高 遠(yuǎn) 李 冀 韓東衛(wèi)（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150040）

肝癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是主要的致死性惡性腫瘤之一。根據(jù)組織病理學(xué)特征，肝癌可分為：肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管癌以及混合型肝癌等類(lèi)型，其中肝細(xì)胞癌最為常見(jiàn)，占肝癌總數(shù)的90%以上［1］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，2018 年全球范圍內(nèi)肝癌發(fā)病人數(shù)占惡性腫瘤發(fā)病總數(shù)的4.7%，死亡人數(shù)占腫瘤致死的8.2%，我國(guó)肝癌新發(fā)患者占全球肝癌新發(fā)患者的45%，同時(shí)，因肝癌致死的患者占全球的43%，且其發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)還在逐年增加［2-3］。目前臨床上對(duì)于肝癌患者主要采取手術(shù)、介入、放療、化療及分子靶向治療等手段。早期患者以手術(shù)治療為主，但肝癌發(fā)病隱匿、進(jìn)展快，同時(shí)又缺乏早期診斷手段，大部分患者確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)，化療和分子靶向治療是其主要治療手段，而化療藥在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，會(huì)不可避免地?fù)p傷正常細(xì)胞，且長(zhǎng)期使用化療會(huì)使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性，導(dǎo)致藥效降低［4-5］。因此，探尋低毒、有效的化療藥物或輔助藥物降低化療藥物毒性、提高藥效是當(dāng)前臨床醫(yī)生關(guān)注的重點(diǎn)。

芥子堿（sinapine）是一種季銨鹽生物堿，廣泛存在于油菜、芥菜等十字花科植物中，既往研究表明，芥子堿具有一定的抗腫瘤作用，但其在肝癌中的作用報(bào)道較少［6-8］。本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和裸鼠皮下荷瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，借助高通量測(cè)序等手段，初步探究芥子堿抗肝癌作用及其可能的作用機(jī)制，為后續(xù)進(jìn)行化療藥物增敏實(shí)驗(yàn)及臨床上作為肝癌患者的輔助性治療藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源 HepG2 人肝癌細(xì)胞系和LO2 人正常肝細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑與儀器 DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶和1%青、鏈霉素雙抗購(gòu)自武漢賽維爾生物科技公司；芥子堿購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；抗p53（#2527）、p21（#2947）、GAPDH（#5174）、Bax（#5023）和Bcl-2（#4223）單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2 人肝癌細(xì)胞和LO2 人正常肝細(xì)胞用DMEM 完全培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中（37℃、5%CO2）常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液，待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞匯合度達(dá)90%后鋪板進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測(cè) 將HepG2 細(xì)胞按照1×104個(gè)/孔均勻接種于96 孔板，待細(xì)胞貼壁后，用不同濃度的芥子堿（0、25、50、100、200 和500 μmol/L）處理24 h 和48 h。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，加入10 μl CCK-8試劑，空白組中加入100 μl 含10%CCK-8 試劑的培養(yǎng)基，37℃避光孵育1 h 后，檢測(cè)各孔吸光度值（A450）。細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值）/（對(duì)照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 將HepG2 細(xì)胞均勻接種于6 孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)60%～70%后，換液并加入含有芥子堿的培養(yǎng)基，調(diào)整各孔中芥子堿濃度依次為0、25、50、100 μmol/L，24 h后收集細(xì)胞（保留上清液中的細(xì)胞），用500 μl結(jié)合緩沖液重懸后依次加入5μl Annexin V/FITC 和5 μl PI，室溫下避光孵育20 min，隨即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Western blot 用芥子堿（0、50 μmol/L）處理HepG2 細(xì)胞24 h 后，RIPA 提取總蛋白，BCA 法常規(guī)定量后調(diào)整蛋白濃度為2 μg/μl，取20 μg 總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，常規(guī)轉(zhuǎn)膜、封閉后，將PVDF 膜置于相應(yīng)一抗（稀釋比為1∶1 000）中在4℃冰箱孵育過(guò)夜，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h后，ECL試劑盒顯影，隨后進(jìn)行曝光分析。

1.2.5 RNA-Seq 測(cè)序分析 收集50 μmol/L 芥子堿處理24 h后的肝癌細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA，由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行RNA-Seq 測(cè)序分析，使用R 軟件進(jìn)行差異基因篩選，認(rèn)為符合|log2Fold Change|＞1 且P-value＜0.05的基因?yàn)椴町惢?，使用GSEA 4.0.4軟件進(jìn)行基因集富集分析。

