趙 捷 李小雪 葛逸盟 馬彩紅 李 蓉

（北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心，北京 100191）

全球約1.86 億人口和8%～12%的育齡夫婦患有不孕不育，盡管體外受精-胚胎移植技術(shù)（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）成為治療不孕癥的有效手段，但仍有8%～10%的患者經(jīng)歷著反復(fù)著床失敗（repeated implantation failure，RIF）而未能成功妊娠［1］。目前RIF 尚無(wú)統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，廣泛認(rèn)同的定義是：年齡＜40 歲的女性，至少經(jīng)過(guò)3 次新鮮或者凍融胚胎移植周期，累計(jì)至少移植4 枚優(yōu)質(zhì)胚胎而未能獲得臨床妊娠為RIF［2］。

作為生殖領(lǐng)域的難點(diǎn)，RIF 患者病因不明，難以查找，因此無(wú)有效的處理手段。目前認(rèn)為50%～60%的RIF 可能與子宮內(nèi)膜局部免疫相關(guān)，但臨床常用相關(guān)抗體檢查只能篩出合并有自身免疫性疾病的患者進(jìn)行免疫治療，而對(duì)于非合并自身免疫疾病患者的治療，則不能提供治療依據(jù)［3］。雖然目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)指南或共識(shí)，嘗試性應(yīng)用阿司匹林或免疫抑制劑已廣泛應(yīng)用于臨床RIF 患者的治療，有研究認(rèn)為預(yù)防性口服阿司匹林或者聯(lián)合應(yīng)用強(qiáng)的松可作為有效的治療手段，但另有研究得出不一致的結(jié)果［4-8］，為了解目前臨床常用抗體檢查與預(yù)防性治療之間的關(guān)系，本課題組進(jìn)行了該回顧性研究。

1 資料與方法

1.1 資料 回顧性分析2016年1月至2017年12月在北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心因RIF行解凍移植的患者臨床資料，所有患者信息來(lái)源于患者病歷、醫(yī)院信息中心與生殖中心數(shù)據(jù)庫(kù)。該回顧性研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，免除研究對(duì)象知情同意。

2016年1月至2017年12月期間共有1 078例患者診斷為RIF，即年齡＜40 歲至少經(jīng)過(guò)3 次新鮮或者凍融胚胎移植周期，累計(jì)至少移植4 枚優(yōu)質(zhì)胚胎而未能獲得臨床妊娠者。所有患者都曾進(jìn)行過(guò)抗核抗體譜、抗心磷脂抗體檢查、狼瘡抗凝物、抗凝血酶、蛋白S、蛋白C、血小板聚集率等相關(guān)檢查，排除合并有系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者1 例，抗磷脂綜合征2 例，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎4 例，干燥綜合征3 例，未分化結(jié)締組織病患者6例，剩余1 062例RIF患者。

1 062 例患者中排除卵巢功能減退者48 例，即IVF 前檢查抗苗勒氏管激素（anti-mullerianbormone，AMH）≤1.1 μg/L［9］；排除合并子宮肌瘤者65 例，合并卵巢囊腫者32例，子宮完全或者不全縱隔者8例，單角子宮或雙子宮共5 例，排除有子宮黏連史移植前內(nèi)膜厚度≤7 mm 患者5 例，2 次移植前內(nèi)膜厚度≤7 mm患者12例，子宮腺肌癥或腺肌瘤患者43例，子宮內(nèi)膜異位癥12 例，排除有血栓史患者3 例，原發(fā)性血小板增多癥1 例，排除以上疾病后，剩余患者828例。

1.2 方法

1.2.1 分組及觀察指標(biāo) 將1.1 中828 例患者，根據(jù)移植前是否曾用藥分為2 組，治療組為移植前開(kāi)始用阿司匹林+強(qiáng)的松至少14 d者共450例患者，對(duì)照組為未用藥者共378 例患者。亞組分類(lèi)：兩組患者中，將抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）比值為1∶80 者的患者篩選出來(lái)，其中ANA 1∶80 對(duì)照亞組72例和ANA 1∶80治療亞組106例，共178例。

