顧燕妮 王 嵩 謝春毅

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200082）

隨著全球社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，人類生活環(huán)境、方式和老齡化等諸多方面發(fā)生了巨大的改變，糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）發(fā)病率有較大的上升趨勢［1］。糖尿病性心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是指DM 患者在排除冠狀動脈疾病、高血壓和心臟瓣膜疾病等情況下發(fā)生的心力衰竭，屬DM 主要并發(fā)癥之一［2］。目前DM的發(fā)病機制仍不明確，近期研究更傾向于DM是一種慢性炎癥性疾?。?-4］。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是細胞內(nèi)生理和病理的代謝產(chǎn)物，作為細胞信號傳導(dǎo)分子參與細胞凋亡和炎癥反應(yīng)［5-6］。已有研究證明ROS 可激活下游c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路［7］。JNK 是絲氨酸/蘇氨酸激酶之一，屬于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）家族成員，它可以對各種應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生應(yīng)答，并促進炎癥發(fā)生和細胞凋亡［8-9］。

紅景天苷（salidrosides，SAL）是傳統(tǒng)中藥紅景天的主要化學(xué)成分，本課題組的前期研究已證明，SAL可以抑制JNK 信號通路并改善DCM 大鼠心肌纖維化［10］。本次研究試圖通過體外高糖心肌細胞（cardiomyocyte，CM）培養(yǎng)實驗進一步探討SAL 是否可通過減少ROS 從而抑制JNK 磷酸化及炎癥水平，以探討SAL對CM的藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 H9c2細胞由iCell（上海）生物技術(shù)股份有限公司提供（Lot：20200922）；DMEM 購自美國ThermoFisher科技（中國）有限公司（Lot：11885084）；胎牛血清購自美國Gemini Bioproducts LLC 公司（Lot：16000044）；胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司（Lot：20200624）；青霉素鏈霉素雙抗（Lot：ST488）、過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔（Lot：A0277）和羊抗鼠二抗（Lot：A0286）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SAL（Lot：FY1289B0510）購自南通經(jīng)緯生物有限公司；JNK 抑制劑SP600125（Lot：420119）、JNK1/2（Lot：ab112501）和p-JNK1/2 抗 體（Lot：ab131499）試劑盒購自美國Abcam 公司（上海）貿(mào)易有限公司；CCK8 試劑盒（Lot：A16776）、Bax 抗體（Lot：A7626）均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；ROS 試劑盒購自南京建成生物工程研究所（Lot：20201022）；GAPDH 抗體由美國Proteintech 集團有限公司提供（Lot：Ag0766）。ELISA 試劑盒和一般實驗室耗材由上海基爾頓生物基因有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) H9c2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和0.1 mg/ml 鏈霉素DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2 確定高糖刺激的時間 采用胰酶消化方法，取對數(shù)期H9c2細胞制成細胞懸液，按5×104個/孔接種于96 孔板。每1 ml DMEM 培養(yǎng)液另加入葡萄糖至終濃度為33.3 mmol/L（高糖），分別培養(yǎng)48 h、72 h 和96 h，每組設(shè)3 個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入CCK8 試劑10 μl，放入培養(yǎng)箱孵育3 h 后，用酶標(biāo)儀450 nm 處測定各孔吸光值，計算細胞活性。細胞活性=（實驗組-空白組）/（對照組-空白組）×100%。與普通DMEM 培養(yǎng)液H9c2 細胞比較，以細胞活性最小值確定為高糖誘導(dǎo)CM受損刺激時間。

1.2.3 確定SAL濃度 將H9c2細胞按5×104個/孔接種于96 孔板。在DMEM 培養(yǎng)液中分別加入0、5、10、20、40、80 μmol/L濃度的SAL，培養(yǎng)4 h后加入高濃度葡萄糖，調(diào)整DMEM 培養(yǎng)液中葡萄糖終濃度至33.3 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)96 h 后，用CCK8 試劑盒測定細胞活性。以細胞活性最大值確定SAL 有效濃度。