1.2.6 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 新購(gòu)裸鼠待適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。將HepG2 細(xì)胞接種在裸鼠背部皮下，接種量約為5×106個(gè)/只，接種后隔天觀察，1 周后開(kāi)始腹腔注射，實(shí)驗(yàn)組裸鼠注射芥子堿（2 mg/kg），對(duì)照組裸鼠注射同等體積的DMSO。每隔3 d 用卡尺測(cè)量皮下腫瘤的長(zhǎng)、短徑，4 周后處死裸鼠，瘤體組織液氮凍存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。皮下瘤的體積=瘤體長(zhǎng)徑×瘤體短徑2/2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS20.0 軟件和R3.6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組或多組間比較使用t檢驗(yàn)或方差分析。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芥子堿對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞活力的影響 隨著芥子堿藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HepG2細(xì)胞活力顯著降低；芥子堿對(duì)LO2 細(xì)胞活力影響較小，表明芥子堿能時(shí)間和濃度依賴(lài)地抑制HepG2 細(xì)胞活力。見(jiàn)圖1。

圖1 芥子堿對(duì)LO2和HepG2細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of sinapine on cell viability of LO2 and HepG2 cells

2.2 芥子堿對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞凋亡的影響 采用PI和Annexin V/FITC熒光染料結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)芥子堿對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，芥子堿能誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡，且隨著芥子堿藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率顯著提高。見(jiàn)圖2。

圖2 芥子堿誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡Fig.2 Sinapine induced apoptosis of HepG2 cells

2.3 芥子堿對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞p53 信號(hào)通路的影響 芥子堿處理后，HepG2 細(xì)胞中有869 個(gè)基因表達(dá)水平發(fā)生改變，其中334 個(gè)基因表達(dá)水平上調(diào)，535 個(gè)基因表達(dá)水平下調(diào)（圖3A）；對(duì)基因表達(dá)矩陣進(jìn)行基因集富集分析發(fā)現(xiàn)，p53 信號(hào)通路顯著富集（圖3B、C）。因此，本研究進(jìn)一步檢測(cè)芥子堿（50 μmol/L）對(duì)HepG2 細(xì)胞中p53、p21 及其下游凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平的影響。Western blot 結(jié)果表明，芥子堿處理后，HepG2 細(xì)胞中p53、p21 及Bax 蛋白水平顯著增加，Bcl-2 蛋白水平顯著降低（圖3D、E）。

圖3 芥子堿對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞p53信號(hào)通路的影響Fig.3 Effect of sinapine on p53 signal pathway of HepG2 cells

2.4 敲低p53 基因阻遏芥子堿對(duì)細(xì)胞活力和凋亡的影響 為進(jìn)一步驗(yàn)證p53信號(hào)通路在芥子堿影響HepG2 細(xì)胞活力和凋亡中的作用，本研究設(shè)計(jì)p53特異性siRNA，由圖4 可知，p53 特異性siRNA 能顯著敲低p53 蛋白水平（圖4A、B）。CCK-8 結(jié)果表明，敲低p53 能減輕芥子堿（50 μmol/L）對(duì)HepG2 肝癌細(xì)胞活力的抑制作用（圖4C），且敲低p53 能減緩芥子堿（50 μmol/L）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖4D）。以上結(jié)果表明，芥子堿通過(guò)激活p53 信號(hào)通路抑制HepG2細(xì)胞活力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖4 敲低p53基因阻遏芥子堿對(duì)細(xì)胞活力和凋亡的影響Fig.4 Knockdown of p53 suppresses the effect of sinapine on cell viability and apoptosis

2.5 芥子堿對(duì)裸鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)的影響 為進(jìn)一步驗(yàn)證芥子堿在體抗肝癌作用，本研究通過(guò)皮下接種肝癌HepG2 細(xì)胞，構(gòu)建裸鼠皮下腫瘤模型，接種1 周后通過(guò)腹腔注射芥子堿，定期監(jiān)測(cè)皮下腫瘤的生長(zhǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芥子堿能顯著抑制裸鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng)（圖5A）；對(duì)腫瘤組織進(jìn)行蛋白水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，芥子堿處理的肝癌組織中p53、p21 及Bax 水平顯著升高，Bcl-2 表達(dá)水平顯著降低（圖5B、C），進(jìn)一步說(shuō)明芥子堿可能通過(guò)激活肝癌細(xì)胞中p53信號(hào)通路從而發(fā)揮對(duì)肝癌的抑制作用。

圖5 芥子堿對(duì)在體腫瘤生長(zhǎng)及腫瘤組織中p53信號(hào)通路的影響Fig.5 Effect of sinapine on tumor growth in vivo and p53 signaling pathway in tumor tissues

