柳勛法，張翠靈

1.深圳市人民醫(yī)院脊柱外科，廣東深圳 518020；2.深圳市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518020

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）最常見(jiàn)的骨原發(fā)惡性腫瘤，在骨原發(fā)性腫瘤中，其發(fā)病率僅次于漿細(xì)胞骨髓瘤[1]，每年全世界的發(fā)病率為4人/百萬(wàn)人[2]。手術(shù)和多藥聯(lián)合化療是骨肉瘤患者主要的治療方法?；熌芟麥缁颊唧w內(nèi)潛在的微小轉(zhuǎn)移灶、使腫瘤體積變小、腫瘤局部血供減少、提高保肢手術(shù)成功率?；熉?lián)合手術(shù)治療能夠極大提高生存率，5年生存率從10%～20%上升到60%～70%。然而由于化療抵抗的產(chǎn)生和化療藥物的不良反應(yīng)，超過(guò)80%的手術(shù)治療患者表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)，預(yù)后極差[3-4]。同時(shí)腫瘤細(xì)胞耐藥性不斷增強(qiáng)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)化療抵抗常常導(dǎo)致化療失敗，目前化療抵抗的具體機(jī)制仍未完全清楚。前期研究中發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤癌旁組織中Circ_010434高表達(dá)，但其機(jī)制及對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用尚不明確[5-6]。該研究通過(guò)收集4種骨肉瘤細(xì)胞，包括MG-63、U2OS、SaOS-2和SOSP-9607，觀察Circ_010434對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移及增殖的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用的4款骨肉瘤細(xì)胞，包括MG-63、U2OS及SaOS-2購(gòu)買(mǎi)自北納生物，SOSP-9607購(gòu)買(mǎi)自中科院。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

①2×SYBR Green PCR Master Mix（A4004M，Lifeint生命互聯(lián)）。②miRNA cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（CW2141S，CWBIO康為世紀(jì)）。③miRNA qPCR Assay Kit(CW2142S，CWBIO康為世紀(jì)）。④miRNA Purification Kit提取試劑盒（CW0627S，CWBIO康為世紀(jì)）。⑤Cell Cycle Staining Kit（CCS102，MULTI SCIENCES聯(lián)科生物）。⑥結(jié)晶紫染色液（G1061，Solarbio）。

1.3 方法

收集4種骨肉瘤細(xì)胞系，包括MG-63、U2OS、SaOS-2和SOSP-9607，引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。分別進(jìn)行RNA提取、RNA濃度和純度測(cè)定、RNA逆轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞中的Circ_0104346的表達(dá)。選取Circ_0104346表達(dá)量最高的細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。干擾骨肉瘤細(xì)胞中Circ_0104346的表達(dá)，流式檢測(cè)凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，流式檢測(cè)周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.3.1 細(xì)胞收集 用移液槍吸掉培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液；在培養(yǎng)皿中加入Trizon裂解液，用移液槍吹打，將全部細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，-80℃保存。

1.3.2 RNA提取 向以上溶液中加入氯仿離心15 min后，試管液體分成3層，取無(wú)色水相層并將其轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL RNase-Free離心管中，加入相同體積的乙醇（70%）并混勻并加入到收集管中，12 000 rpm離心半分鐘后棄流出液，加入700μl RW1 12 000 rpm離心半分鐘后棄流出液；加入500μl RW2 12 000 rpm離心半分鐘后棄流出液；加入35μl無(wú)RNase的水離心；得到的RNA保存在-80℃，防止降解。

1.3.3 測(cè)定RNA的濃度和純度 該研究中采用紫外分光光度儀（NP80，NanoPhotometer）分別在D260和OD280條件下進(jìn)行數(shù)據(jù)檢測(cè)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄、數(shù)據(jù)分析。具體方法是從上述1.3.2實(shí)驗(yàn)步驟中保存的RNA液體中，吸取1.5 mL進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 RNA逆轉(zhuǎn)錄 在準(zhǔn)備好的RNase-free離心管中配制如下混合液（包括模板DNA、4×gDNA wiper Mix、RNase-free ddH2O），總?cè)萘?6μl。在上述混合液中加入4μl的5×HiScript II qRT SuperMix II后混勻，加熱至50℃并保持該溫度15 min，后轉(zhuǎn)至85℃并保持5 s，產(chǎn)物用于qPCR反應(yīng)。

