張玉清 邢惠海 劉立秋 王 敬 徐書方

（石家莊醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，石家莊 050599）

宮頸癌是全球范圍內(nèi)危害較嚴(yán)重的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于女性惡性腫瘤中第2位，85%以上患者來自中低收入的發(fā)展中國(guó)家［1-2］。中國(guó)每年宮頸癌的發(fā)病率占全球1/4 以上，45 歲以上人群的宮頸癌新發(fā)病例約7萬，占總數(shù)的70%，且近年其發(fā)病呈逐漸年輕化趨勢(shì)，給全球女性健康造成嚴(yán)重傷害［3-4］。微小RNA（miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子的RNA，其長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸，可與mRNA 3'端非編碼區(qū)（3'UTR）結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡和分化等生命活動(dòng)過程［5-6］。研究顯示，miR-196b作為其中一種miRNA在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，可能參與調(diào)控宮頸癌疾病的發(fā)生發(fā)展過程［7］，但是有關(guān)miR-196b 對(duì)宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥影響的研究目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過下調(diào)HeLa/DDP 細(xì)胞中miR-196b 基因的表達(dá)，觀察下調(diào)miR-196b表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥的影響，初步探討miR-196b在宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥中的作用機(jī)制，為后期相關(guān)研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、順鉑耐藥細(xì)胞株HeLa/DDP（貨號(hào)分別為XB-0620、XB-0643）購自上海奧陸生物科技有限公司；miR-196b inhibitor、negative control（NC）（貨號(hào)分別為：hsa-mir-196b、miR03101）購自百奧邁克生物技術(shù)有限公司；化療藥順鉑（貨號(hào)：15663-27-1，純度：Pt≥98%）購自寶雞市國(guó)康生物科技有限公司；LipofectaminTM2000（貨號(hào)為：rs374987523）購自美國(guó)Invitrogen 公司；鼠抗人蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylase B kinase，p-Akt）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、磷酸化雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）單克隆抗體（批號(hào)分別為：RAB1911、RAB1916、RAB1908、RAB1923、RAB1928）購自美國(guó)Sigma 公司；PVDF 膜、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗（貨號(hào)分別為：F619537、D110098）購自上海生工生物工程有限公司；蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)分別為：C510003、C503021）購自美國(guó)Thermo 公司；RNA 提取試劑盒（貨號(hào)：DP419）購自北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix（貨號(hào)：Q111-02）購自南京vazyme 生物公司；蛋白凝膠成像儀（型號(hào)：Gel Doc XR+）購自Bio-Red 公司；qRT-PCR 儀購自美國(guó)Bio-Rad公司；本研究引物由西安擎科生物公司合成等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa/DDP、HeLa 細(xì)胞，在培養(yǎng)基中分別加入終濃度為0.01、0.1、1、5、10、20、40、80、100 μmol/L 順鉑藥物，培養(yǎng)48 h，MTT 法檢測(cè)HeLa/DDP、HeLa 細(xì)胞的IC50，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，篩選最佳順鉑濃度。培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa/DDP細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，接種于6 孔細(xì)胞板（1×106個(gè)/孔），待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，更換為無血清DMEM 培養(yǎng)基，采用LipofectamineTM2000法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后用無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將終濃度為5 μmol/L 順鉑加入HeLa/DDP細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將HeLa/DDP細(xì)胞根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑的不同分為3組，空白對(duì)照（僅用轉(zhuǎn)染試劑處理）+DDP，陰性對(duì)照（轉(zhuǎn)染NC）+DDP組，miR-196b inhibitor（轉(zhuǎn) 染miR-196b inhibitor）+DDP組，轉(zhuǎn)染操作步驟嚴(yán)格按照LipofectaminTM2000試劑盒說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞IC50收集1.2.1中的各組細(xì)胞，用MTT 檢測(cè)法檢測(cè)各組細(xì)胞的IC50，將細(xì)胞用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按2×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度鋪于96孔板，每組細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入順鉑至終濃度0.01、0.1、1、5、10、20、40、80、100 μmol/L，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h 后每孔加20 μl MTT（5 mg/ml），37℃避光孵育4 h，棄上清，加DMSO（150 μl/孔）充分振蕩使結(jié)晶溶解。酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值，6 個(gè)復(fù)孔取平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件繪制細(xì)胞存活率曲線并求出IC50。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集1.2.1轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，預(yù)冷PBS洗滌2 次，離心棄上清，配制成1×106個(gè)/ml 的細(xì)胞懸液，100 μl 細(xì)胞懸液加入5 μl AnnexinV-FITC 和5 μl PI混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)各組細(xì)胞miR-196b表達(dá)水平RNA 提取試劑盒提取1.2.1 中各組細(xì)胞的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用定量PCR儀對(duì)miR-196b基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。qRT-PCR 反應(yīng)體系共10 μl：miScript SYBR?Green Mix 5 μl，cDNA（50 ng/μl）1 μl，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μl，ddH2O 3.0 μl。反應(yīng)條件：95℃，90 s；95℃，30 s；63℃，30 s；72℃，15 s；40 個(gè)循環(huán)。miR-196b 及其內(nèi)參U6 引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法對(duì)miR-196b表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.2.5 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR 蛋白表達(dá) 按照蛋白提取試劑盒說明書提取1.2.1 各組細(xì)胞中總蛋白，采用BCA 蛋白試劑盒對(duì)細(xì)胞中總蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。采用SDSPAGE 分離等量蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)PVDF 膜上，置于4℃下添加Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR 一抗及βactin 一抗（1∶500），孵育過夜。洗滌后添加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）常溫孵育2 h。采用Tanon 600 圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白水平Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究所得數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示；計(jì)量資料用表示，行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-196b 在HeLa/DDP、HeLa 細(xì)胞中表達(dá)水平比較 與HeLa 細(xì)胞miR-196b 表達(dá)水平（0.96±0.21）相比，HeLa/DDP 細(xì)胞中miR-196b 表達(dá)水平（1.58±0.25）顯著升高（t=4.651，P＜0.05）。