1.2.4 H9c2細胞培養(yǎng)實驗分組 取對數(shù)期生長細胞融合度達70%～80%的H9c2 細胞，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 后，將H9c2 細胞分為5 組。培養(yǎng)于普通DMEM 培養(yǎng)液（5.6 mmol/L 葡萄糖和27.7 mmol/L 20%甘露醇）的H9c2 細胞為對照組（C 組）；含33.3 mmol/L 高濃度葡萄糖DMEM 培養(yǎng)液的H9c2細胞為高糖組（HG 組）；高糖DMEM 培養(yǎng)液中加入10 μmol/L SAL為紅景天苷組（SAL組）；高糖DMEM培養(yǎng)液中加入10 μmol/L SP600125 為JNK 抑制劑組（SP組）；高糖DMEM培養(yǎng)液同時各加入10 μmol/L SAL 和SP600125 為聯(lián)合干預(yù)組（SAL+SP 組）。各組H9c2細胞均在5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱孵育96 h。

1.2.5 ROS 檢測 ROS 的檢測使用活性氧熒光探針（2，7-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）。細胞按1.2.4 分組以1×106個/孔接種于6 孔板，培養(yǎng)96 h 后，棄培養(yǎng)液，以1∶1 000 比例用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，每孔加入稀釋后DCFH-DA 1 ml，5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育45 min。用胰酶消化細胞1 min，加入完全培養(yǎng)基終止消化，制成細胞懸液，1 000 r/min 離心5 min 收集細胞，PBS 洗滌1 次，離心收集細胞沉淀后用PBS 重懸細胞，通過檢測DCF 熒光強度間接反映細胞氧化應(yīng)激的程度。使用流式細胞儀檢測各組H9c2細胞平均熒光強度。

1.2.6 Western blot 檢測 Western blot 方法檢測細胞中Bcl-2、Bax、JNK1/2 和p-JNK1/2 蛋白表達水平。各組細胞以1×106個/孔接種于6 孔板，培養(yǎng)96 h。收集細胞沉淀，加入細胞裂解液，冰上裂解細胞，并提取細胞總蛋白，采用BCA 法進行蛋白定量。然后進行SDS-PAGE 凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入各自特異性一抗，4℃孵育過夜，各種抗體稀釋比例分別為：Bcl-2 抗體1∶500、Bax 和JNK1/2 抗體1∶1 000、p-JNK1/2 抗體1∶2 000 和GAPDH 抗體1∶5 000。TBST 洗膜，加入熒光二抗，室溫孵育1 h，以電化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影。Image J 軟件分析各條帶灰度值，計算蛋白的相對表達量。

1.2.7 ELISA 檢測 各組細胞培養(yǎng)按1×106個/孔接種于6 孔板，收集細胞上清液1 ml，分別放入干凈1.5 ml尖底管，并隨即放入-20℃保存，3 h后置-80℃深低溫冰箱保存?zhèn)錅y。IL-6和TNF-α檢測采用美國Abcam 公司的已包被抗體的96 孔板。檢測前在室溫條件下解凍細胞培養(yǎng)上清液標(biāo)本，4 000 r/min 離心10 min，棄沉淀。每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測上清液標(biāo)本50 μl，后每孔加入抗體混合物50 μl，密封后置于400 r/min的平板振蕩器上，在室溫下孵育60 min。經(jīng)洗滌，拍干，隨后每孔加入100 μl TMB 顯影液，在400 r/min 的平板振蕩器上孵育10 min。加入終止液后，再振蕩10 min，記錄450 nm的吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。所有檢驗結(jié)果以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖刺激時間對H9c2細胞活性的影響 設(shè)普通DMEM 培養(yǎng)液孵育H9c2 細胞0 h 為對照組。與對照組比較，高糖DMEM 培養(yǎng)液孵育48 h 和72 h，H9c2 細胞活性未下降（P＞0.05）；高糖培養(yǎng)液孵育H9c2 細胞96 h 后，細胞活性顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.014）。因此，后續(xù)實驗確定采用高糖培養(yǎng)液誘導(dǎo)H9c2細胞活性下降的有效時間為96 h。H9c2細胞活性檢測結(jié)果見表1。

表1 高糖不同刺激時間對H9c2細胞活性的影響（，n=3）Tab.1 Effect of different time of high glucose induction on viability of H9c2 cell lines（，n=3）

表1 高糖不同刺激時間對H9c2細胞活性的影響（，n=3）Tab.1 Effect of different time of high glucose induction on viability of H9c2 cell lines（，n=3）

2.2 SAL 濃度對細胞活性的影響 SAL 5、10、20、40 和80 μmol/L 預(yù)處理H9c2 細胞，并給予高糖培養(yǎng)液誘導(dǎo)刺激96 h 后，細胞活性均高于未予SAL 處理的對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。其中使用10 μmol/L SAL組，H9c2細胞活性最高，與加入不同濃度SAL 的其他各組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。因此，后續(xù)實驗SAL 的有效濃度均采用10 μmol/L。不同SAL濃度對高糖刺激H9c2細胞活性的影響見表2。

