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        辣木籽多糖的研究進(jìn)展

        2021-03-29 22:14:06董成國羅成飛
        中國甜菜糖業(yè) 2021年4期

        董成國,羅成飛

        (哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院)

        0 前言

        多糖,又稱多聚糖,是一種高分子的聚合物,在自然界分布極廣,在植物、動物和微生物體內(nèi)均有存在。目前已報(bào)道的天然多糖化合物約有 300 多種,至少有 100 個(gè)以上的多糖正在進(jìn)行臨床試驗(yàn),分別用于抗腫瘤、抗糖尿病、降血脂等疾病的治療藥物或作為抗炎、抗病毒的藥物[1],現(xiàn)已有多種多糖藥物成功應(yīng)用于臨床,如香菇多糖、人參多糖及豬苓多糖[2]。多糖廣泛存在于生物體內(nèi),是除蛋白質(zhì)和核酸之外的一類重要的生物大分子,對維持生命機(jī)體正常運(yùn)行具有重要作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明多糖有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂和免疫調(diào)節(jié)等許多生理活性,且無毒副作用,成為食品科學(xué)、天然藥物、生物化學(xué)與生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。近年來,辣木多糖的研究也逐年多了起來。人們在辣木多糖含量、多糖種類、結(jié)構(gòu)、活性等方面的研究取得了較好的進(jìn)展。

        1 有關(guān)辣木的研究

        1.1 辣木及資源與分布

        辣木(Moringa oleifera)別名洋椿樹、鼓槌樹。屬于辣木科(Moringaceae),辣木屬(Moringa Adans.),多年生植物[3],由于其葉、籽、根和花均能食用,且具有增進(jìn)營養(yǎng)和食療保健功能,故被稱之為“神奇之樹”。國家衛(wèi)生部于 2012 年批準(zhǔn)辣木為新資源食品[4]。辣木主根粗壯,樹根膨大;樹冠傘形,主干直立,較脆;辣木葉為卵型、橢圓形或?qū)挋E圓形,無毛;花為兩性花,圓錐形花序,左右對稱腋生,具有獨(dú)特芳香氣味,開花時(shí)向下向外彎曲,花瓣呈白色或奶黃色;果實(shí)為三棱狀,成熟后呈褐色,種子為深褐色。

        辣木科只有 1 個(gè)辣木屬,目前全球已發(fā)現(xiàn) 14 個(gè)種,有 4 個(gè)種被成功馴化栽培。辣木主要分布在印度、中國、日本、埃及、埃塞俄比亞、肯尼亞、安哥拉、納米比亞、蘇丹,美國、墨西哥等 30 多個(gè)熱帶、亞熱帶國家和地區(qū)[5]。我國于 20 世紀(jì) 60 年引種,并在臺灣、廣東、海南、云南南部地區(qū)種植[5]。

        1.2 辣木有效成分研究進(jìn)展

        辣木油是從辣木種子里提取出的含有大量單不飽和脂肪酸的植物油脂[6],具有氧化穩(wěn)定性高,氧化誘導(dǎo)期長等優(yōu)點(diǎn)[7]。段瓊芬等[8]采用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)提取辣木籽油,結(jié)果表明辣木籽油主要由脂肪酸組成,其中油酸含量占 65.63%,并含有 1%~3%的飽和烴、醛和醚、酯,1.95%的菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和巖藻甾醇。劉紅等[9]采用無水乙醇和乙酸乙酯萃取辣木籽油并通過色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)分析其化學(xué)成分,得出 2 種方法萃取的主要化學(xué)成分是油酸、異油酸、反油酸、甘油單油酸酯和棕櫚酸。

        辣木蛋白是一種極具開發(fā)價(jià)值的功能性成分。研究表明,辣木含有大量的蛋白質(zhì),可作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源加以開發(fā)利用。辣木葉粉中蛋白質(zhì)可與大豆相媲美。樊建麟等[10]研究表明,辣木籽中含有 17 種氨基酸,其中必需氨基酸占總氨基酸含量的 35.20%。

        辣木黃酮是辣木中主要功能性成分之一[11-13]。Vongsak 等[14]應(yīng)用傳統(tǒng)的提取技術(shù)提取辣木中的黃酮類物質(zhì),發(fā)現(xiàn) 70 %的乙醇溶液浸泡提取可獲得最大的提取率,同時(shí)提取液的抗氧化性也最高。王苗苗等[15]采用超聲波輔助提取辣木葉總黃酮,并利用響應(yīng)面法對提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,在最佳工藝條件下總黃酮提取率為 5.17 %。梁鵬等[16]以辣木莖葉干粉為原料,采用水為提取劑,辣木粗多糖的提取率為 5.66 %。Asghari 等[17]對辣木干葉和種子的有效成分的研究顯示,辣木富含維生素 C 和維生素 A。其中維生素 C 含量在干葉及種子中的含量分別為 83±0.5,14±0.6 mg/100 g;維生素 A 的含量分別為 6.8±0.7,24.8±0.7 mg/100 g。

