趙國旺 齊家龍 付 萍

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，昆明 650101）

抗Ro52抗體是干燥綜合征（Sj?gren's syndrome，SS）的特異性自身抗體，發(fā)生率約為66.7%，其與口眼干燥癥及淋巴瘤呈正性相關(guān)；然而抗Ro52抗體在其他自身免疫性疾病中也常有表達，如：約有30%系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者表達抗Ro52抗體，這一抗體與狼瘡患者的皮膚光敏密切相關(guān)［1］；約有20%特發(fā)性炎癥性肌病（idiopathic inflammatory myopathies，IIM）患者表達抗Ro52抗體，并且約有14%的免疫性肌炎中可以單獨檢測到抗Ro52抗體［2-3］，抗Jo-1抗體陽性的肌炎患者中抗Ro52 抗體同時出現(xiàn)的概率約為70%。與單獨的抗Jo-1抗體陽性的患者相比，同時表達抗Ro52抗體和抗Jo-1 抗體的患者的肌炎和關(guān)節(jié)癥狀更重，預(yù)后不良的肺間質(zhì)纖維化和腫瘤的發(fā)生率更高［4］。而且IgM 型抗磷脂酰抗體可以降低SLE 活動度及減少器官損害，IgM 型抗ds-DNA 抗體可以降低SLE 患者腎損害的發(fā)病率，同時對狼瘡鼠也具有治療作用［5］。另外，以細胞凋亡相關(guān)抗原為靶抗原的IgM 型自身抗體對SLE 患者也具有保護作用，其與疾病的活動性、器官損害及心血管事件發(fā)生率呈負相關(guān)［6］。IgA、IgE 和大多數(shù)IgG 型自身抗體參與疾病的發(fā)病機制，其中IgA和IgE型自身抗體可能參與了狼瘡性腎炎的發(fā)病及進展［7-8］；研究表明母親抗Ro52 抗體的IgG型與新生兒狼瘡的房室傳導(dǎo)阻滯密切相關(guān)［9］。所以本研究旨在研究不同抗Ro52 抗體亞型與不同臨床表現(xiàn)之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 樣本收集 收集2015年1月至2017年10月于昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科明確診斷為SLE/SS/IIM 且抗Ro52 抗體陽性的住院患者1 ml血清標本和病例各50/30/30 份作為實驗組；及明確診斷為SLE/IIM 且抗Ro52 抗體陰性的住院患者病例分別50/30 份，作為對照組。所有入組患者分別符合2012 年國際狼瘡研究臨床協(xié)作組制定的SLE 分類標準、2016 年美國風(fēng)濕病學(xué)會/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟制定的pSS 分類標準、2017 年歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟/美國風(fēng)濕病學(xué)會關(guān)于成人IIM的分類標準。

1.1.2 主要材料 pThioHISA 由本實驗室構(gòu)建，大腸桿菌BL21、ER2566 由本實驗室保存，TRIM21 基因（Cat.No：SM0331）由上海生工生物公司優(yōu)化并合成。Anti-TRIM21 抗體、山羊Anti-Human IgG/A/M H&L（HRP）購自Abcam 公司，KOD DNA 聚合酶購自ToYoBo 公司；T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶為TaKaRa公司的產(chǎn)品，質(zhì)粒小提試劑盒云南杰美科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組pThioHISA-TRIM21 質(zhì)粒的構(gòu)建TRIM21 全基因由生工生物工程（上海）股份有限公司優(yōu)化并合成，得到含有目的基因的重組質(zhì)粒pUC57-TRIM21。以質(zhì)粒pUC57-TRIM21 為模板，設(shè)計分別帶有限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SacⅠ位點的上下游引物（上游：5'-TTTAACGGCACACTTGAC-3'；下游：5'-CTAGAGATGGAGAGGAGA-3'）。通過分子克隆方法將目的基因插入表達載體pThioHISA 中，構(gòu)建pThioHISA-TRIM21質(zhì)粒。