表2 不同SAL濃度對H9c2細胞活性的影響（，n=3）Tab.2 Effects of different SAL concentrations on viability of H9c2 cell lines（，n=3）

表2 不同SAL濃度對H9c2細胞活性的影響（，n=3）Tab.2 Effects of different SAL concentrations on viability of H9c2 cell lines（，n=3）

2.3 SAL 可降低高糖誘導(dǎo)H9c2細胞的氧化應(yīng)激水平 與對照組比較，其他各組DCF 熒光強度均增高，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。與HG 組相比，SAL組與SAL+SP 組的DCF 熒光強度均明顯降低，具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；但SP 組對ROS 產(chǎn)生無顯著抑制作用，H9c2細胞平均DCF熒光強度雖有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.234）。結(jié)果表明，暴露于高糖環(huán)境的H9c2 細胞ROS 水平增高，SAL 可有效降低高糖誘導(dǎo)的ROS 產(chǎn)生，而JNK 抑制劑對高糖誘導(dǎo)的H9c2 細胞ROS 產(chǎn)生無明顯抑制作用。流式細胞術(shù)檢測高糖誘導(dǎo)的H9c2 細胞ROS 結(jié)果見表3、圖1。

圖1 SAL對高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞ROS水平的影響Fig.1 Effect of SAL on ROS production in H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose

表3 SAL 對高糖誘導(dǎo)的H9c2 細胞ROS 水平的影響（，n=3）Tab.3 Effect of SAL on ROS production in H9c2 cells induced by high glucose（，n=3）

表3 SAL 對高糖誘導(dǎo)的H9c2 細胞ROS 水平的影響（，n=3）Tab.3 Effect of SAL on ROS production in H9c2 cells induced by high glucose（，n=3）

2.4 SAL 可抑制JNK 磷酸化 高糖誘導(dǎo)的H9c2 細胞的JNK 和p-JNK 表達水平均明顯上調(diào)，與C 組比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；與HG 組比較，SAL組p-JNK表達下調(diào)，并具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），而JNK 表達雖有下降，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.137）；SP600125 可顯著降低p-JNK 表達水平（P＜0.01），同時也抑制了JNK 的表達（P＜0.05）；而SAL+SP 組結(jié)果顯示，p-JNK 和JNK 表達水平均顯著下調(diào)（P均＜0.01）。表明SAL具有類似于JNK抑制劑的作用，可以阻止JNK 磷酸化。SAL抑制JNK 磷酸化表達結(jié)果見表4、圖2。

圖2 SAL對暴露于高糖環(huán)境中H9c2細胞JNK和p-JNK表達水平的影響Fig.2 Effects of SAL on expression levels of JNK and p-JNK in H9c2 cells induced by high glucose

表4 SAL對暴露于高糖環(huán)境中H9c2細胞JNK和p-JNK表達水平的影響（，n=3）Tab.4 Effects of SAL on expression levels of JNK and p-JNK in H9c2 cells induced by high glucose（，n=3）

表4 SAL對暴露于高糖環(huán)境中H9c2細胞JNK和p-JNK表達水平的影響（，n=3）Tab.4 Effects of SAL on expression levels of JNK and p-JNK in H9c2 cells induced by high glucose（，n=3）

2.5 SAL 可降低高糖誘導(dǎo)的H9c2 細胞炎癥反應(yīng)表5 顯示高糖誘導(dǎo)H9c2 細胞IL-6 和TNF-α 的表達結(jié)果。與對照組比較，HG 組H9c2 細胞IL-6 和TNF-α 表達水平均顯著升高（P＜0.01）。與HG 組比較，SAL組、SP組和SAL+SP 組干預(yù)后，IL-6和TNF-α表達均顯著下調(diào)（P＜0.01），而SAL+SP 組對IL-6 的抑制效應(yīng)更為顯著，提示SAL 和JNK 抑制劑聯(lián)合使用可能對前炎癥因子具有更為強大的抑制作用。而SAL 組與SP 組對前炎癥因子的抑制作用基本等同，說明在抑制高糖誘導(dǎo)的CM 炎癥方面SAL 與JNK抑制劑的作用可能是等效的。

表5 SAL對高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞IL-6和TNF-α表達水平的影響（，n=3）Tab.5 Effect of SAL on IL-6 and TNF-α expressions in H9c2 cells cultured under high glucose circumstance（，n=3）

