包永鎮(zhèn)，代翠紅，程大友，崔 杰

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院 哈爾濱 150001；2.黑龍江新和成生物科技有限公司，黑龍江 綏化 152000)

0 前言

初生代謝物是生物生長(zhǎng)發(fā)育等生命活動(dòng)中必不可少的基礎(chǔ)物質(zhì)和能量來源，包括糖類、氨基酸、脂質(zhì)、核苷酸等物質(zhì)。揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs，Volatile organic compounds)為常壓下，沸點(diǎn)范圍在 50℃～260℃之間的各類有機(jī)化合物。VOCs 根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，可以分為烷類、醛類、芳烴類、酯類和其他等。常見的有苯乙烯、苯、丁酸丙酯、甲苯、三氯甲烷、二甲苯、2-壬酮、苯乙醇、2-辛酮等?；?UPLC-MS/MS 檢測(cè)技術(shù)，利用構(gòu)建的代謝數(shù)據(jù)庫(kù)以及智能二級(jí)譜匹配方法對(duì)物質(zhì)定性，采用 MRM 檢測(cè)模式檢測(cè)物質(zhì)相對(duì)含量。通過單變量統(tǒng)計(jì)分析和多元統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)定性定量到的代謝物進(jìn)行分析。本章通過 LC-MS/MS，對(duì)甜菜汁與甜菜酒的初生代謝物質(zhì)進(jìn)行定性定量檢測(cè)與差異分析，通過主成分分析(PCA)來判斷樣本的重復(fù)性與可靠性、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)確定樣品的可行性與檢測(cè)結(jié)果的可靠性，然后通過 VIP 值來篩選差異代謝物、通過聚類熱圖對(duì)差異代謝物進(jìn)行聚類分析、最后進(jìn)行差異代謝物 KEGG 通路分析。本文通過 GC-MS/MS，對(duì)甜菜汁與甜菜酒的揮發(fā)性代謝物質(zhì)進(jìn)行定性定量檢測(cè)與差異分析，通過主成分分析(PCA)來判斷樣本的重復(fù)性與可靠性、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)確定樣品的可行性，然后通過 VIP 值進(jìn)行差異代謝物的篩選、通過聚類熱圖對(duì)差異代謝物進(jìn)行聚類分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所使用食用紅甜菜由哈爾濱工業(yè)大學(xué)糖業(yè)研究所提供。紅甜菜果酒由本課題組制備。

1.2 儀器與試劑 實(shí)驗(yàn)儀器

質(zhì)譜儀、氣相色普/質(zhì)譜聯(lián)用儀(AGILENT，6890N/5973I)；氣質(zhì)聯(lián)用；電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；AB SCIEX 質(zhì)譜儀 QTRAP?5500 LC/MS/MS 系統(tǒng)，AB SCIEX公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890B GC system-5977A MSD)，賽默飛世爾科技有限公司；色譜柱(HP-5毛細(xì)管柱 30 m×0.25 mm，0.25 μm)，賽默飛世爾科技有限公司；手動(dòng)固相微萃取(SPME)進(jìn)樣手柄(USA，SUP-ELCO)，賽默飛世爾科技有限公司；陶瓷加熱磁力攪拌器(Corning)，美國(guó) Agilent 公司。高效液相色譜儀(Ulimate3000)賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 食用紅甜菜酒中初生代謝物質(zhì)的測(cè)定與分析

利用AB SciexQTRAPLC-MS/MS檢測(cè)平臺(tái)采集樣本代謝物質(zhì)譜信息，與初生代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，鑒定樣本中代謝物。

通過ABSciexQTRAPLC-MS/MS檢測(cè)平臺(tái)，利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)獲得樣本中代謝物峰面積數(shù)據(jù)，得到代謝物在不同樣本中的相對(duì)含量。