3 討論

芥子堿作為一種來(lái)源廣泛的天然中藥材，具有多種藥理學(xué)作用，包括抑制新生血管生成、抗炎、抗氧化、降低血壓、平喘等，其副作用較小，但大量服用可能引起惡心、嘔吐等胃腸道刺激反應(yīng)［9-11］。目前，關(guān)于芥子堿的抗腫瘤活性也有相關(guān)報(bào)道。GUO等［7］研究發(fā)現(xiàn)，芥子堿可通過(guò)抑制P-gp（P-glycoprotein）蛋白的表達(dá)從而發(fā)揮對(duì)結(jié)腸癌Caco-2 細(xì)胞的抑制作用；GUO 等［8］研究表明，芥子堿可通過(guò)下調(diào)ERK1/2-NF-κB 信號(hào)通路活性逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7 細(xì)胞對(duì)阿霉素的抵抗，這些研究提示芥子堿能在體外抑制腫瘤細(xì)胞，同時(shí)可能作為潛在的輔助化療藥物。因此，本研究基于芥子堿的抗腫瘤活性，研究芥子堿對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞活力、凋亡及在體腫瘤生長(zhǎng)的影響，并借助RNA 測(cè)序和生物信息學(xué)分析，初步探究其作用機(jī)制。

本研究使用不同濃度的芥子堿處理肝癌HepG2 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芥子堿能抑制肝癌HepG2 細(xì)胞活力，并表現(xiàn)出時(shí)間和濃度依賴(lài)。同時(shí)，裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)也表明，芥子堿能抑制裸鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng)，說(shuō)明芥子堿能在體內(nèi)、體外發(fā)揮抗肝癌作用。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的常見(jiàn)機(jī)制，因此，本研究檢測(cè)芥子堿對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞凋亡的影響。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，隨著藥物濃度的增加，HepG2 細(xì)胞凋亡率顯著升高，表明芥子堿能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步探究芥子堿抗肝癌的作用機(jī)制，本研究借助RNA-Seq 測(cè)序手段，對(duì)芥子堿處理后改變的基因進(jìn)行大規(guī)模篩選，以便明確其可能影響的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路。分析基因測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芥子堿處理后，HepG2 細(xì)胞中有869 個(gè)基因表達(dá)水平發(fā)生改變，同時(shí)對(duì)基因表達(dá)矩陣進(jìn)行基因集富集分析發(fā)現(xiàn)，p53 信號(hào)通路顯著富集，表明p53 信號(hào)通路可能在芥子堿誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活力降低過(guò)程中具有重要作用。

p53 作為經(jīng)典的抑癌基因，在各種類(lèi)型腫瘤中的作用被廣泛報(bào)道，其本身可作為細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)下游如p21、Gadd45、Bax 等靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、周期、凋亡及DNA 損傷等生物學(xué)過(guò)程［12-13］；同時(shí)，其活性受磷酸化、乙?；?、甲基化、泛素化及棕櫚?；雀鞣N轉(zhuǎn)錄后修飾的調(diào)控，參與調(diào)控使得生物學(xué)過(guò)程更為復(fù)雜，且與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［14-15］。本研究發(fā)現(xiàn)，芥子堿處理后，肝癌細(xì)胞和肝癌樣本中p53、p21 及Bax蛋白水平顯著增加，Bcl-2蛋白水平顯著降低，說(shuō)明芥子堿處理能引起p53信號(hào)通路的激活。為進(jìn)一步明確p53信號(hào)通路的激活在芥子堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活力下降中的作用，本研究檢測(cè)在p53 敲低的細(xì)胞中，芥子堿對(duì)細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)敲低p53 能部分阻遏芥子堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活力下降，進(jìn)一步表明芥子堿通過(guò)激活p53 信號(hào)通路發(fā)揮抗肝癌作用，同時(shí)，由于敲低p53只能部分阻遏芥子堿對(duì)肝癌細(xì)胞的作用，說(shuō)明其他生物學(xué)過(guò)程或信號(hào)通路可能也發(fā)揮一定作用，這有待后續(xù)進(jìn)一步探索。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，芥子堿處理能引起p21蛋白水平上調(diào)，p21作為參與細(xì)胞周期調(diào)控的重要負(fù)性調(diào)控蛋白，通過(guò)抑制CDK（cyclin dependent kinase）家族蛋白活性，影響細(xì)胞周期進(jìn)程［16］，因此，芥子堿也可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯從而發(fā)揮抗肝癌作用。不過(guò)，本研究尚未深入探究芥子堿激活p53 信號(hào)通路的具體機(jī)制，這有待后續(xù)進(jìn)一步探索。

綜上所述，芥子堿可通過(guò)激活p53 信號(hào)通路在體內(nèi)和體外發(fā)揮抗肝癌作用，后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步深入探究芥子堿能否與化療藥物配伍使用及其對(duì)化療藥物藥效的影響，以期為芥子堿用于臨床肝癌患者的治療提供基礎(chǔ)。