1.2.2 重組TRIM21 的表達與純化 取-20℃保存菌液10 μl 于5 ml LB 培養(yǎng)基內(nèi)活化，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)8～12 h。將活化的菌液加入無菌的LB 培養(yǎng)基內(nèi)，并加入氨芐青霉素；將培養(yǎng)基置于37℃大搖床內(nèi)，180 r/min 振蕩培養(yǎng)6～8 h，去除少量菌液測定OD600在0.6 左右時，降低溫度培養(yǎng)。搖瓶內(nèi)菌液的溫度降至誘導(dǎo)溫度時，按照1∶1 000 比例加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)8～10 h?；厥站w，8 000 g離心15 min，去除菌液上清。超聲裂解破碎菌體重懸液，分別取適量上清與沉淀進行SDS-PAGE分析及Western blot驗證。將可溶性蛋白通過不同梯度濃度尿素進行純化和復(fù)性。

1.2.3 Western blot 驗證 將重組TRIM21 抗原做樣，進行SDS-PAGE 膠分析，待樣品快跑出膠時將膠取出，浸泡在1×的電轉(zhuǎn)液里面。打開電轉(zhuǎn)儀器去離子水清洗干凈，鋪上一層大小與膠相當，使用電轉(zhuǎn)液浸潤的濾紙，在上面鋪上一層硝酸纖維素膜，將膠平鋪在膜上，最后蓋上一層濾紙，保證每層膜之間沒有氣泡。連接電源，按照每塊膠電流為35 mA設(shè)定參數(shù)，時間為1 h。轉(zhuǎn)膜完成后，將硝酸纖維素膜取出浸泡在脫脂奶封閉液中，室溫封閉2 h。封閉完成后使用TNT（即在TN 緩沖液中加入Tween-20至0.05%）清洗1 遍，按照1∶3 000 稀釋中和 抗TRIM21單抗作為一抗，室溫孵育45 min。一抗孵育完成后，使用TNT 清洗5 遍，每遍3 min。加入HRP標記的山羊抗小鼠抗體作為二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。酶標二抗體孵育完成后，使用TNT清洗5遍，每遍3 min。清洗完成后進行化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.4 ELISA 實驗 采用重組TRIM21 作為抗原，使用1*CB作為包被緩沖液，包被濃度為100 ng/孔，體積為100 μl/孔，37℃培養(yǎng)箱包被2 h 后置于4℃冷庫過夜。采用4%的明膠作為封閉液，200 μl/孔，37℃封閉2 h。使用20%NBS 為樣品稀釋液，稀釋100 倍。將稀釋好的血清100 μl/孔轉(zhuǎn)移至包被有抗原的KE 板內(nèi)，用封板膜封住，防止液體揮發(fā)及污染，并置于37℃恒溫箱內(nèi)孵育45 min。揭掉封板膜后使用PBST 清洗5 遍，甩干/拍干板內(nèi)殘留液體。加入100 μl/孔酶標二抗GAM-HRP（1∶5 000），蓋上封板膜37℃孵育1 h。揭掉封板膜后使用PBST清洗5 遍，甩干/拍干板內(nèi)殘留液體。加入顯色液（A∶B=1∶1）100 μl/孔，顯色15 min，加入終止液50 μl/孔，反應(yīng)5 min后，酶標儀于450 nm處讀取各孔OD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism7 統(tǒng)計軟件進行分析。正態(tài)分布均采用表示。兩組之間比較采用t檢驗；多組之間比較采用方差分析。計數(shù)資料采用卡方檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIM21（Ro52）表達和純化

2.1.1 TRIM21表達質(zhì)粒鑒定TRIM21，總共1 440 bp，大約50 kD，當連接在pHisA 載體上時，總共大約66 kD。pThioHISA-TRIM21 質(zhì)粒經(jīng)EcoR Ⅰ和Sac Ⅰ雙酶切后可見大小約1 440 bp 的目的條帶，與理論的條帶位置大小相同。經(jīng)PCR 鑒定及合成的TRIM21基因（由公司合成Puc57-TRIM21）作為對照，顯示目的基因片段已經(jīng)正確插入表達載體中，可進行目的蛋白的表達純化工作（圖1）。