1.4 食用紅甜菜酒中揮發(fā)性代謝物質(zhì)的測(cè)定與分析

利用 GC-MS/MS，對(duì)食用紅甜菜汁與食用紅甜菜酒的揮發(fā)性代謝物質(zhì)進(jìn)行定性定量檢測(cè)與差異分析，通過主成分分析(PCA)確定樣本間的分離情況、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)確定樣品的可行性，通過 VIP 值進(jìn)行差異代謝物的篩選，對(duì)差異代謝物進(jìn)行聚類分析。三組平行實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定其可溶性固形物含量和酒精度作為發(fā)酵結(jié)果的評(píng)定指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 初生代謝物數(shù)據(jù)結(jié)果分析

2.1.1 基于主成分分析的初生代謝物差異性分析

本研究提取了 PC1 和 PC2 兩個(gè)主成分，其貢獻(xiàn)率分別為75.85%和 10.48%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到 86.33%。在 PCA 記分圖中，發(fā)酵組(FJ)和對(duì)照組(CK)被清楚地分開，重復(fù)的樣本分布密集(圖1a)，說明本研究可靠并且具有較好的重復(fù)性。在 PCA 3D 圖中(圖1b)，可以更直觀地觀察到樣本的聚類。

圖1 分組主成分分析圖與三維圖

表示第二主成分，Z 軸表示第三主成分。

前 5 個(gè)主成分可解釋的變異見圖 2，左圖為累計(jì)可解釋變異，從圖中可以看出，前 5 個(gè)主成分總貢獻(xiàn)率達(dá)到 100%，其中前兩個(gè)主成分總貢獻(xiàn)率接近 90%；右圖為各個(gè)主成分的可解釋變異，其中主成分 PCA1 和 PCA2 貢獻(xiàn)率分別為 75.85%和 10.48%，PCA3、PCA4、PCA5 貢獻(xiàn)率均低于 10%。

圖2 分組主成分分析可解釋變異圖

2.1.2 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)

與 PCA 相比，PLS-DA 可以使組間區(qū)分最大化，使差異代謝物更容易被尋找。OPLS-DA 將正交信號(hào)矯正(OSC)和 PLS-DA 方法互相檢驗(yàn)，能夠?qū)?X 矩陣信息分成兩類信息，即一類與 Y 相關(guān)，另一類與 Y 不相關(guān)，將不相關(guān)的差異信息去除，保留差異變量。

1)OPLS-DA 模型概要

OPLS-DA 建模時(shí)，X 矩陣信息會(huì)被分解成兩類信息，即與 Y 相關(guān)和不相關(guān)的信息，其中與 Y 相關(guān)的變量信息為預(yù)測(cè)主成分，與 Y 不相關(guān)的變量信息為正交主成分。從 OPLS-DA 的分圖(略)中可以看出發(fā)酵組(FJ)和對(duì)照組(CK)明顯分離開，預(yù)測(cè)主成分貢獻(xiàn)率達(dá)77.5%，說明兩組之間差異較大；正交主成分貢獻(xiàn)率僅為8.6%，說明組內(nèi)差異較小。

2)OPLS-DA 模型驗(yàn)證

對(duì) OPLS-DA 進(jìn)行排列驗(yàn)證(n=200，即進(jìn)行 200 次排列實(shí)驗(yàn))。在模型驗(yàn)證圖中，橫線對(duì)應(yīng)的是原始模型的 R2Y 和 Q2，紅點(diǎn)和藍(lán)點(diǎn)分別代表 Y 置換后模型的R2Y’和 Q2’。在本研究中，R2Y’和 Q2’均小于原始模型的 R2Y 和 Q2(圖4)，即相應(yīng)的點(diǎn)都不超過相應(yīng)的線，從而說明說明該模型有意義，并且 Q2>0.9，說明該模型是出色的模型，可根據(jù) VIP 值分析篩選其差異代謝物。

圖3 OPLS-DA 驗(yàn)證圖

3)OPLS-DA S-plot

圖 4 為 OPLS-DA 的 S-plot 圖，橫坐標(biāo)表示主成分與代謝物的協(xié)方差，縱坐標(biāo)表示主成分與代謝物的相關(guān)系數(shù)，越靠近右上角和左下角的代謝物表示其差異越顯著，紅色的點(diǎn)表明這些代謝物的 VIP≥1，綠色的點(diǎn)表示這些代謝物的 VIP 值<1。