此外，針對(duì)低補(bǔ)體C3、低補(bǔ)體C4、高免疫球蛋白A、高免疫球蛋白G、高免疫球蛋白E，從828 例兩組患者中，將單個(gè)指標(biāo)符合以上檢查結(jié)果的患者篩選出來(lái)，共124 例，分別為個(gè)別抗體異常對(duì)照亞組56例和個(gè)別抗體異常治療亞組68例。

比較兩組間及各個(gè)對(duì)照亞組與治療亞組間移植后臨床妊娠率、胚胎著床率、早期流產(chǎn)率和持續(xù)妊娠率。

1.2.2 用藥方法及助孕情況 治療組患者阿司匹林應(yīng)用：移植前后至少口服14 d，每日口服75～100 mg；強(qiáng)的松應(yīng)用：移植前后至少口服14 d，每日5 mg。

所有患者均行解凍胚胎移植，移植方案有自然周期解凍移植和人工周期解凍移植兩種。自然周期解凍移植適用于月經(jīng)周期規(guī)律、能正常排卵者，B超監(jiān)測(cè)卵泡生長(zhǎng)和排卵情況，排卵后第3 天解凍移植卵裂期胚胎或排卵后第5天移植囊胚期胚胎。人工周期適用于月經(jīng)周期不規(guī)律、長(zhǎng)期持續(xù)無(wú)排卵或子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)不良者，于月經(jīng)周期第2～3 天開(kāi)始口服戊酸雌二醇（補(bǔ)佳樂(lè)，德國(guó)先靈公司）4～6 mg/d，根據(jù)內(nèi)膜厚度調(diào)整劑量，內(nèi)膜厚度達(dá)到8 mm 以上時(shí)給予黃體酮轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，4 d后解凍移植卵裂期胚胎或6 d 后解凍移植囊胚。囊胚率為移植囊胚數(shù)比胚胎總數(shù)［10］。

1.2.3 妊娠判斷及監(jiān)測(cè) 觀察指標(biāo)包括：主要結(jié)局：臨床妊娠率，臨床妊娠率=臨床妊娠周期/移植周期，臨床妊娠指胚胎移植后28～30 d 超聲探及宮內(nèi)妊娠囊或臨床明確診斷異位妊娠者；次要結(jié)局：包括①早期流產(chǎn)率，早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)周期/臨床妊娠周期，早期流產(chǎn)指妊娠12 周前的胎兒丟失；②持續(xù)妊娠率，持續(xù)妊娠率=持續(xù)妊娠周期/移植周期，持續(xù)妊娠為宮內(nèi)妊娠活胎持續(xù)至妊娠10 周者；③胚胎著床率，胚胎著床率=有心管搏動(dòng)的孕囊數(shù)/移植胚胎總數(shù)；監(jiān)測(cè)：移植后第14 天與21 天抽血查β-HCG，移植后第30天與第37天做盆腔彩超檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確概率法進(jìn)行，Logistic 多元逐步回歸分析影響臨床妊娠率的因素。所有檢驗(yàn)以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 828例患者對(duì)照組與治療組間比較

2.1.1 828 例患者對(duì)照組與治療組間一般資料比較 828 例患者中，對(duì)照組與阿司匹林+強(qiáng)的松治療組患者在年齡、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、不孕年限、抗繆勒氏管激素（anti-mullerian hormone，AMH）、基礎(chǔ)促卵泡生成素（follicle stimulatin hormone，F(xiàn)SH）和既往移植次數(shù)的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在解凍移植周期時(shí)的轉(zhuǎn)化內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、囊胚率和自然周期率的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

2.1.2 828 例患者對(duì)照組與治療組兩組間妊娠結(jié)局比較 治療組患者在此次解凍周期中的胚胎著床率與臨床妊娠率分別為36.12%與40.89%，數(shù)值上略高于對(duì)照組的33.91%與39.68%；早期流產(chǎn)率為17.39%，略低于對(duì)照組的18.00%，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 828例患者對(duì)照組與治療組兩組一般臨床資料和解凍移植情況比較（）Tab.1 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of 828 patients in two groups（）

表1 828例患者對(duì)照組與治療組兩組一般臨床資料和解凍移植情況比較（）Tab.1 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of 828 patients in two groups（）