        2 辣木多糖的研究現(xiàn)狀

        2.1 多糖的提取

        目前植物多糖的提取方法包括傳統(tǒng)的熱水浸提法、酸提取法、堿提取法和酶提取法,現(xiàn)代新興技術(shù)包括超聲提取法[18,19]、微波提取法[20]、超高壓法[21]、脈沖電場[22]及傳統(tǒng)與現(xiàn)代相結(jié)合的多技術(shù)聯(lián)合使用方法[23-25]。以下簡述幾種最常采用的提取方法的原理和各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

        2.1.1 熱水浸提法

        水是強(qiáng)極性溶劑,對植物組織的滲透力強(qiáng),可利用多糖溶于水而不溶于高濃度醇溶液的性質(zhì)將多糖提取出來。影響多糖提取率的因素較多,大多數(shù)研究采用正交設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法對不同多糖的熱水浸提工藝條件進(jìn)行優(yōu)化[26]。熱水浸提法成本低,安全,在分離提取中應(yīng)用最為廣泛[27],但提取率不高。

        2.1.2 酸、堿提取法

        酸、堿提取法利用植物的細(xì)胞、細(xì)胞壁在酸性和堿性的溶液中溶脹、破裂而使多糖溶出,提高多糖的提取率,但酸堿提取法有其特殊性,因多糖的不同而異。在提取過程中應(yīng)嚴(yán)格控制酸堿度,避免多糖的糖苷鍵發(fā)生斷裂,提取后提取液應(yīng)迅速中和或者進(jìn)行透析。

        2.1.3 生物酶提取法

        生物酶提取法是在提取過程中加入相應(yīng)的酶來分解細(xì)胞壁,從而加速多糖的釋放,提高多糖提取率。酶法提取條件溫和,耗時(shí)短,去雜質(zhì)容易,對多糖的結(jié)構(gòu)破壞性較小等優(yōu)點(diǎn),但缺陷在于成本高,對設(shè)備要求高,不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

        2.1.4 超聲輔助提取法

        超聲輔助提取法是利用超聲波產(chǎn)生強(qiáng)烈的機(jī)械效應(yīng)、熱學(xué)效應(yīng)以及空化作用,導(dǎo)致細(xì)胞壁破碎,增加提取液的穿透力,加速胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶出。超聲提取法具有提取效率高的優(yōu)點(diǎn),但超聲可能會導(dǎo)致多糖分子結(jié)構(gòu)的改變。

        2.1.5 微波輔助提取法

        微波提取法是通過微波作用使細(xì)胞內(nèi)的極性分子迅速吸收能量,產(chǎn)生大量的熱量,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溫度升高,壓力增大,使細(xì)胞壁破裂,加速細(xì)胞內(nèi)部的有效成分釋放,傳遞轉(zhuǎn)移到溶劑周圍被溶劑溶解。此法提取時(shí)間短,提取率高。

        2.2 多糖的純化

        多糖提取物中含有許多雜質(zhì)需要除去。一般首先利用多糖難溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn),用丙酮或乙醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行反復(fù)洗滌沉淀,除去一些醇溶性物質(zhì)。此外,多糖提取物中常含有蛋白質(zhì)、色素等非多糖組分。

        2.2.1 脫蛋白

        粗多糖中常含有大分子蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)與多糖結(jié)合,形成糖蛋白。脫除粗多糖中的蛋白,是多糖分離純化中一大難題,但非常重要。目前,脫除蛋白的主要方法有化學(xué)法、物理法和生物法?;瘜W(xué)法包括 Sevage法、三氯乙酸法[28]等。Sevage 法是利用蛋白質(zhì)在氯仿等有機(jī)溶劑中變形的特點(diǎn),使蛋白質(zhì)發(fā)生變性沉淀,通過離心得方法將粗多糖中的蛋白質(zhì)除去。該法條件溫和,可避免多糖的降解。但該法需要反復(fù)處理多次,才能達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。多糖常因多次處理而損失。近年來,有不少研究結(jié)果表明,利用生物酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈蛋白酶等)將樣品中蛋白質(zhì)部分降解后,再利用 Sevage 法脫蛋白效果更好。三氟三氯乙烷法脫蛋白效率較高,但具有易揮發(fā),不易出盡的缺點(diǎn)。物理法包括大孔吸附樹脂法、等電點(diǎn)沉淀法等。生物法主要是利用生物酶對蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解,從而達(dá)到脫除蛋白質(zhì)的目的[29]。