圖4 OPLS-DA S-plot

2.1.3 差異代謝物篩選

在 OPLS-DA 的基礎(chǔ)上，根據(jù)得到的多變量對(duì) OPLS-DA 模型的變量重要性投影(VIP)進(jìn)行分析，可以初步篩選出不同樣品間的差異代謝物。綜合分析差異倍數(shù)和 VIP 值來對(duì)差異表達(dá)代謝物進(jìn)行篩選。篩選標(biāo)準(zhǔn)：

1、選取差異倍數(shù)大于等于 2 和差異倍數(shù)小于等于 0.5 的代謝物。

2、在上述的基礎(chǔ)上，選取 VIP≥1 的代謝物。

1)差異代謝物火山圖

圖 5 為差異代謝物火山圖。檢測(cè)到的初生代謝產(chǎn)物中，上調(diào)表達(dá)的差異代謝物在圖中用紅色的點(diǎn)表示，下調(diào)表達(dá)的差異代謝物在圖中用綠色的點(diǎn)表示，差異不顯著的代謝物在圖中用灰色的點(diǎn)表示。共檢測(cè)到初生代謝物 229 種，其中磷脂酰膽堿 1 種、溶血磷脂酰膽堿 2 種、甘油酯 2 種、維生素 7 種、游離脂肪酸 12 種、糖及醇類 19 種、核苷酸及其衍生物 34 種、有機(jī)酸 38 種、酚酸類 43 種、氨基酸及其衍生物 71 種?；?OPLS-DA 的結(jié)果，通過 VIP 值進(jìn)行差異分析，得到差異顯著的代謝物 140 種，上調(diào) 89 種，下調(diào) 51 種。其中，上調(diào)：磷脂酰膽堿 1 種、維生素 5 種；下調(diào)：甘油脂 1 種、游離脂肪酸 9 種。糖及醇類 12 種(5 種上調(diào)，7 種下調(diào))、核酸及其衍生物 23 種(13 種上調(diào)，10 種下調(diào))、酚酸類 24 種(18 種上調(diào)、6 種下調(diào))、有機(jī)酸 26 種(23 種上調(diào)、3 種下調(diào))、氨基酸及其衍生物 39 種(24種上調(diào)、15 種下調(diào))。

圖5 差異表達(dá)代謝物火山圖

2)差異代謝物聚類熱圖

結(jié)果如圖6。從左圖中可以看出發(fā)酵組(FJ)高含量差異代謝物超過 50%，明顯多于對(duì)照組(CK)；從右圖中可以看出各類差異代謝物在兩組中的含量，其中發(fā)酵組中的氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸、酚酸類物質(zhì)含量均高于對(duì)照組，對(duì)照組中的脂類物質(zhì)含量高于發(fā)酵組，核酸及其衍生物、其他類代謝物在兩組中的含量差別不明顯。

圖6 差異代謝物聚類熱圖

由此可見，在發(fā)酵過程中酚酸與有機(jī)酸含量的增加是形成紅甜菜酒獨(dú)特風(fēng)味與口感的重要原因。酚酸中沒食子酸、丁香酸、龍膽酸(2,5-二羥基苯甲酸)、對(duì)-羥基苯乙酸、3-氨基水楊酸、3-(4-羥基苯基)丙酸、4-羥基苯甲醛、對(duì)羥基苯甲酸、咖啡酸、酪醇、芥子酸、丁香酸 O-葡萄糖苷、沒食子酸甲酯、新綠原酸、1-O-[(E)-對(duì)香豆酰]-β-D-吡喃葡萄糖、葡萄糖沒食子鞣苷、1-阿魏酰-sn-甘油、5-羥甲基糠醛上調(diào)，香蘭素、肉桂酸、苯甲酸、苯甲酸甲酯、3,4,5-三甲氧基苯基 1-O-D-葡萄糖吡喃苷、4-咖啡?？鼘幩嵯抡{(diào)(見附表Ⅱ)，共注釋到了 7 條 KEGG 通路。其中龍膽酸(2,5-二羥基苯甲酸)和對(duì)-羥基苯乙酸共同參與了酪氨酸代謝通路；對(duì)-羥基苯乙酸、肉桂酸和苯甲酸共同參與了苯丙氨酸代謝通路；對(duì)羥基苯甲酸和肉桂酸參與了泛醌和其他萜醌生物合成通路和葉酸生物合成通路；咖啡酸、芥子酸和肉桂 酸參與了苯丙素類生物合成；香蘭素和肉桂酸參與了次生代謝生物合成通路中的辣椒素的生物合成。

