代雯文 妥亞軍 侯 濱 王 梁

（青海省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西寧 810000）

肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae，SP）是人類(lèi)最重要的呼吸道病原體之一，是全球肺炎的主要原因［1］。尤其在患有醫(yī)學(xué)合并癥的患者中，SP 疾病與大量患者發(fā)病和死亡密切相關(guān)［2］。SP引起肺部感染的特征是中性粒細(xì)胞（多形核細(xì)胞）浸潤(rùn)肺泡，如果不及時(shí)解決，會(huì)加劇感染的全身擴(kuò)散［3］。這不僅增加了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還對(duì)患者的生活質(zhì)量造成影響。1，25-二羥維生素D3［1，25（OH）2D3］是維生素D3生物活性代謝產(chǎn)物，既往研究表明，1，25（OH）2D3可誘導(dǎo)膀胱癌、糖尿病足潰瘍角質(zhì)細(xì)胞中抗菌肽的表達(dá)［4-5］。低水平的維生素D 可能增加上呼吸道感染，而1，25（OH）2D3可以提高抗菌肽的表達(dá)，從而改善肺炎支原體感染［6］。1，25（OH）2D3與機(jī)體免疫功能有關(guān)，可通過(guò)抑制多種炎癥因子表達(dá)而實(shí)現(xiàn)保護(hù)糖尿病大鼠肺臟病變的作用［7］。SP 是社區(qū)獲得性肺炎的主要致病菌，抗生素的濫用使耐藥菌泛濫，1，25（OH）2D 類(lèi)似物可促進(jìn)抗菌肽的合成發(fā)揮抗炎抗菌作用，對(duì)耐藥菌同樣有效［8］。然而關(guān)于1，25（OH）2D3在SP 感染的肺炎中的作用，這方面的資料尚不多見(jiàn)。另外，干擾核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65 的表達(dá)有助于抑制SP 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡及炎癥因子的表達(dá)［9］。在卵清蛋白誘導(dǎo)的哮喘模型中，1，25（OH）2D3處理會(huì)降低NFκB p65的表達(dá)［10］。因此，本研究利用SP感染肺泡上皮細(xì)胞，觀察1，25（OH）2D3、NF-κB p65 siRNA 單獨(dú)或聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并初步探索其潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 肺泡上皮細(xì)胞A549購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；SP BAA-255 購(gòu)自美國(guó)典藏培養(yǎng)物保存中心；1，25（OH）2D3、胰酶、RIPA 裂解液、噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；NF-κB p65 siRNA、陰性對(duì)照siRNA-NC購(gòu)自上海GenePharma 公司；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamine 2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；Annexin VFITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物公司；β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl2）、Bcl2 相關(guān)X 蛋 白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、NF-κB p65、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB p-p65 蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組 A549 細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，置于37℃、3%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，使用胰酶消化，進(jìn)行接種傳代。調(diào)整處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，接種于6 孔板。細(xì)胞融合度約70%時(shí)，利用Lipofectamine 2000 試劑，將NF-κB p65 siRNA 轉(zhuǎn)染入A549 細(xì)胞。選取A549 細(xì)胞，隨機(jī)分為Control 組（不加任何處理的A549 細(xì)胞）、SP 組（1×108CFU/ml SP 培養(yǎng)A549 細(xì)胞24 h［8］）、SP+siRNA-NC 組（SP 培養(yǎng)轉(zhuǎn)染siRNA-NC的A549 細(xì)胞24 h）、SP+1，25（OH）2D3組［SP 和100 nmol/L 1，25（OH）2D3培養(yǎng)A549 細(xì)胞24 h］、SP+NF-κB p65 siRNA 組（SP 培養(yǎng)轉(zhuǎn)染NF-κB p65 siRNA的A549 細(xì)胞24 h）、SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 si-RNA 組［SP 和1，25（OH）2D3培養(yǎng)轉(zhuǎn)染NF-κB p65 siRNA 的A549 細(xì)胞24 h］。其中，SP 培養(yǎng)于脫纖維羊血（5%）的血平板，實(shí)驗(yàn)前，SP 于托休二氏溶液（含0.5%酵母）中培養(yǎng)12 h。A549 細(xì)胞在SP 感染前的48 h轉(zhuǎn)染NF-κB p65 siRNA。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)NF-κB p65 mRNA 表達(dá) 收集各組A549 細(xì)胞，TRIzol 試劑提取總RNA，之后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參，qRT-PCR 檢測(cè)NF-κB p65 mRNA 表達(dá)。NF-κB p65正向引物序列5'-ACAACCCCTTCCAAGTTCCT-3'，反向引物序列5'-TGGTCCCGTGAAATACACCT-3'。β-actin 正向引物序列5'-AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3'，反向引物序列5'-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3'。反應(yīng)結(jié)束后，以2-ΔΔCt法計(jì)算NF-κB p65 mRNA表達(dá)量。