1.3.5 流式檢測(cè)凋亡實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染成功后分組處理細(xì)胞，24 h后流式檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.3.6 流式檢測(cè)周期實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染成功后分組處理細(xì)胞，24 h后流式檢測(cè)各組細(xì)胞周期情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞中的Circ_0104346相對(duì)表達(dá)量情況比較

4組細(xì)胞間Circ_0104346相對(duì)表達(dá)量使用LSD法進(jìn)一步對(duì)差異進(jìn)行比較，可以看出其中SaOS-2＞MG-63＞SOSP-9607=U20S。表明SaOS-2細(xì)胞中Circ_0104346相對(duì)表達(dá)量最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 細(xì)胞中的Circ_0104346相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 干擾Circ_0104346表達(dá)后各組細(xì)胞凋亡結(jié)果比較

3組細(xì)胞間的細(xì)胞凋亡可以看出干擾組＞空載組＞對(duì)照組。表明干擾Circ_0104346表達(dá)后，骨肉瘤細(xì)胞凋亡增加，增殖能力下降。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 干擾Circ_0104346表達(dá)后各組細(xì)胞凋亡率比較

2.3 干擾Circ_0104346表達(dá)后各組細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果比較

干擾組細(xì)胞處于G0/G1期數(shù)量明顯增多，處于S期細(xì)胞明顯減少，結(jié)果表明干擾Circ_0104346表達(dá)后，骨肉瘤細(xì)胞增殖及遷移能力明顯下降。

為了研究3組細(xì)胞間的細(xì)胞處于G0及G1期的細(xì)胞數(shù)是否有不同，使用LSD法進(jìn)一步對(duì)差異進(jìn)行比較，可以看出干擾組＞空載組＞對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 干擾Circ_0104346表達(dá)后各組細(xì)胞GO/GI數(shù)據(jù)比較

為了研究不同分組之間S有無(wú)差異，使用LSD法進(jìn)一步對(duì)差異進(jìn)行比較，可以看出對(duì)照組=空載組＞干擾組，使用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

表4 干擾Circ_0104346表達(dá)后各組細(xì)胞S數(shù)據(jù)比較

3 討論

人骨肉瘤是兒童及青少年常見(jiàn)的骨原發(fā)性惡性腫瘤，合并轉(zhuǎn)移性疾病及耐藥的患者預(yù)后差，骨肉瘤耐藥機(jī)制及新的靶標(biāo)尚不明確[7-8]。CircRNA是一種非編碼RNA，參與了生長(zhǎng)發(fā)育、衰老、疾病等多種生命活動(dòng)過(guò)程，具有調(diào)控基因表達(dá)的重要功能[9-10]。截至目前發(fā)現(xiàn)的CircRNA根據(jù)其來(lái)源可分為4類(lèi)：外顯子來(lái)源的環(huán)狀RNA(CircRNA)、外顯子及內(nèi)含子共同組成的環(huán)狀RNA(ElciRNA)、內(nèi)含子來(lái)源的環(huán)狀RNA(ciRNA)和通讀環(huán)狀RNA(rt-CircRNA)[11]。其中CircRNA存在人體許多組織中，如肝臟、腎臟、心血管、牙周組織、周?chē)窠?jīng)、腸道、子宮內(nèi)膜中等發(fā)揮組織修復(fù)作用。隨著研究的不斷深入，人們總結(jié)出CircRNA具有以下生物學(xué)特征：CircRNA具有特殊的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因而具有高度的穩(wěn)定性；CircRNA在真核生物中廣泛表達(dá)，截至到目前研究發(fā)現(xiàn)有超過(guò)20 000種的CircRNA,數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)線型RNA；高度物種保守性，從目前發(fā)現(xiàn)CircRNA的生物學(xué)特性分析來(lái)看，多數(shù)具有高度保守的特性；從CircRNA分布來(lái)看，多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，有些分布在細(xì)胞核內(nèi)，因此其在細(xì)胞中的表達(dá)及分布存在特異性；CircRNA在不同系統(tǒng)的疾病或同一組織發(fā)育的不同階段表達(dá)的種類(lèi)和數(shù)量也有不同，表現(xiàn)出組織特異性和發(fā)育階段特異性。CircRNA的生物學(xué)特征主要表現(xiàn)在：海綿吸附功能、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白、翻譯合成蛋白質(zhì)、調(diào)控細(xì)胞間信號(hào)通路，通過(guò)這些生物學(xué)的特性在疾病的發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程中起到極其重要的作用。

