分別檢出50、39、34、25 種基因型，其余均為單拷貝基因座，各基因座分別檢出4～15 個(gè)等位基因，等位基因頻率分布在0.002 9～0.933 3，GD 值分布在0.126 7（DYS645）～0.963 8（DYS385a/b），詳見(jiàn)表1。

表1 蚌埠地區(qū)漢族人群41 個(gè)Y-STR 基因座的基因多態(tài)性Tab.1 Genetic diversities of 41 Y-STR in Bengbu Han population（n=345）

本研究計(jì)算得到了最小單倍型、AmpF?STRTMYfilerTMPCR 擴(kuò)增試劑盒、YfilerTMPlus PCR 擴(kuò)增試劑盒、PowerPlex Y、PowerPlex Y23、AmpF?STRTMYfilerTMPCR 擴(kuò)增試劑盒+快速突變Y-STR、AmpF?STRTMYfilerTMPCR擴(kuò)增試劑盒+多拷貝Y-STR 7種Y-STR分型系統(tǒng)的HD 值，分別為0.998 533 873、0.999 477 587、0.999 915 74、0.999056286、0.999764071、0.99991574 和0.999764071。

2.2 各群體間的遺傳距離與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

選取獲得的蚌埠地區(qū)漢族人群28 個(gè)Y-STR（DYS19、DYS389 Ⅰ、DYS389 Ⅱ、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS385a/b、DYS438、DYS439、DYS437、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635、YGATAH4、DYS481、DYS533、DYS549、DYS570、DYS576、DYS643、DYF387S1、DYS449、DYS460、DYS518和DYS627）基因座的分型結(jié)果，將其與貴州布依族、湖南侗族、廣東漢族、貴州漢族、江蘇漢族、江西漢族、上海漢族、廣西玉林漢族、新疆蒙古族、北川地區(qū)羌族、青海撒拉族、四川阿壩地區(qū)藏族、四川藏族、湖南土家族、湖南瑤族、貴陽(yáng)地區(qū)彝族的分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，通過(guò)AMOVA 得到17 個(gè)群體間的遺傳距離并繪制MDS 圖（圖1）。

圖1 基于Rst值的蚌埠地區(qū)漢族與其他16 個(gè)群體的多維尺度分析圖Fig.1 Multidimensional scaling plot of Bengbu Han and other 16 reference populations based on Rst values

MDS 結(jié)果顯示，蚌埠地區(qū)漢族與江蘇漢族、上海漢族等中國(guó)東部漢族群體聚類(lèi)在一起，與其他民族的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，此外也發(fā)現(xiàn)，湖南瑤族、湖南侗族、湖南土家族、北川地區(qū)羌族與南方漢族群體聚類(lèi)在一起（圖1）。

遺傳距離的計(jì)算結(jié)果（表2）顯示，蚌埠地區(qū)漢族與江蘇漢族遺傳距離最小（Rst=0.006 7），與廣東漢族男性遺傳距離最大（Rst=0.035 5）。基于28 個(gè)Y-STR 基因座組合的17 個(gè)群體之間的Rst值，采用NJ 法得到系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，不同的顏色代表不同群體的語(yǔ)系，系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果顯示：整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分為兩個(gè)大支，藏族的兩個(gè)群體聚類(lèi)在一起，形成其中的一個(gè)分支，其余群體組成另一個(gè)分支。在第二個(gè)分支中，大部分漢藏語(yǔ)系的群體聚類(lèi)在一起。本研究的蚌埠地區(qū)漢族首先與江蘇漢族、上海漢族和江西漢族聚類(lèi)在一起，然后再與廣西玉林漢族聚類(lèi)在一起。

表2 基于Maximal基因座組合28 個(gè)Y-STR 基因座計(jì)算蚌埠地區(qū)漢族與其他16 個(gè)群體的遺傳距離（Rst）Tab.2 Genetic distances（Rst）between Bengbu Han and 16 reference populations based on 27 Y-STR

圖2 基于群體配對(duì)Rst值構(gòu)建蚌埠地區(qū)漢族與其他16 個(gè)群體的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of the studied Bengbu Han and other 16 reference populations based on Rst values