2.2 檢測(cè)HeLa/DDP、HeLa 對(duì)順鉑的敏感性 隨順鉑濃度增加（0.01、0.1、1、5、10、20、40、80、100 μmol/L）HeLa/DDP、HeLa 細(xì)胞活力下降，經(jīng)計(jì)算HeLa 的IC50為4.86 μmol/L，HeLa/DDP 的IC50為68.13 μmol/L，與HeLa 對(duì)順鉑的IC50［（4.86±1.12）μmol/L］相比，HeLa/DDP 對(duì)順鉑的IC50［（68.13±7.01）μmol/L］顯著升高（t=21.831，P＜0.05）。

2.3 下調(diào)miR-196b 對(duì)HeLa/DDP 細(xì)胞中miR-196b表達(dá)的影響 與空白對(duì)照+DDP 組、陰性對(duì)照+DDP組相比，轉(zhuǎn)染后24 h、48 h，miR-196b inhibitor-1+DDP 組、miR-196b inhibitor-2+DDP 組、miR-196b inhibitor-3+DDP 組、miR-196b inhibitor-4+DDP 組細(xì)胞中miR-196b 表達(dá)水平均明顯減少（P＜0.05），其中以轉(zhuǎn)染48 h 后，miR-196b inhibitor-2+DDP 組細(xì)胞中miR-196b表達(dá)水平最低（P＜0.05），因此選miR-196b inhibitor-2+DDP組轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行后續(xù)研究。見表2。

表2 下調(diào)miR-196b 對(duì)HeLa/DDP 細(xì)胞中miR-196b 表達(dá)的影響（，n=6）Tab.2 Effect of down regulating miR-196b on expression of miR-196b in HeLa/DDP cells（，n=6）

表2 下調(diào)miR-196b 對(duì)HeLa/DDP 細(xì)胞中miR-196b 表達(dá)的影響（，n=6）Tab.2 Effect of down regulating miR-196b on expression of miR-196b in HeLa/DDP cells（，n=6）

2.4 下 調(diào)miR-196b 對(duì)HeLa/DDP 細(xì)胞IC50的影響與空白對(duì)照+DDP 組、陰性對(duì)照+DDP 組相比，miR-196b inhibitor-2+DDP 組細(xì)胞IC50顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 下調(diào)miR-196b 對(duì)HeLa/DDP 耐藥細(xì)胞IC50 的影響（）Tab.3 Effect of down regulating miR-196b on IC50 of HeLa/DDP resistant cells（）