根據(jù)移植胚胎的階段，分為卵裂期胚胎和囊胚期胚胎移植兩亞組。卵裂期胚胎移植亞組里，治療組胚胎著床率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率分別為27.45%、35.29%和26.14%，數(shù)值上略高于對(duì)照組的25.93%、33.33% 和24.44%，早期流產(chǎn)率為25.92%，低于對(duì)照組的26.67%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表2）。同樣地，在囊胚期胚胎移植亞組內(nèi)，治療組胚胎著床率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率分別為44.88%、43.77%和37.37%，稍高于對(duì)照組的42.60%、43.21%和37.04%，早期流產(chǎn)率治療組為14.61%，對(duì)照組為14.29%，但兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 828例患者兩組卵裂期胚胎與囊胚期胚胎解凍移植妊娠結(jié)局比較Tab.2 Comparison of pregnancy outcomes after thawing cleavage embryo/blastocyst transfer of 828 patients in two groups

進(jìn)一步就年齡、BMI、不孕年限、AMH、FSH、移植前內(nèi)膜厚度和移植胚胎數(shù)與臨床妊娠率之間進(jìn)行多元回歸分析，發(fā)現(xiàn)均無(wú)相關(guān)性（表3）。

表3 臨床妊娠率影響因素多元回歸分析Tab.3 Multiple regression analysis of risk factors in clinical pregnancy rate

2.2 178 例ANA 抗體1∶80 患者治療組與對(duì)照組間比較 ANA 1∶80患者對(duì)照組與治療組的比較，兩組在年齡、BMI、不孕年限、AMH、基礎(chǔ)FSH、轉(zhuǎn)化內(nèi)膜厚度、囊胚率和移植胚胎數(shù)等一般情況的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在該解凍移植周期中治療組的胚胎著床率、臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率數(shù)值均略高于對(duì)照組，但與早期流產(chǎn)率一樣，兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表4）。

表4 ANA 1∶80 對(duì)照組與治療組兩組一般臨床資料和解凍移植情況比較（）Tab.4 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of ANA 1∶80 patients in two groups（）

表4 ANA 1∶80 對(duì)照組與治療組兩組一般臨床資料和解凍移植情況比較（）Tab.4 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of ANA 1∶80 patients in two groups（）

同樣地，根據(jù)移植胚胎的階段，將兩組分為卵裂期胚胎和囊胚期胚胎兩亞組。兩個(gè)亞組中治療組的胚胎著床率、持續(xù)妊娠率、臨床妊娠率數(shù)值上都稍高于對(duì)照組，早期流產(chǎn)率都低于對(duì)照組，囊胚期胚胎移植亞組中治療組的早期流產(chǎn)率數(shù)值為13.79%，低于對(duì)照組的15.79%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表5）。進(jìn)一步就年齡、BMI、不孕年限、AMH、FSH、移植前內(nèi)膜厚度和移植胚胎數(shù)與臨床妊娠率之間進(jìn)行多元回歸分析，發(fā)現(xiàn)均無(wú)相關(guān)性。

表5 ANA 1∶80患者兩組卵裂期胚胎與囊胚期胚胎解凍移植妊娠結(jié)局比較Tab.5 Comparison of pregnancy outcomes after thawing cleavage embryo/blastocyst transfer of ANA 1∶80 patients in two groups

2.3 124例1個(gè)指標(biāo)異?；颊咧委熃M與對(duì)照組間比較 兩組間在低補(bǔ)體C3率、低補(bǔ)體C4率、高免疫球蛋白A 率、高免疫球蛋白E 率和高免疫球蛋白G 率、年齡、BMI、不孕年限、AMH、基礎(chǔ)FSH等一般情況的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表6）；在該解凍移植周期時(shí)的轉(zhuǎn)化內(nèi)膜厚度、囊胚率、移植胚胎數(shù)和胚胎著床率、臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率和早期流產(chǎn)率等的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表6），無(wú)論是在卵裂期胚胎亞組內(nèi)，還是囊胚期胚胎亞組內(nèi)，治療組的胚胎著床率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率數(shù)值上都稍高于對(duì)照組，早期流產(chǎn)率略低于對(duì)照組，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表7）。

表6 124例個(gè)別抗體陽(yáng)性患者對(duì)照與治療組一般臨床資料和解凍移植情況比較（）Tab.6 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of 124 patients with one abnormal antibodies in two groups（）