3 討論

3.1 蚌埠地區(qū)漢族41個(gè)Y-STR基因座的法醫(yī)學(xué)效能

本研究所使用的SureID?PathFinder Plus 試劑盒是由寧波海爾施基因科技有限公司研發(fā)，包含41個(gè)Y-STR 基因座。該試劑盒采用六色熒光標(biāo)記系統(tǒng)，除了包含YfilerTMPlus PCR 擴(kuò)增試劑盒的基因座之外，還包含了其他12 個(gè)Y-STR 基因座（DYS645、DYS557、DYF387S1、DYS596、DYS518、DYS596、DYS518、DYS449、DYS593、DYS549、DYS576、DYS570、DYS627和DYF404S1）和3 個(gè)Y 染色體插入/缺失基因座（rs199815934、rs771783753 和rs759551978）。本研究中41 個(gè)Y-STR 基因座在345 例蚌埠地區(qū)漢族無(wú)關(guān)男性個(gè)體中共觀察到343 種單倍型，41 個(gè)Y-STR 基因座所組成的HD 值為0.999 966 3。41 個(gè)Y-STR 基因座上共觀察到386 個(gè)等位基因，等位基因頻率分布在0.002 9～0.933 3，GD 值為0.126 7～0.963 8，除DYS388、DYS645、DYS438、DYS3914 個(gè)基因座GD 值小于0.5外，其余基因座GD 值均大于0.5，表明這些基因座在蚌埠地區(qū)漢族人群中具有較好的遺傳多態(tài)性。此外，本研究對(duì)不同Y-STR 基因座組合的法醫(yī)學(xué)效能評(píng)估進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明，隨著Y-STR 位點(diǎn)的增加，Y-STR基因座組合的鑒別效能進(jìn)一步提升。同時(shí)，快速突變基因座及多拷貝基因座的引入進(jìn)一步增加了整個(gè)YSTR 系統(tǒng)的鑒別能力。4 個(gè)多拷貝基因座DYS385a/b、DYF387S1、DYS527、DYF404S1的遺傳多態(tài)性最高，分布在0.904 5（DYF404S1）～0.963 8（DYS385a/b）。DYS385a/b基因座GD 值最高與國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)[17-19]報(bào)道的漢族遺傳數(shù)據(jù)結(jié)果具有一致性。

345 例樣本中，檢測(cè)到4 個(gè)稀有等位基因DYS518（36.2）、DYS627（19.2）、DYF387S1（37.2）、DYF404S1（13.2）。稀有等位基因一般是指出現(xiàn)在等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)品之外的等位基因，這些等位基因在群體中的頻率較低。稀有等位基因?qū)儆谖⒆儺?，該變異的出現(xiàn)與等位基因的突變引起重復(fù)序列中核苷酸的缺失、插入、轉(zhuǎn)換或者顛換有關(guān)[20]。稀有等位基因的產(chǎn)生可以形成更多的單倍型，并且遵循孟德?tīng)栠z傳定律，可以遺傳給后代[21-22]。通過(guò)文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)4個(gè)稀有等位基因在金華地區(qū)漢族、山東漢族、廣西漢族、湖南苗族和湖南土家族等群體中均有報(bào)道[6,23-25]。這些稀有等位基因的出現(xiàn)，在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用實(shí)踐中可以發(fā)揮重要的作用，尤其是在對(duì)同一家系的不同個(gè)體進(jìn)行個(gè)體識(shí)別時(shí)有著重要的應(yīng)用價(jià)值。

3.2 蚌埠地區(qū)漢族與其他16 個(gè)群體間遺傳關(guān)系

為進(jìn)一步評(píng)估蚌埠地區(qū)漢族與中國(guó)其他地區(qū)民族的遺傳關(guān)系，本研究基于28 個(gè)Y-STR 基因座組合的Rst值，采用NJ 法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)明顯分為兩支：兩個(gè)藏族群體聚類(lèi)在一起成為一支，其他民族聚集在另一支。蚌埠地區(qū)漢族與中國(guó)大多數(shù)南方漢族群體聚類(lèi)在一起，如江蘇漢族、上海漢族、廣西玉林漢族和江西漢族等群體，表明蚌埠漢族與大多數(shù)南方漢族群體具有較近的遺傳關(guān)系，這一結(jié)果與安徽人口的移民歷史是一致的。蚌埠位于安徽省北部，安徽的人口以外來(lái)漢族移民的后代為主，特別是江西人，以發(fā)生在明朝早期的洪武大移民為最大規(guī)模[26]。長(zhǎng)期以來(lái)蚌埠漢族與南方其他地區(qū)漢族的混居、通婚可能導(dǎo)致蚌埠地區(qū)漢族與南方漢族有著較近的遺傳關(guān)系。

漢族是我國(guó)、也是世界上人口最多的民族，分布最廣，漢族的遺傳結(jié)構(gòu)對(duì)于研究大型民族的人口擴(kuò)張有代表性意義?；赗st矩陣構(gòu)建的MDS 圖顯示，湖南瑤族、湖南侗族、湖南土家族、北川地區(qū)羌族與南方漢族群體聚類(lèi)在一起，這和漢文化擴(kuò)張引起的近期基因交流是密切相關(guān)的[27-30]。

本研究的41 個(gè)Y-STR 基因座在蚌埠地區(qū)漢族群體中有著較高的遺傳多態(tài)性，適用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別、親權(quán)關(guān)系鑒定，可以滿(mǎn)足家系排查的需求，研究獲得的數(shù)據(jù)可以為構(gòu)建該地區(qū)民族Y-STR 數(shù)據(jù)庫(kù)提供數(shù)據(jù)支撐。對(duì)蚌埠地區(qū)漢族及其他省份16 個(gè)群體的群體遺傳學(xué)研究表明，蚌埠地區(qū)漢族與南方漢族群體有著更近的遺傳關(guān)系。