1.2.3 Western blot A549 細(xì)胞中 加入RIPA 裂 解液，置冰上提取總蛋白。提取到的蛋白沸水變性10 min，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，之后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，分別加入NF-κB p65、Bax、Bcl2、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB p-p65 蛋白一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日用Tris-HCl-Tween 緩沖鹽溶液（tris buffered saline with tween，TBST）洗膜10 min×3 次，加入1∶5 000 稀釋的二抗，孵育1 h，TBST 洗膜10 min×3 次，顯色、顯影，以β-actin 為內(nèi)參蛋白，分析NF-κB p65、Bax、Bcl2、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB p-p65蛋白表達(dá)量。

1.2.4 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力 各組A549細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個(gè)/ml，接種于96孔板。培養(yǎng)48 h，各孔加入5 mg/ml MTT 溶液100 μl，孵育4 h，棄去上清，加入二甲基亞砜（DMSO）200 μl，37℃搖床中振蕩10 min，于酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm 處的吸光度（OD）值，計(jì)算相對(duì)細(xì)胞活力。相對(duì)細(xì)胞活力（%）=對(duì)照組OD值/實(shí)驗(yàn)組OD值×100%

1.2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的步驟評(píng)估細(xì)胞凋亡。調(diào)整各組A549 細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，使用500 μl緩沖液重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5 μl，輕輕混勻，加入PI染色液5 μl，輕輕混勻，室溫、避光反應(yīng)15 min，置流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以表示。兩組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 1，25（OH）2D3聯(lián)合NF-κB p65 siRNA 對(duì)SP 感染的肺泡上皮細(xì)胞A549 中NF-κB p65 表達(dá)的影響 qRT-PCR 和Western blot 分別檢測(cè)肺泡上皮細(xì)胞A549中NF-κB p65 mRNA和蛋白表達(dá)（圖1、表1），結(jié)果顯示，SP組、SP+siRNA-NC組、SP+1，25（OH）2D3組、SP+NF-κB p65 siRNA 組A549 細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA 和蛋白表達(dá)量明顯高于Control 組（P＜0.05）；SP+1，25（OH）2D3組、SP+NF-κB p65 siRNA 組、SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 siRNA 組A549 細(xì) 胞 中NF-κB p65 mRNA 和蛋白表達(dá)量顯著低于SP 組（P＜0.05）；SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 siRNA 組A549細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA 和蛋白表達(dá)量明顯低于SP+1，25（OH）2D3組（P＜0.05）和SP+NF-κB p65 siRNA組（P＜0.05）。

表1 qRT-PCR 和Western blot 檢 測(cè)1，25（OH）2D3 聯(lián) 合NF-κB p65 siRNA 對(duì)A549 細(xì)胞中NF-κB p65 表達(dá)的影響（，n=6）Tab.1 Effect of 1，25（OH）2D3 combined with NF-κB p65 siRNA on expression of NF-κB p65 in A549 cells detected by qRT-PCR and Western blot（，n=6）

表1 qRT-PCR 和Western blot 檢 測(cè)1，25（OH）2D3 聯(lián) 合NF-κB p65 siRNA 對(duì)A549 細(xì)胞中NF-κB p65 表達(dá)的影響（，n=6）Tab.1 Effect of 1，25（OH）2D3 combined with NF-κB p65 siRNA on expression of NF-κB p65 in A549 cells detected by qRT-PCR and Western blot（，n=6）

圖1 Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞中NF-κB p65的表達(dá)Fig.1 Western blot detection of NF-κB p65 expression in A549 cells

