貴 鵬 李朝旭 韓 莎 王勝濤 劉繼鴻 陳明洲

（桂林醫(yī)學院南溪山醫(yī)院，桂林 541003）

骨肉瘤是骨骼中最常見肉瘤，惡性程度高，主要影響兒童和青少年，但其發(fā)病原因及分子機制尚未闡明。盡管采用手術、新輔助化療等治療方案，非轉移性骨肉瘤患者預后及生存率顯著提高，但仍有約1/3 患者出現局部復發(fā)，其中轉移患者復發(fā)率高達1/4［1］。

miRNA 是一類具有高度保守性、時序性和特異性的非編碼小分子RNA，長度為22～25 個核苷酸，miRNA 通過與靶基因3'非翻譯區(qū)（3'UTR）不完全互補配對識別干預靶基因翻譯過程［2］。

RAC1、PAK1 在多個組織中表達，具有重要細胞功能，如細胞運動、細胞生存、細胞周期、血管生成、基因轉錄調節(jié)及腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移［3-4］。PAK1 為RAC1 通路中RAC1 蛋白的下游蛋白。RAC1 可促進PAK1 蛋白活化，進一步激活下游多種信號途徑，從而促進腫瘤細胞存活、增殖與遷移，抑制其凋亡，調節(jié)細胞骨架動力學和細胞黏附等活動［5］。

miRNA 家族重要成員miR-182在腫瘤發(fā)展過程中至關重要。研究表明，miR-182 在多種腫瘤中，如肺腺癌、乳腺癌和胃腸道腫瘤中可作為抑癌基因抑制腫瘤細胞生長［6-8］。但miR-182 是否能夠通過RAC1 通路抑制骨肉瘤生長尚無相關報道，因此，本研究通過檢測miR-182在成骨細胞及骨肉瘤中的表達差異，觀察miR-182 對RAC1 通路蛋白的調控作用，從而明確miR-182 對骨肉瘤HOS 細胞增殖的影響，為骨肉瘤早期診斷、基因治療提供新的思路，為臨床治療提供理論及實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 人骨肉瘤HOS 細胞購于中國科學院上海生物科學院細胞資源中心。

1.1.2 試劑 DMEN 培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Gibco 公司；CCK-8 試劑盒購于日本同人化學研究所；RAC1、PAK1 抗體購于美國Abcam 公司；Lipofectamine3000購于美國Lifecore公司；PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司；miR-182 mimic、miR-182 inhibitor、miR-182 NC購于蘇州GenePharma公司。

1.2 方法

1.2.1 miRNA-182 在骨肉瘤中的表達預測 采用TargetScan（www.targetscan.org）及MiRDB（www.mirdb.org）數據庫尋找RAC1蛋白的mRNA序列，預測能夠調控RAC1蛋白的潛在miRNA序列及其靶點。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 配制骨肉瘤HOS 細胞培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS+1%青-鏈霉素混合液）；當細胞生長至70%～80%融合時進行傳代，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)，傳至第三代備用。

1.2.3 細胞轉染 選取對數生長期骨肉瘤HOS 細胞進行miRNA 轉染。將miR-mimic、miR-inhibitor 和miRNA NC 相關試劑分別與無血清培養(yǎng)基充分混勻，將Lipofectamine3000 加至無血清培養(yǎng)基中充分混勻，將溶解miRNA 制劑的溶液同溶解轉染試劑的溶液混合后進行細胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)6 h 后更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

1.2.4 qPCR 檢測miRNA-182 表達 按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡkit 試劑盒說明制備PCR 反應液，按照ABI 7500 PCR 儀使用方法進行qPCR 反應，計算各組ΔCt 值。相關miRNA 正義鏈及反義鏈由上海吉瑪公司設計，miR-182 F：5'-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3'；miR-182 R：5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 F：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；U6 R：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。按照PrimeScript RT試劑盒說明制備RT反應液（所有操作冰上進行）：5×PrimeScript Buffer 2 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ0.5 μl，miRNA primer 0.5 μl，Random 6 mers 0.5 μl，加RNase Free ddH2O 至10 μl。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡkit試劑盒說明制備PCR 反應液（所有操作冰上進行）：2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 μl，miR-182 forward primer（10 μmol/L）0.4 μl，miR-182 reverse primer（10 μmol/L）0.4 μl，RT 反應液（cDNA）2 μl，ddH2O 7.2 μl。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞抑制率 分別設置HOS組、miR-182 NC 組、miR-182 mimic 組，每組設6 個復孔，取對數生長期細胞，在96 孔板中均勻接種細胞懸液，37℃、5%CO2孵育24 h、48 h。加入CCK-8試劑繼續(xù)孵育2 h。將96 孔板置于酶標儀中檢測吸光度，重復3次，計算細胞抑制率。