2.1.4 差異代謝物 KEGG 分類及富集分析

1)差異代謝物 KEGG 分類

對(duì)初生代謝物 KEGG 的注釋結(jié)果按照 KEGG 中通路類型進(jìn)行分類(圖 7)。

圖7 差異代謝物 KEGG 分類圖

初生代謝物 KEGG 通路分類及富集分析表明，共注釋到代謝通路 67 個(gè)，其中代謝通路注釋到代謝物 64 種，占注釋到的代謝物總數(shù) 76.19%；次生代謝生物合成通路注釋到代謝物 29 種，占注釋到的代謝物總數(shù) 34.52%；氨基酸生物合成通路注釋到代謝物 14 種，占注釋到的代謝物總數(shù) 16.67%；ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白注釋到代謝物 13 種，占注釋到的代謝物總數(shù) 15.48%；嘌呤代謝通路注釋到代謝物 11 種，占注釋到的代謝物總數(shù) 13.1%；氨基酰-t RNA 生物合成通路注釋到代謝物 10 種，占注釋到 的代謝物總數(shù) 11.9%；2-氧羧酸代謝通路注釋到代謝物8種，占注釋到的代謝物總數(shù)9.52%；嘧啶代謝通路、苯丙氨酸代謝通路、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝通路分別注釋到代謝物 7 種，分別占注釋到的代謝物總數(shù) 8.33%；半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路注釋到代謝物 6 種，占注釋到的代謝物總數(shù) 7.14%；玉米素生物合成通路、酪氨酸代謝通路、碳代謝通路分別注釋到代謝物 5 種，分別占注釋到的代謝物總數(shù) 5.95%；苯丙素生物合成通路、煙酸鹽和煙酰胺代謝通路、硫代葡萄糖苷的生物合成通路、氰 氨 酸 代 謝 通 路、丁 酸 代 謝 通 路、β-丙氨酸代謝通路、精氨酸生物合成通路、精氨酸和脯氨酸代謝通路分別注釋到代謝物 4 種，分別占注釋到的代謝物總數(shù) 4.76%；泛醌和其他萜醌生物合成通路、丙酸代謝通路、苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成通路、泛酸與輔酶 A 生物合成通路、賴氨酸生物合成通路、組氨酸代謝通路、乙醛酸和二羧酸代謝通路、甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝通路、谷胱甘肽代謝通路、半 乳糖代謝通路、咖啡因代謝通路分別注釋到代謝物 3種，分別占注釋到的代謝物總數(shù) 3.57%；纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的降解通路、色氨酸代謝通路、硫代謝通路、戊糖磷酸途徑通路、氮代謝通路、單菌素生物合成通路、賴氨酸降解通路、纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成通路、異喹啉生物堿 生物合成通路、吲哚生物堿生物 合成通路、C5-支二元酸代謝通路、氨基糖和核苷酸糖代謝通路分別注釋到代謝物 2 種，分別占注釋到的代謝物總數(shù) 2.38%；維生素 B6 代謝通路、托烷，哌啶和吡啶生物堿生物合成通路、硫胺代謝通路、?；撬岷痛闻；撬岽x通路、淀粉和蔗糖代謝通路、核黃素代謝通路、丙酮酸代謝通路、卟啉與葉綠素代謝通路、戊糖與葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化通路、氧化磷酸化通路、磷酸肌醇代謝通路、糖酵解/糖異生通路、果糖和甘露糖代謝通路、葉酸生物合成通路、三羧酸循環(huán)、光合作用生物的固碳作用、碳青霉烯類生物合成通路、生物素代謝通路、甜菜素生物合成通路、抗壞血酸和醛酸代謝通路、糖尿病并發(fā)癥中的 AGE-RAGE 信號(hào)通路、硫磺中繼系統(tǒng)分別注釋到代謝物 1 種，分別占注釋到的代謝物總數(shù) 1.19%。

