楊華杰，李蘭，李彬，張冬，張強(qiáng)

0 引言

骨肉瘤（osteosarcoma,OS），臨床上又稱為成骨肉瘤，是骨骼相關(guān)腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，常見于20歲以下的青少年及兒童，好發(fā)于血運(yùn)豐富的長(zhǎng)管狀骨干骺端，臨床表現(xiàn)為骨端的局部疼痛和腫脹，偶爾合并骨關(guān)節(jié)的功能障礙。在骨相關(guān)的小兒惡性腫瘤中，骨肉瘤最為常見，約占小兒所有惡性腫瘤的百分之五。骨肉瘤的治療現(xiàn)階段主要以外科治療和化療為主，而疾病的預(yù)后與是否合并肺轉(zhuǎn)移具有密切的關(guān)系。近年來(lái)，隨著手術(shù)技術(shù)及化療藥物的不斷發(fā)展，原發(fā)骨肉瘤，即不合并肺轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，經(jīng)規(guī)范及有效地治療后，五年生存率能夠達(dá)到百分之七十左右[1]，但是既往臨床相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，尤其是合并肺轉(zhuǎn)移的患者，五年生存率顯著降低，只有百分之三十左右，而骨肉瘤早期合并肺轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后更差。綜述相關(guān)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)：大約有40%的骨肉瘤患者在初診時(shí)就合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中以肺轉(zhuǎn)移最常見[2]。目前，骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及其肺轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍不明確，臨床上也沒(méi)有相關(guān)的標(biāo)志物及指標(biāo)予以預(yù)測(cè)及判斷預(yù)后情況，骨肉瘤的發(fā)展及其肺轉(zhuǎn)移仍是其臨床治療的難點(diǎn)及熱點(diǎn)[3]。因此，明確骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及其肺轉(zhuǎn)移的機(jī)制，對(duì)于探索其新的治療靶點(diǎn)、改善疾病預(yù)后具有重要意義。

MicroRNA-155（miR-155）是新近發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，可以影響轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的相關(guān)轉(zhuǎn)錄、基因加工等多種生物過(guò)程。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-155參與了很多腫瘤發(fā)生發(fā)展的多種生物學(xué)過(guò)程。miR-155在胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中發(fā)揮著重要的作用[4]，現(xiàn)已知其明確參與調(diào)控腫瘤相關(guān)的細(xì)胞增殖、凋亡、自噬等多種病理生理過(guò)程。通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)查詢發(fā)現(xiàn)，miR-155與骨腫瘤的相關(guān)研究亦有許多報(bào)道，有文章指出miR-155對(duì)骨腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)和耐藥性等生物學(xué)過(guò)程具有重要的影響作用[5]，但是既往研究大多是miR-155與骨髓瘤細(xì)胞的相關(guān)研究，miR-155與骨肉瘤的相關(guān)研究較少，尤其未見miR-155與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及其肺轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制相關(guān)研究。

本研究將初步探究miR-155在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展及其肺轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用，并通過(guò)iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探索其靶蛋白及相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料、細(xì)胞與試劑

收集2015年12月—2020年12月北京積水潭醫(yī)院骨肉瘤患者臨床標(biāo)本，包括合并肺轉(zhuǎn)移患者12例，無(wú)骨腫瘤疾病患者4例。骨肉瘤患者收集標(biāo)本包括：血清、骨肉瘤組織（osteosarcoma-tissue,OS-T）、骨肉瘤瘤旁組織（osteosarcoma-paratumor tissue,OS-PT）、骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移組織（pulmonary metastasis tumor-tissue,PET-T）和骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移瘤旁組織（pulmonary metastasis tumor-paratumor tissue,PET-PT）；健康者收集標(biāo)本為血清。本試驗(yàn)項(xiàng)目通過(guò)北京積水潭醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，倫理審查批號(hào)為202103.49。所有患者均簽署知情同意書并予以備案。