圖1 重組pThioHISA-TRIM21質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定Fig.1 Construction and identification of recombinant pThioHISA-TRIM21 plasmid

2.1.2 TRIM21 表達與鑒定 選取鑒定正確的TRIM21 表達質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化ER2566 菌株及BL21 菌株，并挑選陽性克隆進行誘導(dǎo)表達，表達結(jié)果如圖2所示。所挑選的克隆在66 kD 大小位置，相較于BL21及ER2566菌體蛋白均有明顯的目的蛋白的表達，與理論分子量相當。

圖2 TRIM21表達與鑒定Fig.2 Expression and identification of TRIM21

2.1.3 TRIM21 蛋白純化與鑒定 對蛋白大量表達時發(fā)現(xiàn)，在30℃及18℃兩個溫度下誘導(dǎo)表達，蛋白均是以包涵體形式存在。純化采用不同濃度的尿素吹溶后進行梯度透析復(fù)性，即可去除大量菌體自身的蛋白。本研究采用Western blot進行驗證，結(jié)果如圖3、4所示。

圖3 蛋白純化Fig.3 Purification of protein

2.1.4 TRIM21 蛋白復(fù)性及鑒定 對不同濃度尿素吹溶初步純化并鑒定好的蛋白做梯度透析復(fù)性，并對其進行Western blot 驗證，結(jié)果如圖5 所示。目的條帶顯色明顯且具有明顯的特異性，為接下來的間接ELISA 實驗做好了必需的特異性TRIM21抗原。

圖4 蛋白純化與鑒定Fig.4 Purification and identification of protein

圖5 蛋白復(fù)性與鑒定Fig.5 Renaturation and identification of protein

2.2 抗Ro52抗體亞型的ELISA檢測

2.2.1 110份血清樣本中（包括SLE 50份、SS 30份、IIM 30 份），抗Ro52 抗體亞型IgG 的水平明顯高于IgM（P＜0.000 1）和IgA（P＜0.000 1）的水平；且IgM的水平也明顯高于IgA的水平（P＜0.000 1）。見表1。

2.2.2 ①在50 份SLE 血清中，抗Ro52 抗體亞型IgG 水平高于IgM（P＜0.000 1）和IgA（P＜0.000 1）；而IgM 與IgA 之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.140 0）。②在30 份SS 血清中，抗Ro52 抗體亞型IgG 水平高于IgM（P＜0.000 1）和IgA（P＜0.000 1）；而IgM與IgA之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.551 3）。③在30 份IIM 血清中，抗Ro52 抗體亞型IgA 水平低于IgG（P=0.000 2）和IgM（P＜0.000 1）；而IgG 與IgM 之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.061 0）。見表1。

表1 ELISA測定中各組分IgG/ IgM/ IgA的OD值（）Tab.1 OD value of IgG/ IgM/ IgA of each component was determined by ELISA（）

表1 ELISA測定中各組分IgG/ IgM/ IgA的OD值（）Tab.1 OD value of IgG/ IgM/ IgA of each component was determined by ELISA（）

2.3 病例統(tǒng)計結(jié)果

2.3.1 ①在50 份被檢測的抗Ro52 抗體陽性的SLE患者中抗Ro52抗體陽性患者的狼瘡活動度評分（systemic lupus erythematosus activity indexes，SLEDAI）在IgG型與非IgG型（即IgM和IgA）中無明顯差異（采用t檢驗，P=0.337 6）。狼瘡性腎炎（lupus nepphritis，LN）（P=0.560 2）、血小板（platelet，PLT）降低（P=0.252 0）、皮疹的發(fā)生率（P=0.568 3）在IgG型與非IgG型之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而IgG型患者關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率低于非IgG 型（P=0.045 1）（采用χ2檢驗）。②50 份抗Ro52 抗體陽性與50 份抗Ro52 抗體陰性的SLE 患者中SLEDAI 評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（采用t檢驗，P=0.219 7）。LN（P=0.836 9）、PLT降低（P=0.689 3）、皮疹的發(fā)生率（P＞0.999 9）無明顯差異，而抗Ro52抗體陽性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率高于陰性患者（P=0.001 8）（采用χ2檢驗）。見表2。