2)差異代謝物 KEGG 富集

根據(jù)差異代謝物結(jié)果，進(jìn)行 KEGG 通路富集，其中 Rich factor 為差異表達(dá)的代謝物中在對(duì)應(yīng)通路中的個(gè)數(shù)與該通路檢測(cè)注釋到的代謝物總數(shù)作比，該值的大小說明了富集程度的大小。Pvalue 為超幾何檢驗(yàn) P 值。Pvalue 越接近于 0，表示富集越顯著。圖中點(diǎn)的大小代表富集到相應(yīng)通路上的差異顯著代謝物個(gè)數(shù)。結(jié)果如圖8 所示。共注釋到差異顯著代謝通路 20 個(gè)，分別為玉米素生物合成通路、泛醌和其他萜醌生物合成通路、酪氨酸代謝通路、色氨酸代謝通路、嘌呤代謝通路、丙酸代謝通路、苯丙氨酸代謝通路、戊糖磷酸途徑、泛酸與輔酶 A 生物合成通路、氮代謝通路、代謝通路、吲哚生物堿生物合成通路、半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路、咖啡因代謝通路、C5-支二元酸代謝通路、丁酸代謝通路、次生代謝生物合成通路、β-丙氨酸代謝通路、氨基糖和核苷酸糖代謝通路、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝通路，其中玉米素生物合成通路最顯著；代謝通路注釋到差異代謝物最多，次生代謝物生物合成通路次之。

圖8 差異代謝物 KEGG 富集圖

2.2 揮發(fā)性代謝物數(shù)據(jù)結(jié)果分析

2.2.1 基于主成分分析的揮發(fā)性代謝物差異性分析

本研究提取了 PC1 和 PC2 兩個(gè)主成分，其貢獻(xiàn)率分別為 66.97%和 20.48%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到 87.45%。在 PCA 記分圖中(圖9)，發(fā)酵組(FJ)和對(duì)照組(CK)被清楚地分開，重復(fù)的樣本在計(jì)分圖中分布較緊密(圖 9 a)，從而說明本研究可靠且具有較好的重復(fù)性。在 PCA 3D 圖中(圖 9 b)，可以更直觀地看到樣本的聚類。

圖9 分組主成分分析圖與三維圖

前 5 個(gè)主成分總貢獻(xiàn)率達(dá)到 100%，其中前兩個(gè)主成分總貢獻(xiàn)率接近 90%；各個(gè)主成分的可解釋變異表明，其中主成分 PCA1 和 PCA2 貢獻(xiàn)率分別為 66.97%和 20.48%，PCA3、PCA4、PCA5 貢獻(xiàn)率均低于 10%。

2.2.2 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)

1)OPLS-DA 模型概要

從 OPLS-DA 得分圖(圖 10)中可以看出發(fā)酵組(FJ)和對(duì)照組(CK)明顯分離開，預(yù)測(cè)主成分貢獻(xiàn)率達(dá)69.2%，說明兩組之間差異較大；正交主成分貢獻(xiàn)率僅為18.1%，說明組內(nèi)差異較小。

圖10 OPLS-DA 得分圖

2)OPLS-DA 模型驗(yàn)證

在本研究中，R2Y’和 Q2’均小于原始模型的R2Y 和 Q2，從而說明說明該模型有意義，并且 Q2>0.9，說明該模型是出色的模型，可根據(jù) VIP 值分析篩選其差異代謝物。