2.2 1，25（OH）2D3聯(lián)合NF-κB p65 siRNA 對(duì)SP 感染的A549 細(xì)胞活力的影響 MTT 數(shù)據(jù)表明（表2），與Control 組 比 較，SP 組、SP+siRNA-NC 組、SP+1，25（OH）2D3組、SP+NF-κB p65 siRNA 組的A549 相對(duì)細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；與SP 組或SP+siRNA-NC 組比較，SP+1，25（OH）2D3組、SP+NF-κB p65 siRNA 組、SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 siRNA組A549相對(duì)細(xì)胞活力均明顯升高（P＜0.05）；與SP+1，25（OH）2D3組比較，SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 siRNA組A549相對(duì)細(xì)胞活力顯著增加（P＜0.05）；與SP+NF-κB p65 siRNA 組比較，SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 siRNA 組A549 相對(duì)細(xì)胞活力明顯升高（P＜0.05）。

表2 1，25（OH）2D3 聯(lián)合NF-κB p65 siRNA 對(duì)SP 感染的A549細(xì)胞活力的影響（，n=6）Tab.2 Effect of 1，25（OH）2D3 combined with NF-κB p65 siRNA on viability of A549 cells infected by SP（，n=6）

表2 1，25（OH）2D3 聯(lián)合NF-κB p65 siRNA 對(duì)SP 感染的A549細(xì)胞活力的影響（，n=6）Tab.2 Effect of 1，25（OH）2D3 combined with NF-κB p65 siRNA on viability of A549 cells infected by SP（，n=6）

2.3 1，25（OH）2D3聯(lián)合NF-κB p65 siRNA 對(duì)SP 感染的A549 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡（圖2、表3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SP組、SP+siRNA-NC組、SP+1，25（OH）2D3組、SP+NF-κB p65 siRNA 組、SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 siRNA 組A549 細(xì)胞凋亡率明顯高于Control 組（P＜0.05）；SP+1，25（OH）2D3組、SP+NF-κB p65 siRNA 組、SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 siRNA 組A549 細(xì)胞凋亡率顯著低于SP 組（P＜0.05）或SP+siRNA-NC 組（P＜0.05）；SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 siRNA 組A549 細(xì)胞凋亡率明顯低于SP+1，25（OH）2D3組（P＜0.05）、SP+NFκB p65 siRNA組（P＜0.05）。

表3 1，25（OH）2D3 聯(lián)合NF-κB p65 siRNA 對(duì)SP 感染的A549細(xì)胞凋亡的影響（，n=6）Tab.3 Effect of 1，25（OH）2D3 combined with NF-κB p65 siRNA on apoptosis of SP-infected A549 cells（，n=6）

表3 1，25（OH）2D3 聯(lián)合NF-κB p65 siRNA 對(duì)SP 感染的A549細(xì)胞凋亡的影響（，n=6）Tab.3 Effect of 1，25（OH）2D3 combined with NF-κB p65 siRNA on apoptosis of SP-infected A549 cells（，n=6）

圖2 1，25（OH）2D3 聯(lián)合NF-κB p65 siRNA 對(duì)SP 感染的A549細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of 1，25（OH）2D3 combined with NF-κB p65 siRNA on apoptosis of SP-infected A549 cells

2.4 1，25（OH）2D3聯(lián)合NF-κB p65 siRNA 對(duì)SP 感染的A549 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞中Bax、Bcl2蛋白表達(dá)（圖3、表4），數(shù)據(jù)表明，同Control組相比，SP組、SP+siRNA-NC組、SP+1，25（OH）2D3組、SP+NF-κB p65 siRNA 組A549細(xì)胞中Bax 蛋白水平明顯升高（P＜0.05），Bcl2 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與SP 組或SP+siRNA-NC 組比較，SP+1，25（OH）2D3組、SP+NF-κB p65 siRNA 組、SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 siRNA 組A549 細(xì)胞中Bax 蛋白表達(dá)量明顯減少（P＜0.05），Bcl2 表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；相比于SP+1，25（OH）2D3組，SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 siRNA 組A549 細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），Bcl2 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；同SP+NF-κB p65 siRNA 組比較，SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 siRNA 組A549 細(xì)胞中Bax 蛋白表達(dá)量明顯減少，Bcl2表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）。

表4 1，25（OH）2D3 聯(lián)合NF-κB p65 siRNA 對(duì)SP 感染的A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（，n=6）Tab.4 Effect of 1，25（OH）2D3 combined with NF-κB p65 siRNA on expression of apoptosis-related proteins in A549 cells infected with SP（，n=6）

表4 1，25（OH）2D3 聯(lián)合NF-κB p65 siRNA 對(duì)SP 感染的A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（，n=6）Tab.4 Effect of 1，25（OH）2D3 combined with NF-κB p65 siRNA on expression of apoptosis-related proteins in A549 cells infected with SP（，n=6）