表2 anti-Ro52（+）/（-）SLE（各50份）相關(guān)指標的差異Tab.2 Differences in related indicators of anti-RO52（+）/（-）SLE（50 copies each）

2.3.2 在30 份被檢測的抗Ro52 抗體陽性的SS 患者中干燥綜合征疾病活動度評分（EULAR primary Sj?gren's syndrome disease activity indexes，ESSDAI）在IgG 型與非IgG 型抗Ro52抗體陽性患者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（采用t檢驗，P=0.144 7）。IgG 升高（P=0.418 9）、肺間質(zhì)病變（interstitial lung disease，ILD）（P=0.670 7）的發(fā)生率在IgG型與非IgG型患者之間無明顯差異（采用χ2檢驗）。

2.3.3 ①在30 份被檢測的抗Ro52 抗體陽性的IIM患者中肌炎活動度（myositis activity indexes，MDI）（P=0.170 3）、肌炎皮損嚴重指數(shù)（cutaneous dermatomyositis disease area and severity index，CDASI）（活動性）（P=0.667 8）、CDASI（損傷性）（P=0.446 4）在IgG 型與非IgG 型抗Ro52 抗體患者中無明顯差異（采用t檢驗）；而IgG 型患者ILD 的發(fā)生率較高（采用χ2檢驗，P=0.026 1）。②在30 份抗Ro52 抗體陽性與30 份抗Ro52 抗體陰性IIM 患者中抗Ro52 抗體陽性患者MDI 高于陰性患者（P=0.007 7），CDASI（活動性）（P=0.055 1）、CDASI（損傷性）（P=0.540 8）在二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（采用t檢驗）；而抗Ro52 抗體陽性患者ILD 的發(fā)生率高于陰性患者（采用χ2檢驗，P=0.022 1）。

3 討論

本研究通過納入110 例抗Ro52 抗體陽性患者血清樣本（包括SLE 50 份、SS 30 份、IIM 30 份）及190 份病歷資料（包括SLE Ro52+/-各50 份、SS Ro52+30 份、IIM Ro52+/-各30 份）。旨在研究不同臨床表現(xiàn)與抗Ro52 抗體的表達及該抗體亞型之間的相關(guān)性。在110 份總樣本中，抗Ro52 抗體亞型IgG的水平明顯高于IgM和IgA的水平（P＜0.000 1）；而且在50 份SLE 樣本中，亞型IgG 水平高于IgM（P＜0.000 1）、IgA（P＜0.000 1）；30 份SS 中，亞型IgG 水平高于IgM（P＜0.000 1）和IgA（P＜0.000 1）；30 份IIM 中，亞型IgA 水平低于IgG（P=0.000 2）和IgM（P＜0.000 1）；而IgG 與IgM 之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.061 0）。結(jié)果表明不管在總樣本中還是不同病種中，抗Ro52 抗體亞型都是以IgG 為主。研究表明母親抗Ro52 抗體的IgG 型與新生兒狼瘡的房室傳導(dǎo)阻滯密切相關(guān)［9］，該抗體IgG 型主要抗Ro52 蛋白的氨基酸序列200～239，而此序列正位于Ro52 蛋白卷曲結(jié)構(gòu)域中［10］，也許表明該結(jié)構(gòu)域是Ro52蛋白的主要抗原表位。然而目前研究僅表明此結(jié)構(gòu)域與Ro52蛋白細胞質(zhì)定位密切相關(guān)，所以還需進一步針對該蛋白不同結(jié)構(gòu)域的功能進行研究。