2.5 下調(diào)miR-196b 對(duì)HeLa/DDP 細(xì)胞凋亡的影響 與空白對(duì)照+DDP 組、陰性對(duì)照+DDP 組相比，miR-196b inhibitor-2+DDP 組細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）。見圖1、表4。

圖1 下調(diào)miR-196b對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞凋亡率的影響Fig.1 Effect of down regulating miR-196b on apoptosis rate of HeLa/DDP cells

表4 下調(diào)miR-196b對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞凋亡率的影響（）Tab.4 Effect of down regulating miR-196b on apoptosis rate of HeLa/DDP cells（）

表4 下調(diào)miR-196b對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞凋亡率的影響（）Tab.4 Effect of down regulating miR-196b on apoptosis rate of HeLa/DDP cells（）

2.6 下調(diào)miR-196b 對(duì)HeLa/DDP 細(xì)胞Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR 蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照+DDP組、陰性對(duì)照+DDP 組相比，miR-196b inhibitor-2+DDP 組細(xì)胞p-Akt、PI3K、p-mTOR 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05），Akt 蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5、圖2。

表5 下調(diào)miR-196b對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響（）Tab.5 Effect of down regulating miR-196b on Akt，p-Akt，PI3K，p-mTOR protein expression in HeLa/DDP cells（）

表5 下調(diào)miR-196b對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響（）Tab.5 Effect of down regulating miR-196b on Akt，p-Akt，PI3K，p-mTOR protein expression in HeLa/DDP cells（）

圖2 下調(diào)miR-196b 對(duì)HeLa/DDP 細(xì)胞Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of miR-196b down regulation on Akt，p-Akt，PI3K，p-mTOR protein expression in HeLa/DDP cells

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤［8］。近年來隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程的加劇以及生活環(huán)境、飲食習(xí)慣的轉(zhuǎn)變，宮頸癌發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，已成為影響中老年女性人群身心健康和生活質(zhì)量的主要腫瘤疾?。?］。目前宮頸癌治療方案主要為手術(shù)輔助鉑類藥物化療及同步放化療，其中鉑類抗癌藥物作為術(shù)前或術(shù)后的輔助治療，一定程度上對(duì)患者預(yù)后具有改善作用，在宮頸癌的治療中占有重要位置［10］。但部分患者在化療時(shí)，會(huì)產(chǎn)生順鉑耐藥從而影響療效導(dǎo)致高病死率［11］，因此積極研究探索宮頸癌順鉑耐藥的機(jī)制，提高宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑化療藥物的敏感性，成為目前醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)。本研究探討下調(diào)HeLa/DDP 細(xì)胞中miR-196b 表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥的影響，并分析其作用機(jī)制。

