張 萌 顏 蘊

（滕州市中心人民醫(yī)院婦科，滕州 277500）

宮頸癌是僅次于乳腺癌的第二大女性惡性腫瘤，主要由人乳頭瘤病毒引起，嚴重威脅婦女身心健康［1-2］。防止腫瘤細胞免疫逃逸是有效的抗癌方法，逐漸成為腫瘤免疫學研究熱點［3］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者常發(fā)生腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移，可能與宮頸癌細胞免疫逃逸相關［4］。6，7，4'-三羥基異黃酮（6，7，4'-trihydroxyisoflavone，THIF）是黃豆苷元主要代謝產(chǎn)物之一，其水溶性衍生物THIF-SO3H·2H2O、THIF-SO3（NH4）2對宮頸癌細胞增殖具有抑制作用［5］。此外，宮頸癌細胞中，主要組織相容性復合體Ⅰ類鏈相關蛋白A/B（major histocompatibility complex classⅠchain-related protein A/B，MICA/B）可通過淋巴細胞和自然殺傷（natural killer，NK）細胞激活可溶性NK 細胞活化性受體（natural killer cell group 2D，NKG2D）發(fā)揮免疫防御作用［6］。但THIF對宮頸癌細胞的作用及機制尚不明確，本文旨在通過研究THIF對人宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響，初步探索其與HeLa 細胞免疫逃逸機制的聯(lián)系，為THIF應用于宮頸癌臨床治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌HeLa 細胞（CBP600232）購自南京科佰生物科技有限公司；THIF（PCS1644）購自成都植標化純生物技術有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基（11995）、青鏈霉素混合液（P1400）、胎牛血清（11011-8611）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（C04915202）購自南京試劑公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，D1040）、0.25%胰蛋白酶消化液（T1350）、MTT（M8180）、乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測試劑盒（BC0685）、Trizol 試 劑 盒（R1100）、RIPA 裂 解液（R0020）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（T2210-200T）、Annexin VFITC/PI 凋亡檢測試劑盒（CA1020）、Matrigel 膠（356234）均購自北京Solarbio；細胞周期試劑盒（C1052）、ECL 發(fā)光液（P0018FS）購自上海碧云天生物技術有限公司；細胞培養(yǎng)瓶（3815）、96 孔板（3471）、6 孔板（3506）購自美國Corning 公司；兔抗人MICA 多克隆抗體（PA5-35346）、兔抗人MICB 多克隆抗體（PA5-97245）、小鼠抗人NKG2D 單克隆抗體（12587842）、小鼠抗人β-actin 單克隆抗體（AM4302）、山羊抗兔IgG（H+L）二抗（A32731）、山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗（A32723）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；CO2細胞培養(yǎng)箱（CR-80）購自廣州康恒儀器；酶標儀（ELX-8081U）、PCR 儀（T100）購自美國Bio-Tek；金相顯微鏡（DM2700M）購自深圳歐博浩瀚科技有限公司；流式細胞儀（CytoFLEX）購自美國Beckman；人外周血取自健康志愿者。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HeLa 細胞置于37℃水浴鍋中解凍，1 200 r/min離心5 min，棄上清，高糖DMEM完全培養(yǎng)基（89%高糖DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗）重懸，移入細胞培養(yǎng)瓶，添加2 ml完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)，0.25%胰酶消化收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 MTT 實驗 取對數(shù)期生長HeLa 細胞，接種于96 孔板（4×104個/孔），隨機分組，0.05%DMSO 助溶的含有不同濃度THIF（5、15、30 μmol/L）的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，設置對照組，各組設6 個復孔。20 μl/孔加入MTT 溶液（5 mg/ml），培養(yǎng)箱孵化4 h，棄上清，加入100 μl DMSO 振動溶解，酶標儀檢測490 nm 處各組OD 值，計算細胞存活率（%）=OD藥物處理組/OD對照組×100%。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測HeLa 細胞凋亡 收集1.2.1 培養(yǎng)的HeLa 細胞，調(diào)整密度為5×105個/ml，2 ml/孔接種于6 孔板，按照1.2.2 隨機分組，各組設6 個復孔，培養(yǎng)24 h。收集各組細胞，冷PBS 洗滌3 次，加入500 μl Binding Buffer 重懸，依次加入5 μl Annexin V/FITC 和PI 工作液，避光保存20 min，流式細胞儀檢測，計算凋亡率。