圖3 Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.3 Western blot detection of expression of apoptosisrelated proteins in A549 cells

2.5 1，25（OH）2D3聯(lián)合NF-κB p65 siRNA對(duì)SP感染的A549 細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 Western blot 檢測(cè)A549 細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)（圖4、表5），結(jié)果顯示，SP組、SP+siRNA-NC組、SP+1，25（OH）2D3組、SP+NF-κB p65 siRNA 組A549 細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)量明顯高于Control 組（P＜0.05）；SP+1，25（OH）2D3組、SP+NF-κB p65 siRNA 組、SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 siRNA組A549細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α 水平顯著低于SP 組或SP+siRNA-NC 組（P＜0.05）；SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 siRNA 組A549 細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)量明顯低于SP+1，25（OH）2D3組（P＜0.05）及SP+NF-κB p65 siRNA組（P＜0.05）。

表5 1，25（OH）2D3聯(lián)合NF-κB p65 siRNA對(duì)SP感染的A549細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響（，n=6）Tab.5 Effect of 1，25（OH）2D3 combined with NF-κB p65 siRNA on expression of inflammatory factors in SP-infected A549 cells（，n=6）

表5 1，25（OH）2D3聯(lián)合NF-κB p65 siRNA對(duì)SP感染的A549細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響（，n=6）Tab.5 Effect of 1，25（OH）2D3 combined with NF-κB p65 siRNA on expression of inflammatory factors in SP-infected A549 cells（，n=6）

圖4 Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)Fig.4 Western blot detection of expression of inflammatory factors in A549 cells

2.6 1，25（OH）2D3聯(lián)合NF-κB p65 siRNA 對(duì)SP 感染的A549 細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot 檢測(cè)A549 細(xì)胞中NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)（表6、圖5），結(jié)果表明，與Control 組比較，SP 組、SP+siRNA-NC 組、SP+1，25（OH）2D3組、SP+NF-κB p65 siRNA 組的A549 細(xì)胞NF-κB p65、NF-κB p-p65、TNF-α 表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與SP 組或SP+siRNA-NC 組比較，SP+1，25（OH）2D3組、SP+NF-κB p65 siRNA 組、SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 siRNA 組A549 細(xì)胞NF-κB p65、NF-κB p-p65、TNF-α 蛋白水平明顯降低（P＜0.05）；與SP+1，25（OH）2D3組比較，SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 si-RNA組A549細(xì)胞NF-κB p65、NF-κB p-p65、TNF-α表達(dá)量顯著減少（P＜0.05）；與SP+NF-κB p65 siRNA組比，SP+1，25（OH）2D3+NF-κB p65 siRNA 組A549細(xì)胞NF-κB p65、NF-κB p-p65、TNF-α 蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。

圖5 Western blot 檢測(cè)A549 細(xì)胞中NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.5 Western blot detection of expression of NF-κB signaling pathway related proteins in A549 cells

表6 1，25（OH）2D3聯(lián)合NF-κB p65 siRNA對(duì)SP感染的A549細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（，n=6）Tab.6 Effect of 1，25（OH）2D3 combined with NF-κB p65 siRNA on expression of NF-κB signaling pathway related proteins in SP-infected A549 cells（，n=6）

表6 1，25（OH）2D3聯(lián)合NF-κB p65 siRNA對(duì)SP感染的A549細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（，n=6）Tab.6 Effect of 1，25（OH）2D3 combined with NF-κB p65 siRNA on expression of NF-κB signaling pathway related proteins in SP-infected A549 cells（，n=6）

3 討論

SP 是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，經(jīng)常無(wú)癥狀地定植于人鼻咽的黏膜表面。嬰兒的定植率高達(dá)50%，健康成人群體的定植率高達(dá)5%～10%［11］。雖然SP 和人類(lèi)之間的相互作用在上呼吸道中是良性的，某些情況下（如流感病毒感染）可以改變宿主與SP 的互相平衡作用，導(dǎo)致SP感染進(jìn)入深部組織和各種疾病的發(fā)展，包括肺炎、中耳炎、敗血癥和腦膜炎［12］。目前，針對(duì)SP 的治療以抗生素為主，但由于菌株耐藥性的日益增長(zhǎng)，并且多重耐藥肺炎球菌克隆已在全球范圍內(nèi)出現(xiàn)并傳播，尋找SP 新的治療策略意義重大［13］。