表6 124例個(gè)別抗體陽(yáng)性患者對(duì)照與治療組一般臨床資料和解凍移植情況比較（）Tab.6 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of 124 patients with one abnormal antibodies in two groups（）

表7 124例個(gè)別抗體陽(yáng)性患者兩組卵裂期胚胎與囊胚期胚胎解凍移植妊娠結(jié)局比較Tab.7 Comparison of pregnancy outcomes after frozen thawed embryo transfer in 124 cases of individual antibodies positive normal antibodies in two groups

3 討論

胚胎的侵入是一個(gè)生理性的炎癥過(guò)程，是胚胎與子宮內(nèi)膜間免疫微環(huán)境破壞重建并維持平衡的過(guò)程，局部免疫功能紊亂可以降低子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致RIF［11-13］。盡管機(jī)制尚未明了，甾體激素、羥氯喹、強(qiáng)的松、他克莫司、淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫、聚落刺激因子、被動(dòng)免疫治療如靜脈注射免疫球蛋白等已經(jīng)嘗試性應(yīng)用于臨床，其中強(qiáng)的松因相對(duì)安全、方便價(jià)廉，與阿司匹林聯(lián)合應(yīng)用最多，但是療效未得到證實(shí)［14-17］。一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照研究對(duì)既往1～2 周期ICSI失敗的195 例患者給予強(qiáng)的松+阿司匹林治療，認(rèn)為治療后可利于提高胚胎種植率［18］；另外一項(xiàng)前瞻性研究認(rèn)為，對(duì)于抗卵巢抗體陽(yáng)性的既往兩周期IVF 失敗的患者，強(qiáng)的松應(yīng)用可以提高著床率與妊娠率［19］；然而，另有回顧性研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)既往≥2 周期IVF 失敗的患者，強(qiáng)的松+阿司匹林的臨床應(yīng)用不能改善患者最終妊娠結(jié)局［20］。本研究回顧性分析也得出類(lèi)似的結(jié)果，雖然數(shù)值上胚胎著床率、臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率略有提高，早期流產(chǎn)率略有下降，但是無(wú)顯著性差異。

育齡期間常見(jiàn)的自身免疫系統(tǒng)疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、橋本甲狀腺炎、結(jié)締組織病和抗磷脂抗體綜合癥，其中抗磷脂抗體綜合癥是最影響妊娠結(jié)局和最容易導(dǎo)致妊娠不良結(jié)局發(fā)生的自身免疫性疾病，免疫抑制劑、阿司匹林與肝素治療可以明顯改善生殖結(jié)局和妊娠結(jié)局［21-22］。RIF 患者中僅有4.3%～8.0%的患者被發(fā)現(xiàn)患有上述自身免疫性疾病可以進(jìn)行相應(yīng)治療，而70%～85%患者就目前常見(jiàn)免疫學(xué)相關(guān)檢查不能發(fā)現(xiàn)異?；蛘邇H個(gè)別指標(biāo)異常而不能診斷為自身免疫性疾?。?3］。在常見(jiàn)的免疫抗體檢查中，ANA 是一組對(duì)細(xì)胞核內(nèi)的DNA、RNA、蛋白或這些物質(zhì)的分子復(fù)合物產(chǎn)生的自身抗體，是最常見(jiàn)的陽(yáng)性指標(biāo)，常見(jiàn)于各種自身免疫疾病，在健康人群中單純陽(yáng)性率為13.45%，一般認(rèn)為可以不需治療，定期風(fēng)濕免疫科隨訪即可［24］，而RIF 人群中外周血ANA 陽(yáng)性率可增高達(dá)15%～20%，認(rèn)為在內(nèi)膜局部或者卵泡液中陽(yáng)性可能導(dǎo)致細(xì)胞的異常凋亡而影響著床，但是缺乏系統(tǒng)基礎(chǔ)研究和較少的臨床研究，目前認(rèn)為ANA 1∶80 不需要治療，定期復(fù)查與隨訪觀察［25］；FAN 等［26］的研究選擇了133 例ANA 陽(yáng)性≥1∶160 的IVF-ET 患者，其中60 例在IVF-ET 之前3 個(gè)月開(kāi)始口服強(qiáng)的松10 mg/d+阿司匹林100 mg/d，同時(shí)比較73例未用藥的患者，發(fā)現(xiàn)ANA陽(yáng)性患者進(jìn)行治療后可以明顯增加著床率，減少早期流產(chǎn)率，但是該研究沒(méi)有將ANA 1∶80 的患者納入研究范圍。本研究回顧性分析首次將ANA 為1∶80 的臨界患者作為觀察對(duì)象，發(fā)現(xiàn)ANA 陽(yáng)性患者經(jīng)阿司匹林+強(qiáng)的松數(shù)值上可以提高著床率與臨床妊娠率數(shù)值，降低早期流產(chǎn)率，但是與未治療組比較無(wú)顯著性差異。