本研究中還有一有趣發(fā)現(xiàn)，即在SLE 患者中抗Ro52 抗體陽性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率高于陰性患者（P=0.001 8）（采用χ2檢驗），且IgG型患者關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率低于非IgG 型（P=0.045 1）（采用χ2檢驗）；有研究表明IIM 患者中，關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率與抗Ro52 抗體正相關(guān)［11］。在IIM 患者中抗Ro52抗體陽性患者ILD的發(fā)生率較高（采用χ2檢驗，P=0.022 1），這與SRIVASTAVA 等［11］研究結(jié)果一致。且本研究還發(fā)現(xiàn)IgG型患者ILD 的發(fā)生率高（采用χ2檢驗，P=0.026 1）。而在SS 中，ILD 的發(fā)生率與抗Ro52 抗體的亞型無關(guān)，且CLANCY 等［12］和MIRANDA 等［13］研究表明：SS患者中，ILD 與抗Ro52 抗體不相關(guān)；再者，本研究中SS 患者中的抗Ro52 抗體亞型主要是以IgG 型為主。另外，本研究中抗Ro52抗體陽性SLE 患者的白細胞減少發(fā)生率較陰性者高（與MENOR［14］和BROUWER等［15］研究結(jié)果一致）；抗Ro52 抗體陽性IIM 患者的MDI評分較陰性者高；但都與該抗體亞型沒有關(guān)聯(lián)。所以這些結(jié)果似乎表明抗Ro52 抗體在不同疾病中具有不同的致病性，即使同一亞型（如IgG 型）在不同的疾病內(nèi)環(huán)境下也能導(dǎo)致不同臨床表現(xiàn)；如前所述該抗體IgG 型靶抗原表位主要是位于Ro52 蛋白卷曲結(jié)構(gòu)域中，所以不同疾病自身炎癥環(huán)境和基因背景可能是導(dǎo)致不同臨床表現(xiàn)的關(guān)鍵因素。但是至今為止，對即使在同一疾病中抗Ro52抗體的致病機制都知之甚少。其是否是通過作用于靶蛋白Ro52 而介導(dǎo)致??？目前為止只有體外研究顯示抗Ro52 抗體能夠結(jié)合Ro52 的RING 結(jié)構(gòu)域從而抑制Ro52介導(dǎo)的泛素化而積極地參與自身免疫疾?。?6］；還是直接致??？有研究表明抗Ro52 抗體能直接結(jié)合心肌細胞，導(dǎo)致胎兒房室結(jié)傳導(dǎo)時間的延長，導(dǎo)致患兒先天性心臟傳導(dǎo)阻滯［17］；還是通過IC 形式參與致病？IC 能被漿細胞樣樹突狀細胞吞噬轉(zhuǎn)位到核內(nèi)體并刺激TLR7 或TLR9 活化，導(dǎo)致IFN-α 的大量釋放；還是與其相關(guān)多重機制共同介導(dǎo)？如本實驗研究結(jié)果表明，相關(guān)臨床表現(xiàn)不僅與抗Ro52抗體相關(guān)，還與該抗體的亞型有關(guān)。所以也許抗Ro52抗體不同亞型所針對不同Ro52 蛋白結(jié)構(gòu)域在不同疾病中所導(dǎo)致的致病機制也不盡相同。但由于本實驗樣本量有限未能統(tǒng)計出更多的臨床表現(xiàn)與抗Ro52抗體亞型的相關(guān)性，故在后續(xù)研究中加大樣本量至關(guān)重要，這樣才能繼續(xù)深入研究該抗體的亞型與更多的臨床表現(xiàn)及實驗室指標之間的相關(guān)性，使其亞型成為臨床預(yù)測的重要指標，從而為該抗體致病性的基礎(chǔ)研究做好鋪墊。