1.2.6 Western blot 實驗 提取各組總蛋白進行蛋白定量。80 V 恒壓電泳30 min，待分離膠和濃縮膠分離后，調整至120 V 恒壓電泳90 min，置于轉膜槽中轉膜（200 mA，2 h），牛奶封閉2 h，蛋白條帶放入相應山羊抗兔一抗中4℃孵育過夜，次日取出PVDF膜，放入相應二抗中孵育1 h，系統(tǒng)發(fā)光成像，計算目的蛋白RAC1、PAK1表達。

1.2.7 細胞處理及凋亡檢測 按照上述方法培養(yǎng)細胞及設置分組，培養(yǎng)24 h，消化，收集細胞；按照細胞凋亡試劑盒說明操作，流式細胞儀檢測。

1.2.8 細胞處理及周期檢測 按照上述方法培養(yǎng)細胞及設置分組，培養(yǎng)24 h，消化，收集細胞，預冷乙醇過夜固定，次日染色，流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Targetscan 及miRDB 數據庫篩選可能靶向RAC1 的miRNA 序列 通過TargetScan 及MiRDB 數據庫篩選可能靶向RAC1 的miRNA 的基因序列包含：miR-182、miR-96、miR-101、miR-142、miR-20、miR-365、miR-137（圖1）。miR-182 可能通過RAC1蛋白影響骨肉瘤HOS細胞生長。

圖1 生信網絡預測miR-182和RAC1表達Fig.1 Bioinformatics Network predicts expressions of miR-182 and RAC1

2.2 qPCR 檢測骨肉瘤HOS 細胞miR-182 表達qPCR 驗證各組細胞中miR-182 表達，結果顯示，與未轉染對照骨肉瘤HOS 細胞（2.02±0.11）相比，miR-182 NC 轉染組（陰性對照組）miR-182 表達（2.08±0.20）差異無統(tǒng)計學意義，miR-182 inhibitor轉染組miR-182 表達（0.65±0.32）顯著降低（P＜0.01），miR-182 mimic 轉染組miR-182 表達（2.81±0.15）顯著升高（P＜0.01，圖2）。

圖2 各組骨肉瘤HOS細胞中miR-182表達Fig.2 miR-182 expression in osteosarcoma HOS cells of each group

2.3 CCK-8檢測細胞增殖 CCK-8測定24 h、48 h、72 h 各組細胞OD 值，結果顯示，miR-182 NC 轉染組骨肉瘤HOS 細胞抑制率差異無統(tǒng)計學意義（圖3），miR-182 mimic 轉染組細胞抑制率分別為（34.12±0.20）%、（20.18±0.16）%、（8.25±16.00）%，顯著降低，標準曲線見圖4。

圖3 各組骨肉瘤HOS細胞OD值Fig.3 OD values of osteosarcoma HOS cells in each group

圖4 各組不同時期細胞濃度Fig.4 Cell concentration in different periods of each group

2.4 Western blot 檢測RAC1、PAK1 蛋白表達Western blot 驗證各組細胞RAC1、PAK1 蛋白表達，結果顯示，miR-182 NC轉染組細胞RAC1及PAK1蛋白表達與未轉染HOS 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與miR-182 mimic 轉染組細胞RAC1 及PAK1蛋白表達差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖5）。

圖5 各組骨肉瘤HOS細胞RAC1、PAK1蛋白表達Fig.5 Expressions of protein RAC1 and PAK1 proteins in osteosarcoma HOS cells of each group