1.2.4 MTT檢測淋巴細胞增殖能力 參考文獻［7］，100 μl PBS 稀釋人抗凝外周血，輕鋪于含有100 μl淋巴細胞分離液的離心管，1 000 r/min離心15 min，取中間白膜層細胞，PBS清洗3次。收集1.2.3中各濃度THIF 處理的各組HeLa 細胞，制備單細胞懸液（1×103個/ml），與上述淋巴細胞（1×103個/ml）等體積混勻，接種于96孔板（1×103個/孔），各組設6個復孔，培養(yǎng)24 h，MTT法檢測細胞存活率。

1.2.5 THIF 作用下NK 細胞殺傷活力檢測 參考文獻［7］，收集1.2.3 中分離的淋巴細胞，重懸為單細胞懸液（1×106個/ml）。取1.2.3 中各組HeLa 細胞作為靶細胞，制備單細胞懸液（1×106個/ml），分別將不同濃度THIF處理的各組HeLa細胞與淋巴細胞按1∶20 接種于96 孔板（4×104個/孔），并設置對照組，各組設6 個復孔，共培養(yǎng)48 h。收集上清，檢測LDH活性（U/L）=（OD實驗組-OD對照組）/（OD標準-OD空白）×標準品濃度（0.2 μmol/L）×1 000。

1.2.6 RT-qPCR 檢測THIF 對HeLa 細胞MICA/B、NKG2D mRNA 表達的影響 Trizol 法提取各組HeLa細胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板進行RT-qPCR 擴增，反應條件為95℃預變性30 s，95℃變性5 s，55℃延伸20 s，72℃退火20 s，40 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算MICA/B、NKG2D相對表達。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.7 Western blot 檢測MICA/B、NKG2D 蛋白表達 收集1.2.2 各組細胞，RIPA 裂解液提取各組HeLa細胞總蛋白，BCA 法檢測各組蛋白總濃度。分別取50 μl 樣品蛋白進行凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉4 h，依次加入兔抗人MICA 多克隆抗體（1∶1 000）、兔抗人MICB 多克隆抗體（1∶1 000）、小鼠抗人NKG2D 單克隆抗體（1∶1 000）、小鼠抗人β-actin 單克隆抗體（1∶1 000），4℃孵化過夜，洗膜，加入山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1∶1 000）或山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗（1∶1 000）室溫孵化2 h，ECL曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參，計算MICA、MICB蛋白相對表達。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度THIF 對HeLa 細胞增殖的抑制作用 與對照組相比，THIF 各組HeLa 細胞存活率降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05，表2）。

表2 不同濃度THIF 處理24 h 對HeLa 細胞存活率的影響（，%）Tab.2 Effect of different concentrations of THIF treatment for 24 h on HeLa cell survival rate（，%）

表2 不同濃度THIF 處理24 h 對HeLa 細胞存活率的影響（，%）Tab.2 Effect of different concentrations of THIF treatment for 24 h on HeLa cell survival rate（，%）

2.2 THIF 對HeLa 細胞凋亡的影響 與對照組相比，THIF 各組HeLa 細胞凋亡率升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05，圖1、表3）。

表3 THIF作用24 h后各組HeLa細胞凋亡率（，%）Tab.3 Apoptosis rate of HeLa cell in each group after treatment of THIF for 24 h（，%）

表3 THIF作用24 h后各組HeLa細胞凋亡率（，%）Tab.3 Apoptosis rate of HeLa cell in each group after treatment of THIF for 24 h（，%）

圖1 THIF對HeLa細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of THIF on apoptosis of HeLa cells

2.3 淋巴細胞增殖能力 與對照組相比，THIF 各組淋巴細胞活力依次升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05，表4）。

表4 各組淋巴細胞增殖活力（，%）Tab.4 Lymphocyte proliferation activity of each group（，%）

表4 各組淋巴細胞增殖活力（，%）Tab.4 Lymphocyte proliferation activity of each group（，%）

2.4 THIF 對NK 細胞殺傷活力的影響 與對照組相比，THIF各組NK細胞殺傷活力依次升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05，表5）。

表5 各組NK細胞殺傷活力（，U/L）Tab.5 Killing activity of NK cells in each group（，U/L）

2.5 THIF 對HeLa 細胞MICA/B、NKG2D mRNA 表達的影響 與對照組相比，THIF 各組HeLa 細胞MICA mRNA、MICB mRNA 及NKG2D mRNA 表達依次升高，呈劑量依賴性（P＜0.05，表6）。

表6 各組HeLa細胞MICA/B 及NKG2D mRNA 表達情況（）Tab.6 MICA/B and NKG2D mRNA expressions of HeLa cells in each group（）

表6 各組HeLa細胞MICA/B 及NKG2D mRNA 表達情況（）Tab.6 MICA/B and NKG2D mRNA expressions of HeLa cells in each group（）