作為維生素D3的活性形式，1，25（OH）2D3除了在體內(nèi)鈣、磷穩(wěn)態(tài)維持以及骨骼肌肉系統(tǒng)功能中發(fā)揮重要作用外，還對(duì)不同器官和細(xì)胞功能具有多效作用，例如1，25（OH）2D3在細(xì)胞水平調(diào)節(jié)增殖、凋亡、衰老、代謝、遷移等活動(dòng)，且具有調(diào)節(jié)免疫、體外抗腫瘤活性［14］。人們普遍認(rèn)為，這些功能是由1，25（OH）2D3在基因組結(jié)合位點(diǎn)與維生素D 受體（Vitamin D receptor，VDR）結(jié)合有關(guān)［15-16］。研究表明，1，25（OH）2D3的缺乏可能是兒童社區(qū)獲得性肺炎的潛在病因，然而，1，25（OH）2D3攝入量過(guò)大易引發(fā)高血鈣癥，損傷腎臟［17］。有學(xué)者報(bào)道，1，25（OH）2D3與rhIL-1α 聯(lián)合作用較二者單獨(dú)作用對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞中NF-κB受體活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）表達(dá)的影響更明顯［18］。本研究中，1，25（OH）2D3、NF-κB p65 siRNA 以及二者聯(lián)合作用均明顯提高SP 感染的A549 細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，其中，二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的作用效果明顯優(yōu)于1，25（OH）2D3或NF-κB p65 siRNA 單獨(dú)使用。提示1，25（OH）2D3聯(lián)合NF-κB p65 siRNA 對(duì)SP感染肺泡上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)效果更顯著。

細(xì)胞因子主要分為促炎因子和抗炎因子兩類(lèi)，其中IL-1β、IL-6、TNF-α 屬于促炎因子［19］。資料顯示，IL-1β、IL-6、TNF-α 等在SP 感染肺泡上皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用［20］。IL-1β、IL-6、TNF-α水平在普通SP 感染患兒中明顯高于健康小兒，在重癥SP 感染患兒高于普通SP患兒，三者可作為判斷指標(biāo)來(lái)評(píng)估重癥SP 感染程度是否嚴(yán)重［21］。本實(shí)驗(yàn)中，SP 感染組IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明顯高于對(duì)照組，與前述研究一致。1，25（OH）2D3、NF-κB p65 siRNA 以及二者聯(lián)用顯著降低SP感染A549細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)，而1，25（OH）2D3聯(lián)合NF-κB p65 siRNA組的抑制效果最顯著。NF-κB在許多細(xì)胞炎癥和免疫應(yīng)答中具有關(guān)鍵作用。在發(fā)育過(guò)程中，已知上皮NF-κB 信號(hào)調(diào)節(jié)人和小鼠的肺部炎癥和肺泡發(fā)育［22］。LI 等［23］發(fā)現(xiàn)，NF-κB 信號(hào)通路的阻斷是蝙蝠葛堿聯(lián)合克林霉素抑制流感病毒和SP 共感染所致重癥肺炎的炎癥反應(yīng)的重要途徑之一。NF-κB p65是一種廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在SP 感染過(guò)程中，SP引起NF-κB 通路的激活，增強(qiáng)NF-κB p-p65 的水平［24］。本項(xiàng)研究中，1，25（OH）2D3、NF-κB p65 siRNA以及二者聯(lián)用顯著降低SP 感染A549 細(xì)胞中NF-κB p65、NF-κB p-p65、TNF-α蛋白表達(dá)，以1，25（OH）2D3、NF-κB p65 siRNA 聯(lián)用的效果最顯著。上述結(jié)果表明，抑制炎癥因子表達(dá)和NF-κB 信號(hào)通路活性可能是1，25（OH）2D3聯(lián)合NF-κB p65 siRNA 保護(hù)SP 感染肺泡上皮細(xì)胞損傷的重要途徑。

綜上，1，25（OH）2D3、NF-κB p65 siRNA 可保護(hù)SP 感染肺泡上皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)細(xì)胞存活并抑制其凋亡，二者聯(lián)合作用效果明顯優(yōu)于1，25（OH）2D3或NF-κB p65 siRNA 的單獨(dú)使用，作用機(jī)制可能與調(diào)控炎癥因子和NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，這為SP方面的研究提供參考。