miRNA 是一類起始于細(xì)胞核，成熟于細(xì)胞質(zhì)的非編碼單鏈RNA 分子，廣泛存在于真核細(xì)胞中，在哺乳動(dòng)物中成熟miRNA 可對(duì)體內(nèi)60%左右基因進(jìn)行調(diào)節(jié)［12-13］。研究表明，人類基因中有2%～3%的miRNA 參與體內(nèi)30%左右的基因調(diào)控，miRNA 在人體所有組織及血液、尿液、唾液、腦脊液等體液中均可表達(dá)［14］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 具有癌基因與抑癌基因的雙重作用，其可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程［15］。研究者通過對(duì)宮頸癌組織標(biāo)本進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)70 個(gè)miRNA 表達(dá)明顯異常，其中68 個(gè)miRNA 表達(dá)顯著上調(diào)，而miR-149、miR-203 表達(dá)明顯下調(diào)，表明miRNA 在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用［16-17］。余昆等［18］研究發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)miR-196b-5p 表達(dá)促進(jìn)直腸癌細(xì)胞的增殖。ZHU 等［19］研究表明miR-196b-5p 通過下調(diào)COL1A1 可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。LI 等［20］報(bào)道，miR-196b 在肺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，miR-196b 可以通過下調(diào)GATA6 增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。以上研究提示，miR-196b 可能參與調(diào)控多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程。miR-196b作為一種miRNA 分子，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用［21］，但是有關(guān)miR-196b與宮頸癌關(guān)系的研究報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，與HeLa 細(xì)胞相比，HeLa/DDP 細(xì)胞miR-196b 表達(dá)顯著升高，表明miR-196b 在耐藥宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，miR-196b 可能在一定水平上促進(jìn)細(xì)胞耐藥；隨順鉑濃度增加HeLa/DDP、HeLa 細(xì)胞活力下降，經(jīng)計(jì)算HeLa 對(duì)順鉑的IC50為4.86 μmol/L，HeLa/DDP對(duì)順鉑的IC50為68.13 μmol/L，與HeLa 相比，HeLa/DDP 對(duì)順鉑的IC50顯著升高，提示HeLa/DDP 對(duì)順鉑的耐藥性遠(yuǎn)大于HeLa；與空白對(duì)照+DDP組、陰性對(duì)照+DDP 組相比，轉(zhuǎn)染后24 h、48 h，miR-196b inhibitor-2+DDP組細(xì)胞中miR-196b表達(dá)水平均明顯減少，表明下調(diào)基因miR-196b順鉑耐藥宮頸癌細(xì)胞株構(gòu)建成功，其中以轉(zhuǎn)染48 h 后miR-196b inhibitor-2+DDP組細(xì)胞中miR-196b表達(dá)水平最低，因此選miR-196b inhibitor-2+DDP 組轉(zhuǎn)染后48 h 進(jìn)行后續(xù)研究。本研究通過利用構(gòu)建好的miR-196b inhibitor-2 細(xì)胞，探索miR-196b 基因的下調(diào)對(duì)HeLa/DDP 細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥性的影響，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照+DDP組、陰性對(duì)照+DDP 組相比，miR-196b inhibitor-2+DDP 組細(xì)胞IC50顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著增加，表明下調(diào)miR-196b 可增加HeLa/DDP 細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，降低其耐藥性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

PI3K 屬于機(jī)體細(xì)胞內(nèi)重要磷脂酰肌醇激酶之一，由1 個(gè)催化亞基和1 個(gè)調(diào)節(jié)亞基組成，可作為關(guān)鍵信號(hào)分子參與機(jī)體多種生理活動(dòng)［22］。Akt 則為PI3K 下游直接靶蛋白，屬于一種原癌基因c-Akt 過表達(dá)產(chǎn)物，當(dāng)PI3K被激活后，促進(jìn)AKT發(fā)生磷酸化，活化的Akt可進(jìn)一步促進(jìn)其下游多種酶和轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生磷酸化作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。研究表明，PI3K/Akt通路可調(diào)控多種細(xì)胞生理信息傳導(dǎo)，參與機(jī)體內(nèi)各種生命活動(dòng)［23］。多項(xiàng)研究表明PI3K/Akt 信號(hào)通路與宮頸癌疾病進(jìn)展具有重要關(guān)系，BAHRAMI等［24］表明PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路在宮頸癌預(yù)后評(píng)估中具有重要價(jià)值；HUANG 等［25］報(bào)道基因FOXC1 可通過PI3K-AKT 信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌的細(xì)胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；DONG 等［26］發(fā)現(xiàn)依維莫司和紫杉醇可通過靶向PI3K/AKT/mTOR 途徑誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的凋亡，提示PI3K/Akt信號(hào)通路可能參與調(diào)控宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程，但是其與宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥性的關(guān)系目前尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照+DDP 組、陰性對(duì)照+DDP 組相比，miR-196b inhibitor-2+DDP組細(xì)胞p-Akt、PI3K、pmTOR 蛋白表達(dá)水平均明顯減少，Akt蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明下調(diào)基因miR-196b可抑制Akt、mTOR 蛋白磷酸化，抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活，推測(cè)下調(diào)基因miR-196b 可能通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而增加HeLa/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，降低其耐藥性，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，下調(diào)基因miR-196b 可增加HeLa/DDP 細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，降低其耐藥性，可能通過抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路活化，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為逆轉(zhuǎn)宮頸癌細(xì)胞化療耐藥性及基因靶向治療提供了新思路，但本研究未對(duì)miR-196b具體通過靶向哪些基因進(jìn)而調(diào)控PI3K 通路進(jìn)行深入分析，且miR-196b 在體內(nèi)與宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥的關(guān)系尚不清楚，有待進(jìn)一步深入探討。