在臨床常用RIF 免疫學(xué)檢查中，補(bǔ)體系統(tǒng)是體內(nèi)重要的免疫效應(yīng)系統(tǒng)和放大系統(tǒng)，參與免疫調(diào)節(jié)與抗感染，補(bǔ)體C3、C4 是補(bǔ)體系統(tǒng)中含量最高的成分，在生殖領(lǐng)域中補(bǔ)體系統(tǒng)參與了早期的精卵結(jié)合，近年在卵巢組織中測(cè)序到補(bǔ)體的存在，認(rèn)為補(bǔ)體參與了卵巢局部組織的重建［27］。此外，免疫球蛋白是血液和組織液中的一類(lèi)糖蛋白，由B 淋巴細(xì)胞接受抗原刺激后增殖分化生成的漿細(xì)胞產(chǎn)生，能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合，是介導(dǎo)體液免疫的重要效應(yīng)分子，然而，補(bǔ)體系統(tǒng)與免疫球蛋白在子宮內(nèi)膜局部免疫微環(huán)境及在著床過(guò)程中的作用尚不清楚，亦未見(jiàn)與RIF患者的相關(guān)研究［28］。本研究回顧性分析將補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白E抗體檢查中單個(gè)指標(biāo)異常的患者篩選出來(lái)，發(fā)現(xiàn)阿司匹林+強(qiáng)的松后可以提高胚胎著床率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率的數(shù)值，降低早期流產(chǎn)率，但是與未治療組相比無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

目前針對(duì)有自身免疫性疾病擬輔助生育的患者，已經(jīng)形成共識(shí)，認(rèn)為通過(guò)風(fēng)濕免疫科規(guī)律有效的免疫治療后可以改善生殖結(jié)局。然而，針對(duì)無(wú)明確自身免疫性疾病的RIF 患者或者反復(fù)流產(chǎn)的患者，在生殖領(lǐng)域進(jìn)行免疫療法以改善生殖結(jié)局是有爭(zhēng)議的，部分研究認(rèn)為可以提高胚胎著床率、降低早期流產(chǎn)率，但多項(xiàng)前瞻性研究認(rèn)為免疫療法并不能提高IVF-ET患者活產(chǎn)率，建議免疫療法應(yīng)用于研究，或者更準(zhǔn)確地篩選出適宜干預(yù)的患者，而不應(yīng)用于常規(guī)臨床實(shí)踐以改善生殖結(jié)果［5，11］。

綜上所述，該研究結(jié)果提示對(duì)于不具有自身免疫性疾病的RIF患者，阿司匹林+強(qiáng)的松的治療不能顯著改善生殖結(jié)局，而針對(duì)ANA 1∶80 的患者、單獨(dú)一個(gè)低補(bǔ)體C3/C4 或者單獨(dú)高免疫球蛋白的患者，阿司匹林+強(qiáng)的松的治療也不能顯著提高胚胎著床率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率，降低早期流產(chǎn)率。然而，鑒于該研究樣本量小，為回顧性研究，存在回顧性研究的局限性和臨床樣本少的缺陷，不能完全客觀準(zhǔn)確評(píng)估，因此關(guān)于強(qiáng)的松或其他免疫抑制劑的臨床應(yīng)用，需要擴(kuò)大樣本量和開(kāi)展大規(guī)模的多中心前瞻性研究，并進(jìn)行相關(guān)的基礎(chǔ)研究，可以更準(zhǔn)確地篩選患者和提高RIF 患者的治療效果，同時(shí)為RIF患者的治療提供理論依據(jù)。