于志娟（通訊作者），王立國

（赤峰市醫(yī)院婦產(chǎn)科 內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

宮頸癌為全球女性三大常見癌癥，發(fā)病原因尚不明確，早婚早育、性生活紊亂女性患病率較高。宮頸癌早期治療具有良好效果，中晚期患者的預(yù)后差，故早期發(fā)現(xiàn)并治療是提高宮頸癌生存率的關(guān)鍵，尋找用于宮頸癌早期診斷與預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)記物對臨床具有重要意義[1]。LncRNA 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，但目前尚未充分研究出NEAT1在宮頸癌中生物學(xué)功能。NEAT1 與miR-129-5p 在宮頸癌中作用關(guān)系也無明確報道[2-3]。本研究將宮頸癌細(xì)胞作為研究，檢測Hela 細(xì)胞中NEAT1、miR-129-5p 表達(dá)情況，現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

人宮頸癌（Hela）細(xì)胞和正常宮頸細(xì)胞來源于AT CC；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶等購于GIBCO 公司。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：將人宮頸癌細(xì)胞株與人宮頸上皮細(xì)胞放于DMEM 培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。進(jìn)行LncRNA NEAT1、miR-129-5p、TNFRSF11A 轉(zhuǎn)染；將敲減NEAT1 陰性對照（si-con）、敲減NEAT1（si-NEAT1）、miR-129-5p 模擬物、過表達(dá)miR-129-5p 陰性對照（miR-NC）按要求轉(zhuǎn)染至Hela 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h 后更換培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，qRT-PCR 檢查轉(zhuǎn)染情況，成功后備用[4]。

qPCR 檢測：采用TRIzol 法分別提取宮頸癌細(xì)胞與細(xì)胞總RNA；后通過NanoDrop 檢測RNA 濃度與純度，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測PCR，按試劑盒說明建立PCR 反應(yīng)體系；PCR 循環(huán)參數(shù)設(shè)置：95 ℃下5 min，3 步反應(yīng)；94 ℃下變性30 s，60 ℃下退火30 s，45 個循環(huán)。結(jié)果通過2-ΔΔCt法計(jì)算。

Wb 檢測宮頸細(xì)胞TNFRSF11A 與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)：提取細(xì)胞蛋白后檢測蛋白濃度，上樣緩沖液中加入萃取蛋白，加熱至95 ℃并維持10 min；每孔樣品載藥量為30 μg，加入10%聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白；經(jīng)聚偏二氟乙烯轉(zhuǎn)膜后將蛋白密封在牛血清蛋白中1 h，加入一抗后在4 ℃下過夜培養(yǎng)；緩沖液沖洗后加二抗于室溫下培養(yǎng)；洗膜3 次，加化學(xué)發(fā)光試劑顯影蛋白。

CCK-8 檢測癌細(xì)胞增殖：將癌細(xì)胞接種在96 孔板，于Caski、HeLa 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NEAT1、miR-129-5p、TNFRSF11A；檢測前1 h 每孔加入CCK-8 溶液，培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀檢測光密度值。

Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測癌細(xì)胞侵襲力：將轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為研究組，未轉(zhuǎn)染作為對照組；各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化處理，接種在Transwell 小室孔板中，上室加細(xì)胞懸液，下室加胎牛血清的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后取出小室，擦去微孔膜上室細(xì)胞，緩沖液沖洗，固定侵襲并黏附至小室微孔膜下方細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，沖洗小室后干燥，于倒置顯微鏡觀察。

染色流式細(xì)胞術(shù)檢測癌細(xì)胞凋亡：選擇轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染組Caski、HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，沖洗后，混合細(xì)胞與預(yù)冷緩沖液結(jié)合，避光孵育，上機(jī)前加PI 染色，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 宮頸癌組織NEAT1、miR-129-5p 表達(dá)

相對于正常宮頸細(xì)胞，Hela 細(xì)胞中NEAT1 表達(dá)上升，miR-129-5p 表達(dá)下降（P＜0.05），見表1。

表1 組織NEAT1、miR-129-5p 表達(dá)比較（ ± s）

表1 組織NEAT1、miR-129-5p 表達(dá)比較（ ± s）

組別NEAT1miR-129-5p正常宮頸細(xì)胞1.09±0.142.74±0.29宮頸癌Hela 細(xì)胞3.18±0.360.96±0.10 t 8.6119.054 P＜0.001＜0.001