        2.2.2 脫色

        植物多糖中含有的色素,其中包括游離色素和結(jié)合色素。根據(jù)不同色素類型采用不同的除色素方法。常見的脫色方法有離子交換法、氧化法、金屬絡(luò)合物法、吸附法[30]。過氧化氫是一種氧化脫色劑,該法容易引起多糖的降解,所以需要在低溫下操作,且過氧化氫濃度不宜過高。吸附法是利用活性炭、硅藻土等的物理吸附作用達(dá)到脫色的目的。對于同時(shí)含有游離蛋白和色素的多糖,可通過生成金屬絡(luò)合物的方法,加入菲林試劑生成不溶性絡(luò)合物,經(jīng)分離后用陰離子交換樹脂分解絡(luò)合物[1]。

        2.2.3 脫小分子物質(zhì)

        對于一些小分子物質(zhì),如無機(jī)鹽、脫蛋白殘留溶劑、低聚糖等可通過透析法除去。此法操作簡單,但耗時(shí)長,處理量少。在后續(xù)的離子交換樹脂柱層析和凝膠過濾柱層析中也可以將小分子物質(zhì)除去。

        2.3 多糖的分離

        2.3.1 分級沉淀法

        根據(jù)多糖在不同濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度不同進(jìn)行分離,常用的沉淀劑包括甲醇、丙酮、乙醇和異丙醇等。此法分離出的多糖多為多糖混合物。

        2.3.2 膜分離法

        膜分離主要包括超濾、微濾和納濾,通過在膜兩側(cè)施加推動力,使處理液中的組分選擇性的透過膜,從而實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的分離[31]。該法不涉及相變,無二次污染,且操作方便、是現(xiàn)代分離技術(shù)中效率較高的分離手段。

        2.3.3 色譜分離法

        色譜分離是根據(jù)多糖中各組分在固定相和流動相之間的分布和流動速度不同來進(jìn)行分離的一種方法[32]。主要包括離子交換色譜法和凝膠色譜法。離子交換是一個(gè)離子的吸附和解吸的過程,常用的陰離子交換劑有 DEAE-纖維素,DEAE-瓊脂糖和 DEAE-葡萄糖,流動相可用水和不同濃度的緩沖鹽溶液。陰離子交換色譜法適用于各種酸性、中性多糖和粘多糖的分離純化。凝膠色譜是根據(jù)多糖的分子量大小不同而分離的方法,常用的凝膠有瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠等,流動相為不同濃度的鹽溶液和緩沖液[33,34]。

        2.3.4 多糖的純度及分子量測定

        目前,多糖純度鑒定的方法有 HPLC 法、毛細(xì)管電泳法、凝膠柱層析法、薄層層析法等。純度鑒定需要用兩種以上的方法才能證明多糖樣品的均一性。其中 HPLC 法和凝膠柱層析法是常用的方法。應(yīng)用 HPLC 法時(shí),需要多糖樣品的 HPLC 譜圖為單一對稱峰,凝膠柱層析法需要多糖洗脫曲線呈現(xiàn)單一對稱峰。

        多糖的分子量測定是多糖研究中重要的一項(xiàng)工作,多糖的性質(zhì)往往與它的分子量有關(guān)。目前,多糖分子量的測定方法有:凝膠過濾發(fā)、質(zhì)譜法、粘度法、散射法、滲透壓法、蒸汽壓法等。凝膠過濾法是較為常用的方法。通過測定多糖樣品的保留時(shí)間 tR,根據(jù)分子量已知的標(biāo)準(zhǔn)品的 tR,計(jì)算出樣品的分子量。

        2.3.5 多糖的結(jié)構(gòu)解析

        多糖作為天然的生物大分子,其結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成是影響其生物活性和理化性質(zhì)的關(guān)鍵因素。目前對多糖的一級結(jié)構(gòu)的分析方法有化學(xué)方法、儀器檢測法、生物法。多糖一級結(jié)構(gòu)的分析中大多采用化學(xué)法和儀器檢測法相結(jié)合,可基本闡明某一多糖的一級結(jié)構(gòu)的大致特征。而多糖高級結(jié)構(gòu)的分析方法主要是物理方法,如 X 射線纖維衍射、核磁共振、電子衍射等。以下簡述多糖一級結(jié)構(gòu)的分析方法及其原理。