表5 SAL對高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞IL-6和TNF-α表達水平的影響（，n=3）Tab.5 Effect of SAL on IL-6 and TNF-α expressions in H9c2 cells cultured under high glucose circumstance（，n=3）

2.6 SAL 可下調(diào)Bax 表達并抑制H9c2 細胞凋亡表6 顯示了SAL 對高糖誘導(dǎo)的H9c2 細胞中Bcl-2和Bax 表達水平。與對照組相比，高糖DMEM 培養(yǎng)液誘導(dǎo)的H9c2 細胞內(nèi)Bcl-2 表達顯著下調(diào)，Bax 表達顯著上調(diào)（P＜0.01），Bcl-2/Bax 比值顯著降低（P＜0.01）。與HG 組相比，SAL 組和SP 組Bcl-2 表達水平存在增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P分別為0.265和0.08），而Bax表達水平明顯下調(diào)（P＜0.05）；SAL 組Bcl-2/Bax 升高（P＜0.05），而SP600125 可顯著提高該比值（P＜0.01）；SAL+SP 組聯(lián)合干預(yù)后，H9c2 細胞Bcl-2 表達增高（P＜0.05），Bax 表達顯著下降（P＜0.01），且Bcl-2和Bax表達水平與正常對照組結(jié)果接近（P＞0.05），同時Bcl-2/Bax 升高（P＜0.01）。結(jié)果表明，SAL和JNK 抑制劑主要是通過下調(diào)Bax 表達水平，提高Bcl-2/Bax，而SAL+SP 聯(lián)合干預(yù)組既可增強Bcl-2 的表達，同時又可抑制Bax 的表達，聯(lián)合干預(yù)可能更有利于減少CM細胞凋亡。

表6 SAL對高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞Bcl-2和Bax表達水平的影響（，n=3）Tab.6 Effect of SAL on Bcl-2 and Bax expressions in H9c2 cells cultured in high glucose condition（，n=3）

表6 SAL對高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞Bcl-2和Bax表達水平的影響（，n=3）Tab.6 Effect of SAL on Bcl-2 and Bax expressions in H9c2 cells cultured in high glucose condition（，n=3）

圖3 SAL對高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞Bcl-2和Bax表達水平的影響Fig.3 Effect of SAL on Bcl-2 and Bax expressions in H9c2 cells cultured in high glucose condition

3 討論

DCM 是DC 的常見并發(fā)癥之一，DCM 潛在的病理改變包括炎癥發(fā)生、葡萄糖/脂肪酸代謝紊亂和鈣信號傳導(dǎo)異常等，最終導(dǎo)致心肌纖維化和心肌肥大［11］。H9c2細胞是高糖誘導(dǎo)的CM損傷最常用的實驗細胞株［12］。多個研究指出，與暴露于5.5 mmol/L葡萄糖濃度相比，高糖可使H9c2 細胞面積增大，提示高糖可誘導(dǎo)CM 肥厚［13-14］。因此，本實驗也采用相同實驗方法模擬DCM的心肌損害。

紅景天是傳統(tǒng)中草藥，為景天科植物紅景天Rholiolarosea Limn.或大花紅景天R.euryphylla（Frod.）S.H.Fu.的根莖。歸肺、心經(jīng)，具有健脾益氣，清肺止咳，活血化瘀的功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將紅景天列為上品，記載“景天，味苦平。主大熱，火瘡，身熱煩，邪惡氣……”?！侗静菥V目》記載“紅景天，本經(jīng)上品，祛邪惡氣，補諸不足”。SAL 為紅景天的重要化學(xué)成分，而中草藥很大一部分功能是免疫調(diào)節(jié)。紅景天已廣泛用于中醫(yī)辨證為心血瘀阻證的疾病，其主要功效為活血化瘀，近年來也較多用于DM 和DCM。SAL 對心臟可能具有保護作用，可通過抗氧化以及抑制自由基保護CM。體內(nèi)、外實驗均表明SAL 可以減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠心肌炎癥［15］。劉曉丹等［16］研究發(fā)現(xiàn)，SD 大鼠心肌缺血-再灌注損傷模型給予SAL后CM凋亡率下降。