2.2 敲減NEAT1 對宮頸癌細(xì)胞影響

si-NEAT1 組Hela 細(xì)胞NEAT1 表達(dá)低于si-NC 組（P＜0.05）， 細(xì)胞活性降低（P＜0.05）；si-NEAT1 組遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)低于si-NC 組（P＜0.05），見表2。

表2 敲減NEAT1 對宮頸癌細(xì)胞影響（ ± s）

表2 敲減NEAT1 對宮頸癌細(xì)胞影響（ ± s）

侵襲細(xì)胞/個si-NC 組3.18±0.31 1.36±0.15 48.64±5.37 47.39±4.16 si-NEAT1 組 1.01±0.08 0.81±0.07 19.95±6.01 13.31±5.71 t 7.56118.56225.314 P＜0.001＜0.001＜0.001組別NEAT1細(xì)胞活性（OD490 nm）遷移細(xì)胞/個

2.3 過表達(dá)miR-129-5p 對宮頸癌細(xì)胞影響

miR-129-5p 組Hela 細(xì)胞中miR-129-5p 表達(dá)高于miR-NC 組（P＜0.05），細(xì)胞活性降低（P＜0.05）；miR-129-5p 組遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)低于miR-NC 組（P＜0.05），見表3。

表3 過表達(dá)miR-129-5p 對宮頸癌細(xì)胞影響（ ± s）

表3 過表達(dá)miR-129-5p 對宮頸癌細(xì)胞影響（ ± s）

侵襲細(xì)胞/個miR-NC 組0.93±0.07 1.42±0.14 51.36±5.14 43.53±3.11 miR-129-5p 組 2.41±0.23 0.85±0.07 18.32±1.15 12.75±1.42 t 9.2516.85431.05234.053 P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001組別miR-129-5p細(xì)胞活性（OD490 nm）遷移細(xì)胞/個

3.討論

宮頸癌為女性常見惡性腫瘤，病死率高。宮頸脫落細(xì)胞檢測為宮頸癌篩查的標(biāo)準(zhǔn)方式，能有效降低宮頸癌發(fā)病率與病死率，但篩查仍具有一定局限性。由于臨床缺少有效早期診斷方法，宮頸癌多發(fā)展為浸潤性癌癥，降低患者生存率。近年來臨床已證實(shí)LncRNA 的生物學(xué)功能，機(jī)制涉及DNA 甲基化、多形式組蛋白修飾、RNA 干擾、染色質(zhì)重構(gòu)等，通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控與表觀遺傳學(xué)等影響靶基因沉默和細(xì)胞周期變化，且能影響剪切、翻譯方式，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。LncRNA 為新型生物學(xué)標(biāo)記物，表達(dá)水平聯(lián)合癌癥病理與預(yù)后在臨床中得到廣泛研究應(yīng)用。多個研究指出LncRNA MALAT1與宮頸癌發(fā)生發(fā)展可能存在關(guān)聯(lián)，本研究對LncRNA MALAT1 與宮頸癌的相關(guān)性進(jìn)行研究[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1 表達(dá)在癌組織與癌旁組織中差異顯著，提示LncRNA MALAT1 與宮頸癌發(fā)生發(fā)展可能有一定促進(jìn)作用[7]。miR-129-5p 與多腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，外源性miR-129-5p 可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡并阻斷HeLa 細(xì)胞周期進(jìn)展，但miR-129-5p 對宮頸癌侵襲、轉(zhuǎn)移等機(jī)制尚不明確。研究顯示，miR-129-5p 過量表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞侵襲與增殖，故miR-129-5p 過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞侵襲可能有抑制作用[8]。本研究顯示miR-129-5p 過表達(dá)中miR-129-5p 組細(xì)胞中miR-129-5p 表達(dá)高于miR-NC 組，遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)低于miR-NC 組，說明抑制miR-129-5p 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)敲減NEAT1 對宮頸癌細(xì)胞活性、遷移侵襲抑制作用[9]。

綜上所述，LncRNA NEAT1 可下調(diào)miR-129-5p/TNFRSF11 A 軸促進(jìn)宮頸癌發(fā)展，該機(jī)制可為宮頸癌治療提供靶點(diǎn)。