近年來(lái)，CircRNA在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等領(lǐng)域積累了一定數(shù)量的研究成果，另外研究還發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤、肺癌、直腸癌等惡性腫瘤中也有異常的表達(dá)，CircRNA已經(jīng)成為某些惡性腫瘤診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。Zhu X等[12]通過(guò)對(duì)肺癌組織進(jìn)行CircRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，39個(gè)CircRNA的表達(dá)上調(diào)，20個(gè)CircRNA的表達(dá)下調(diào)。同樣但其在骨肉瘤中的作用仍有待進(jìn)一步研究。

前期采用高通量CircRNA芯片技術(shù)檢測(cè)4例人骨肉瘤組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中CircRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)CircRNA在骨肉瘤組織中也同樣存在者特異性和差異性表達(dá)。其中Circ_0104346高表達(dá)，具體作用機(jī)制尚不明確。在利用骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，需要一種Circ_0104346表達(dá)含量高的骨肉瘤細(xì)胞系來(lái)進(jìn)行細(xì)胞分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)[13]。

MG-63是一種常用的人骨肉瘤細(xì)胞，在其B細(xì)胞受體中，檢測(cè)出包括UVA活化蛋白激酶和絡(luò)氨酸激酶受體，表明MG-63可能有助于進(jìn)行候選生物標(biāo)志物治療及骨肉瘤的診斷研究，并可以為骨肉瘤的分子生物學(xué)機(jī)制研究提供合適的載體[14-15]；U-2OS是由Ponten J和Saksela E在1964年從1名15歲女性的脛骨中等分化的肉瘤中分離建立的[16]。該細(xì)胞能表達(dá)胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ、Ⅱ（IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ）受體和骨肉瘤衍生生長(zhǎng)因子（ODGF）；人成骨肉瘤細(xì)胞Saos-2是Fogh J和Trempe G分離和鑒定的眾多人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系中的一種，該細(xì)胞來(lái)自1名11歲的白人女性的骨肉瘤組織[17-18]；SOSP-9607組織來(lái)源于一名17歲男性患者，1996年7月16日因左脛骨上段成骨肉瘤行左大腿高位截肢術(shù)，截肢標(biāo)本取材病理診斷成骨肉瘤(軟骨母細(xì)胞型)[19-20]。

該研究利用PCR對(duì)4種人骨肉瘤細(xì)胞系中的Circ_0104346進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示在上述四種細(xì)胞系中SaOS-2細(xì)胞系的Circ_0104346表達(dá)最高，和其他3種細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），因此該骨肉瘤細(xì)胞可以作為骨肉瘤耐藥機(jī)制的分子細(xì)胞學(xué)研究載體。

后續(xù)選擇SaOS-2細(xì)胞進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，干擾細(xì)胞中的Circ_0104346表達(dá)后，骨肉瘤細(xì)胞的凋亡率明顯增加，處于G0/G1細(xì)胞數(shù)量增多，處于S其細(xì)胞明顯減少，表明骨肉瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯下降。

綜上所述，骨肉瘤細(xì)胞中Circ_0104346表達(dá)上調(diào)，干擾Circ_0104346的表達(dá)能抑制其細(xì)胞遷移及增殖能力。