3)OPLS-DA S-plot

從 OPLS-DA 的 S-plot 圖(圖11)可以看出，橫坐標(biāo)表示主成分與代謝物的協(xié)方差，縱坐標(biāo)表示主成分與代謝物的相關(guān)系數(shù)，越靠近右上角和左下角的代謝物表示其差異越顯著，紅色的點(diǎn)表明這些代謝物的 VIP 值大于等于 1，綠色的點(diǎn)表示這些代謝物的VIP 值小于 1。本研究共檢測(cè)到揮發(fā)性代謝物 87 種。

圖11 OPLS-DA S-plot

2.2.3 差異代謝物篩選

1)差異代謝物火山圖

利用 OPLS-DA 模型進(jìn)行各分組比較，檢測(cè)到的揮發(fā)代謝產(chǎn)物中，在檢測(cè)到的 87 種揮發(fā)性代謝物中，上調(diào) 25 種，下調(diào) 8 種，差異不顯著代謝物 54 種，其中酯類 13 種(11 種上調(diào)、2 種下調(diào))、酸類 5 種(上調(diào))、酮類 3 種(1 種上調(diào)、2 種下調(diào))、烷類 3 種(2 種上調(diào)、1 種下調(diào))、醛類 3 種(1 種上調(diào)、2 種下調(diào))、酐類 1 種(上調(diào))、吡嗪類 1 種(上調(diào))、苯類 1 種(下調(diào))、烯類 1 種(上調(diào))、醇類 1 種(上調(diào))、酚類 1 種(上調(diào))。

2)差異代謝物聚類熱圖

利用揮發(fā)性差異代謝物聚類熱圖分析表明，發(fā)酵組中高含量差異代謝物明顯多于對(duì)照組，說明食用紅甜菜在發(fā)酵過程中，形成了更多的香氣成分。揮發(fā)性差異代謝物見表1。

表1 揮發(fā)性差異代謝物

在檢測(cè)到的揮發(fā)性差異代謝物中，1-氯-3-甲基-丁烷、甲乙酐、2-甲基-丁酸、乙酸異戊酯、丁內(nèi)酯、2,5-二甲基吡嗪、己酸乙酯、苯乙醛、2-乙基己酸、苯乙醇、2-丁基-2-乙基-1,3-二氧戊環(huán)、甲酸-2-苯乙酯、辛酸、4-乙酰氧基丁酸乙酯、乙酸香茅酯、苯乙酸乙酯、N-甲基-正丙氧基羰基甘氨酸己酯、壬酸、壬酸乙酯、間叔丁基苯酚、雙(1,3-二叔丁基環(huán)戊二烯基)鈷、正癸酸、9-癸烯酸乙酯、癸酸乙酯、2,6-雙(1,1-二甲基乙基)-2,5-環(huán)己二烯-1,4-二酮含量上調(diào)；鄰苯二甲酸二乙酯、2-甲基-壬烷、1,2,4-三甲基苯、2,2,6-三甲基-4H-1,3-二英-4-酮、壬醛、反式-2-壬醛、2,4,4-三甲基-3-(3-甲基丁基)環(huán)己-2-烯酮、2-甲基-3-羥基-2,2,4-三甲基丙酸戊酯含量下調(diào)。其中酯類 13 種(11 種上調(diào)、2 種下調(diào))、酮類 3 種(1 種上調(diào)、2 種下調(diào))、烷類 3 種(2 種上調(diào)、1 種下調(diào))、醛類 3 種(1 種上調(diào)、2 種下調(diào))。酸類 5 種、酐類 1 種、吡嗪類 1 種、烯類 1 種、醇類 1 種、酚類 1 種上調(diào)。苯類 1 種(下調(diào))。