ROS 在細胞信號傳遞中發(fā)揮重要作用，過多產(chǎn)生ROS 可對機體造成損傷［17］。胰島素抵抗以及細胞內(nèi)高糖可使CM 產(chǎn)生過量的ROS，可能是DM 導(dǎo)致心肌損害的發(fā)病機制之一［18］。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)H9c2 細胞暴露于高糖環(huán)境后，ROS 水平顯著升高，SAL 以及SAL 和JNK 抑制劑聯(lián)合干預(yù)可有效抑制H9c2 細胞ROS 的產(chǎn)生。這表明SAL 重要的作用之一是抑制高糖誘導(dǎo)的ROS。已有多個研究表明JNK信號通路是ROS 重要的下游信號，ROS 可通過激活JNK 并促進細胞凋亡［7，19］。本次研究中也發(fā)現(xiàn)JNK抑制劑對高糖誘導(dǎo)的ROS表達無明顯影響。

本次研究結(jié)果表明在高糖誘導(dǎo)H9c2 細胞中JNK 和p-JNK 表達均顯著上調(diào)，SAL 干預(yù)可抑制高糖誘導(dǎo)p-JNK 表達，重復(fù)了本課題組先前實驗的結(jié)果［10］。而聯(lián)合使用SAL 和JNK 抑制劑對p-JNK 和JNK 表達抑制作用更為顯著。SAL 可降低JNK 磷酸化水平，抑制JNK信號通路。

炎癥反應(yīng)在DCM 的病變中有重要作用。研究表明高血糖激活TLR4 誘導(dǎo)心臟炎癥引起DCM 病變［20］。王麗萍等［21］研究證實，DCM 大鼠外周血中前炎癥因子IL-6和TNF-α表達水平增高。而SHARMA等［22］的研究提出，TNF-α 可降低肌肉組織對胰島素的敏感性，抑制TNF-α 和IL-6可保護DCM 大鼠心肌損害。本次實驗發(fā)現(xiàn)，暴露于高糖環(huán)境H9c2 細胞TNF-α 和IL-6 顯著增高，與王麗萍等［21］研究結(jié)果一致。SAL 和JNK 抑制劑都可顯著抑制TNF-α 和IL-6的表達，且都表現(xiàn)為對IL-6 分泌的抑制作用更為顯著。

大多研究表明，DCM 病程進展中CM 凋亡增加。MALEK 等［23］發(fā)現(xiàn)替米沙坦（telmisartan）和腦啡肽酶抑制劑塞奧芬（thiorphan）聯(lián)合治療可以改善鏈脲佐霉素（streptozocin，STZ）誘導(dǎo)的DCM 大鼠模型的左室功能障礙，并減少CM 凋亡。該研究指出，抑制CM 凋亡可能是預(yù)防DM 心臟病變的有效干預(yù)措施。WANG 等［24］發(fā)現(xiàn)尼可地爾（nicorandil）雖不能降低DCM 大鼠的血糖，但是可以緩解心肌肥厚，可能與降低CM凋亡率有關(guān)。正常機體中，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax處于平衡狀態(tài)。應(yīng)激狀態(tài)下，Bcl-2表達抑制可促進細胞內(nèi)源性凋亡。因此，Bcl-2/Bax也可用于表達細胞存活和凋亡的水平［25-26］。本研究結(jié)果提示，SAL 和JNK 抑制劑都可上調(diào)高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞的Bcl-2表達，但作用并不顯著（P=0.265），而對下調(diào)Bax 的表達和提高Bcl-2/Bax 有顯著作用（P＜0.05）。SAL 和JNK 抑制劑聯(lián)合干預(yù)后，對高糖誘導(dǎo)的H9c2 細胞Bcl-2 和Bax 都有調(diào)節(jié)作用，表明SAL具有類似于JNK抑制劑作用。

體外CM 培養(yǎng)實驗表明，高糖可誘導(dǎo)CM 產(chǎn)生過量ROS，ROS 可激活JNK 信號通路，導(dǎo)致CM 炎癥發(fā)生和凋亡增加。SAL 具有抑制高糖誘導(dǎo)的CM 產(chǎn)生ROS，并減少JNK 信號通路激活，降低CM 產(chǎn)生前炎癥因子以及細胞凋亡。因此，SAL 具有CM 保護作用，主要與抗炎和抗氧化特性有關(guān)，這可能是SAL對保護DM 過程中心臟病變的分子機制之一，有待今后DM 動物實驗中進一步證實其對CM 治療作用。JNK 抑制劑并不具備抗氧化作用，但與SAL 聯(lián)合干預(yù)的疊加效應(yīng)也有待進一步研究。