2.6 THIF 對HeLa 細胞MICA/B、NKG2D 蛋白表達情況的影響 與對照組相比，THIF 各組HeLa 細胞MICA、MICB 及NKG2D 蛋白表達依次升高，呈劑量依賴性（P＜0.05，圖2、表7）。

表7 各組HeLa細胞MICA/B及NKG2D蛋白表達（）Tab.7 MICA/B and NKG2D protein expressions of HeLa cells in each group（）

表7 各組HeLa細胞MICA/B及NKG2D蛋白表達（）Tab.7 MICA/B and NKG2D protein expressions of HeLa cells in each group（）

圖2 各組HeLa細胞蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoresis of protein expressions of HeLa cells in each group

3 討論

過去50 年，隨著全球醫(yī)療條件改善，宮頸癌病死率下降50%～75%，但每年仍有50 萬左右女性被確診為宮頸癌，嚴重威脅全球女性生命安全［8-9］。目前，根據(jù)宮頸癌患者腫瘤情況，臨床常采用盆腔淋巴結(jié)切除、子宮切除、或放化療等治療手段，但患者生存率仍較低［10］。高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要原因，研究顯示，宮頸癌發(fā)生發(fā)展可能與HPV 感染下的腫瘤細胞免疫逃逸相關，但具體機制尚未明確［11-12］。

異黃酮是豆科植物次級代謝產(chǎn)物，具有潛在抗癌、抗肥胖和抗糖尿病活性，近年研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮可抑制胃癌、肝癌等腫瘤細胞生長，并誘導其凋亡［13］。THIF 是大豆異黃酮主要代謝產(chǎn)物，LEE等［14］和LIM 等［15］研究顯示，THIF 可抑制結(jié)腸癌HCT-116細胞、食管癌細胞腫瘤活性。本研究發(fā)現(xiàn)，THIF 呈劑量依賴性抑制HeLa 細胞存活，提示THIF有望成為抑制宮頸癌腫瘤細胞生長的新型藥物。細胞凋亡受抑制是引發(fā)癌癥的重要因素，因此在腫瘤細胞中維持細胞增殖、凋亡平衡至關重要［16］。LO等［17］首次發(fā)現(xiàn)7，3，4'-THIF 可通過激活HeLa 細胞凋亡通路誘導細胞死亡。本研究顯示，與對照組相比，THIF 各組HeLa 細胞凋亡率依次升高，提示THIF 是一種潛在的可用于宮頸癌臨床治療的新型藥物。

NK 細胞是免疫系統(tǒng)中重要的毒性細胞，可與NKG2D 型配體結(jié)合殺滅腫瘤細胞，發(fā)揮免疫防御功能［18-19］。NKG2D 型配體包括2 組主要組織相容性復合體Ⅰ類相關分子，MICA/B和6個UL16結(jié)合蛋白，其表達受NKG2D 依賴性免疫監(jiān)測影響［20］。WEISSSTEIDER等［6］證實，宮頸癌細胞可表達控制NK細胞功能的MICA/B 配體和NKG2D 受體。此外，下調(diào)NKG2D 表達可誘導宮頸癌細胞免疫逃逸［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，THIF 各組淋巴細胞增殖活力、NK細胞殺傷活力依次升高，提示THIF可能通過促進淋巴細胞增殖、激活NK 細胞殺傷功能，抑制HeLa免疫逃逸。CHO等［22］研究證實，宮頸癌患者體內(nèi)包括MICA/B 在內(nèi)的NKG2D 配體高表達是良好預后獨立預測因子，強調(diào)NKG2D功能在宮頸腫瘤進展和癌癥免疫檢測中的重要性。本研究顯示，與對照組相比，THIF各組HeLa 細胞MICA、MICB、NKG2D mRNA 及蛋白表達均呈劑量依賴性升高，提示THIF 可能促進宮頸癌細胞高表達MICA/B，活化NK 細胞表面的NKG2D 受體與MICA/B 配體結(jié)合，發(fā)揮腫瘤免疫作用，抑制宮頸癌細胞免疫逃逸。

綜上所述，THIF 可上調(diào)MICA/B 表達，抑制人宮頸癌細胞增殖，促進其凋亡，可能通過活化NK 細胞表面的NKG2D 受體與MICA/B 結(jié)合，抑制宮頸癌細胞免疫逃逸，為THIF應用于宮頸癌臨床治療提供依據(jù)。但機體免疫調(diào)節(jié)受多種受體-配體信號支配，是一個復雜過程，本研究僅在體外細胞培養(yǎng)水平進行基礎研究，證據(jù)尚不充分，將進一步采用動物實驗聯(lián)合臨床研究研究THIF 治療宮頸癌的效果及作用機制。