在檢測(cè)到的 33 種揮發(fā)性差異代謝物中，酯類占了 13 種，占比 39%，說明酯類物質(zhì)是食用紅甜菜果酒的主要呈香物質(zhì)。其中乙酸異戊酯的香氣類型與香蕉香氣和梨的香氣相似，可用于配置香精和溶劑等；丁內(nèi)酯氣味芳香且獨(dú)特，通常應(yīng)用于食用香料的配制和重要的醫(yī)用中間體；己酸乙酯的香氣比較像濃郁的酒香，并且具有曲香、菠蘿香型的香氣，工業(yè)上常用于配制食品用香精、煙草香精以及用于調(diào)整曲酒的香氣；乙酸香茅酯的香氣類型為檸檬果香，并與玫瑰、薰衣草香氣相似，可用于調(diào)配各種花香型香精；苯乙酸乙酯的香氣類型為濃郁的蜂蜜型香氣，工業(yè)上主要用于制備各種花香型的日用香精；壬酸乙酯的香氣類型為水果型香氣以及玫瑰花香型的酒香，常用來制備食品香精和香水、化妝品等日用香精；癸酸乙酯的香氣類型表現(xiàn)為酒香和椰子香，在工業(yè)上主要用于制備食品用香精。這些酯類物質(zhì)與醇類、酮類、酸類等其他香氣成分相互作用，共同形成了食用紅甜菜酒的獨(dú)特風(fēng)味。

3 結(jié)論

初生代謝研究提取了 PC1 和 PC2 兩個(gè)主成分，其貢獻(xiàn)率分別為 75.85%和10.48%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到 86.33%。在 PCA 記分圖中，發(fā)酵組和對(duì)照組被清楚地分開，重復(fù)的樣本在計(jì)分圖中分布緊密，說明本實(shí)驗(yàn)可靠并且具有較好的重復(fù)性。

通過 OPLS-DA 驗(yàn)證，共檢測(cè)到初生代謝物 229 種，其中磷脂酰膽堿 1 種、溶血磷脂酰膽堿 2 種、甘油酯 2 種、維生素 7 種、游離脂肪酸 12 種、糖及醇類 19種、核苷酸及其衍生物 34 種、有機(jī)酸 38 種、酚酸類 43 種、氨基酸及其衍生物 71種。基于 OPLS-DA 的結(jié)果，通過 VIP 值進(jìn)行差異分析，得到差異顯著的代謝物140 種，上調(diào) 89 種，下調(diào) 51 種。

初生差異代謝物聚類分析表明發(fā)酵組(FJ)高含量差異代謝物超過 50%，明顯多于對(duì)照組(CK)；其中發(fā)酵組中的氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸、酚酸類物質(zhì)含量均高于對(duì)照組，對(duì)照組中的脂類物質(zhì)含量高于發(fā)酵組；核酸及其衍生物、其他類代謝物在兩組中的含量差別不明顯。

初生代謝物 KEGG 通路分類及富集分析表明，共注釋到代謝通路 67 個(gè)，其中代謝通路注釋到代謝物 64 種；次生代謝生物合成通路注釋到代謝物 29 種；氨基酸生物合成通路注釋到代謝物 14 種；ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)通路注釋到代謝物13 種；嘌呤代謝通路注釋到代謝物 11 種；其他代謝通路注釋到代謝物分別≤10 種。

初生代謝物 KEGG 富集注釋到顯著差異代謝物通路 20 個(gè)，其中玉米素生物合成通路最顯著，代謝通路注釋到差異代謝物最多，次生代謝物生物合成通路次之。揮發(fā)性代謝研究提取了 PC1 和 PC2 兩個(gè)主成分，其貢獻(xiàn)率分別為 66.97%和20.48%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到 87.45%。

通過 OPLS-DA 驗(yàn)證，共檢測(cè)到揮發(fā)性代謝物 87 種，基于 OPLS-DA 的結(jié)果，通過 VIP 值進(jìn)行差異分析，得到差異顯著的揮發(fā)性代謝物 33 種，上調(diào) 25 種，下調(diào) 8 種。

揮發(fā)性差異代謝物聚類分析表明，發(fā)酵組中高含量差異代謝物明顯多于對(duì)照組，說明食用紅甜菜在發(fā)酵過程中，形成了更多的香氣成分，其中酯類物質(zhì)占比最大，是食用紅甜菜酒的主要呈香物質(zhì)之一，食用紅甜菜酒中的各種香氣成分相互作用共同形成其獨(dú)特的風(fēng)味。