        3 辣木多糖的生物活性研究進(jìn)展

        植物多糖具有廣泛的生物活性,并能通過免疫調(diào)節(jié)作用發(fā)揮多種生理活性,近 20 年來,已經(jīng)有大量研究對多糖的生物活性進(jìn)行報(bào)道。如香菇多糖的免疫調(diào)節(jié)功能,它可作為 T 細(xì)胞定位的佐劑和輔 T細(xì)胞刺激參與機(jī)體免疫反應(yīng)。一方面他能激活腹腔巨噬細(xì)胞的殺傷抗原能力,另一方面能恢復(fù)免疫功能,特別是能恢復(fù) T 協(xié)助細(xì)胞的活性,同時(shí)提高抗胸腺依賴性抗原的體液性抗體水平。在抗氧化活性方面,現(xiàn)有的研究表明,許多植物多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化等活性,起到保護(hù)生物膜和延緩衰老的作用。在抗腫瘤活性方面,植物多糖的抗腫瘤活性是通過提高機(jī)體免疫力或抑制腫瘤 DNA、RNA 的合成來實(shí)現(xiàn),因此,植物多糖具有不損傷正常細(xì)胞,而且無毒的優(yōu)點(diǎn)。在降血糖活性方面,植物多糖的降血糖活性的機(jī)理可概括為:促進(jìn)機(jī)體內(nèi)部的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn),刺激機(jī)體外周圍組織和加強(qiáng)靶器官對糖的利用,降低血漿中甘油三酯和膽固醇,保護(hù)胰島 β 細(xì)胞。通過影響糖代謝酶的活性,從而促進(jìn)湯圓合成或抑制肝糖異生等。除了以上所述活性外,植物多糖還具有很多其他的生物學(xué)功能。如降血脂活性、抗疲勞活性、抗病毒、抗炎活性等。

        3.1 抗氧化性

        辣木的各部位多糖提取物均具有體外抗氧化活性,已有研究表明多糖具有清除活性氧(ROS)自由基的能力。梁鵬[35]等人研究了辣木莖葉中水溶性多糖的抗氧化活性,試驗(yàn)得出多糖提取物對羥基自由基(OH-·)和超氧陰離子(O2-·)都有清除作用,且存在著劑量-效應(yīng)關(guān)系。岳秀潔[36]對辣木葉多糖進(jìn)行抗氧化性試驗(yàn),得出多糖對氧自由基有吸收能力,對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)、OH-·、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽自由基(ABTS+·)均有較好清除效果,且存在明顯的量效關(guān)系;董成國[37]試驗(yàn)證明辣木籽水溶性多糖對ABTS+·、OH-·有較好的清除能力,且粗多糖的抗氧化能力要高于精多糖。馬波[38]對辣木多糖進(jìn)行乙?;揎?,改性后清除O2-·和OH-·能力顯著增強(qiáng)。王瑞琴等[39]體外抗氧化活性結(jié)果表明辣木葉多糖具有良好抗氧化活性。胡玲華[40]體外抗氧化性活性研究結(jié)果表明:5.0 mg/mL的辣木籽多糖對羥自由基的清除率為91.1%;質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的辣木籽多糖,對1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)的清除率可以達(dá)到38%;質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的辣木籽多糖對超氧化陰離子的清除率可以達(dá)到59%。

        3.2 降血糖

        辣木多糖有降血糖的功效。汪芳[41]采用HepG2細(xì)胞建立胰島素抵抗模型,以細(xì)胞葡萄糖消耗量為指標(biāo),考察辣木葉多糖的降糖作用。結(jié)果表明,辣木葉多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖及半乳糖組成。與模型組相比,辣木葉多糖組分MOs-2-a、MOs-2-b均能顯著增加胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗量(P<0.05)。認(rèn)為辣木葉多糖MOs-2-a、MOs-2-b具有良好的降糖效果。岳秀潔[36]試驗(yàn)證明印度傳統(tǒng)辣木葉多糖對豬胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用,且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。汪芳[41]實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明辣木葉多糖具有良好的降糖效果,他應(yīng)用HepG2細(xì)胞建立出胰島素抵抗模型,以細(xì)胞葡萄糖消耗量為指標(biāo)得出此結(jié)論。

        3.3 抗病毒

        辣木多糖具有較好的抗病毒活性。杜洋[42]采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法對辣木多糖抗丙型肝炎病毒(HCV)的活性進(jìn)行研究,結(jié)果表明,試驗(yàn)中得出濃度在安全濃度范圍內(nèi),辣木多糖對人肝癌細(xì)胞(Huh7.5.1)細(xì)胞無毒性作用,運(yùn)用熒光PCR法測定得到辣木多糖對HCV有一定的抗病毒活性,同時(shí)采用先加多糖后加病毒的作用方式優(yōu)于其他兩種方式,并且多糖的最適濃度為62.5 μg/mL,存在一定的濃度依賴性。

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