2.5 流式細胞術檢測骨肉瘤HOS 細胞凋亡 流式細胞術檢測HOS 組、miR-182 NC 轉染組、miR-182 mimic 轉染組細胞凋亡率，結果顯示，miR-182 NC 轉染組［（4.93±0.51）%］與未轉染骨肉瘤HOS 細胞組［（5.58±0.42）%］細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），miR-182 mimic 轉染組［（22.66±0.42）%］細胞凋亡率顯著提高（P＜0.01，圖6）。

圖6 流式細胞術檢測各組骨肉瘤HOS細胞凋亡Fig.6 Flow cytometry to detect apoptosis of osteosarcoma HOS cells in each group

2.6 流式細胞術檢測骨肉瘤HOS 細胞周期 流式細胞術檢測未轉染HOS 組、miR-182 NC 轉染組、miR-182 mimic轉染組細胞周期，結果顯示，miR-182 mimic 組HOS 細胞G1 期占比［（55.26±0.72）%］與HOS 組及miR-182 NC 轉染組差異顯著（P＜0.01），S 期占比［（27.37±0.38）%］明顯下降（P＜0.01），G2期占比［（16.96±0.83）%］有所下降（P＜0.05，圖7）。

圖7 流式細胞術檢測各組骨肉瘤HOS細胞周期Fig.7 Flow cytometry detection of cell cycle of osteosarcoma HOS cells in each group

3 討論

目前骨肉瘤具體發(fā)病機制尚不明確，尚無有效治療方案。近年miRNA 在腫瘤中的研究取得重要進展，為腫瘤早期診斷、早期治療、化療耐藥、遠處轉移及改善預后等提供了新的思路，但miRNA 在骨肉瘤診斷治療等方面涉及較少，本研究通過探討miRNA 與骨肉瘤細胞的相關性及體外試驗，為揭示骨肉瘤發(fā)病機制、基因靶向治療提供實驗及理論基礎。

miRNA 相關拮抗藥物或基因模擬藥物已被設計用于癌癥治療。單個miRNA 同時靶向多個信號通路得到廣泛認同，為難治性癌癥治療提供了新的方案。

RAC1 信號傳導與多種腫瘤細胞生物過程相關，作為一種小的GTP 酶，通過調節(jié)RAC1能夠使腫瘤細胞切換活躍狀態(tài)和非活躍狀態(tài)。RAC1 激活后，與一系列效應子相互作用，介導腫瘤細胞多種生物學功能［9］。已有實驗證實PAK1 在多個致癌信號通路中的核心作用，其能夠調節(jié)腫瘤細胞的可辨識度，并降解腫瘤細胞防御能力，因此作為潛在的腫瘤細胞治療靶標引起廣泛關注［10］。BU 等［11］發(fā)現PAK1 信號傳導是RAC1 在血管生成中的關鍵下游介質，抑制RAC1和PAK1蛋白表達可降低腫瘤細胞血管生成能力。同樣，XIA 等［12］研究發(fā)現，抑制RAC1 或PAK1 可損傷癌細胞血管生成誘導能力。對小G 蛋白的研究也逐漸成為腫瘤研究的主要領域。

本研究發(fā)現，構建過表達miR-182 的細胞可有效抑制PAK1、RAC1蛋白活性，由此推測miR-182表達可介導GTP 酶活化，抑制骨肉瘤HOS 細胞生長，降低骨肉瘤HOS 細胞增殖能力并促進其凋亡，并抑制骨肉瘤HOS生長周期，降低S期比例，使多數細胞停滯于G1期。結合RAC1及PAK1蛋白介導的相關細胞功能，miRNA相關生物制劑或許可通過降低骨肉瘤細胞GTP 合成、骨肉瘤細胞血管生成從而降低骨肉瘤細胞活性。

通過構建miRNA 相關生物制劑可能影響骨肉瘤早期形成、遠期轉移及骨肉瘤耐藥機制等，從基因層面出發(fā)改變腫瘤細胞蛋白功能及RNA 翻譯轉錄過程，為精準靶向治療骨肉瘤開辟新的領域。