骨肉瘤患者入組標(biāo)準(zhǔn)：均為原發(fā)性骨肉瘤，無(wú)其他合并癥。第一次手術(shù)：骨肉瘤根治手術(shù)，即腫瘤瘤段截除+關(guān)節(jié)重建手術(shù)。術(shù)前行PET/CT檢查明確骨肉瘤病變情況，確定全身無(wú)骨肉瘤相關(guān)轉(zhuǎn)移病灶；術(shù)前不進(jìn)行新輔助化療、放療、靶向等相關(guān)治療；術(shù)后化療12次，化療方案均為：甲氨蝶呤+順鉑+環(huán)磷酰胺，化療藥物劑量按照藥物說(shuō)明進(jìn)行配制，化療結(jié)束后每3月規(guī)律復(fù)查。手術(shù)前留取血清樣本，術(shù)中留取骨肉瘤及瘤旁組織樣本。

具體骨肉瘤根治手術(shù)方式及例數(shù)：8例股骨遠(yuǎn)端骨肉瘤患者均行“股骨遠(yuǎn)端瘤段截除+人工假體關(guān)節(jié)置換手術(shù)”：麻醉滿意后，患者取平臥位，常規(guī)碘酒酒精消毒鋪單，止血帶下手術(shù)。取大腿前內(nèi)側(cè)縱行切口長(zhǎng)20～30 cm，逐層切開皮膚、皮下組織及深筋膜，從股直肌與股內(nèi)側(cè)肌間分離，見軟組織包塊位于股骨下端內(nèi)側(cè)及后側(cè)，切除部分骨內(nèi)側(cè)肌、并充分游離股骨下端腫瘤邊緣，與內(nèi)后側(cè)分離并保護(hù)股血管神經(jīng)束，注意保護(hù)腓總神經(jīng)，切開關(guān)節(jié)囊，切斷雙側(cè)副韌帶、交叉韌帶和后關(guān)節(jié)囊，距關(guān)節(jié)面15～25 cm截?cái)喙晒牵∠鹿晒悄[瘤瘤段，斷端髓腔未見異常。股骨端擴(kuò)髓，脛骨端擴(kuò)髓，沖洗髓腔，置入股骨下段組配型人工膝關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)鏈型假體（力達(dá)康公司，重建長(zhǎng)度15～25 cm，髓針長(zhǎng)8～16 cm，直徑8～16 mm），并以骨水泥固定，待凝固后組裝假體。充分止血、沖洗傷口，留置傷口引流管2根，逐層縫合傷口，清點(diǎn)紗布、器械無(wú)誤，術(shù)畢。

3例肱骨近端骨肉瘤患者均行“肱骨近端瘤段截除+肱骨近端人工假體重建術(shù)”：麻醉滿意后,患者平臥位，常規(guī)碘酒酒精消毒鋪單。取上臂上段前側(cè)縱行切口，逐層切開皮膚、皮下組織、深筋膜，切斷胸大肌止點(diǎn)、三角肌于肱骨中上段止點(diǎn)，于內(nèi)側(cè)保護(hù)肱血管、保護(hù)后側(cè)橈神經(jīng)，充分游離腫瘤瘤段周邊，于距肱骨頭15～18 cm處截?cái)嚯殴牵磺袛嗳羌∮阪i骨及肩峰處起點(diǎn)，切斷喙突處肌腱，切斷肩盂周圍肩袖諸肌充分顯露肩盂，于肩胛頸前方、后方用超聲骨刀、骨刀截?cái)嗉珉喂牵嘘P(guān)節(jié)外切除，見肱骨近端連同肩盂完整切除，取下腫瘤瘤段。肱骨遠(yuǎn)端髓腔擴(kuò)髓，沖洗髓腔，用肱骨近端人工假體重建（京航公司，重建長(zhǎng)度15～20 cm，髓針長(zhǎng)度6～8 cm、直徑6～8 mm）置換，假體髓針用骨水泥固定。充分止血、沖洗傷口，近端用Mesh補(bǔ)片修復(fù)關(guān)節(jié)囊，用縫合錨釘入肩峰骨質(zhì)內(nèi)，尾端縫線縫合于Mesh補(bǔ)片上，將肱骨頭固定于肩峰下，將胸大肌、三角肌止點(diǎn)縫合于Mesh上，沖洗傷口，放置傷口引流管2根，逐層縫合傷口，清點(diǎn)紗布器械無(wú)誤，術(shù)畢。

1例肱骨近端骨肉瘤患者行“肱骨近端瘤段截除+人工全肱骨置換術(shù)”：麻醉滿意后，患者取平臥位，常規(guī)碘酒酒精消毒鋪單。取左上臂前側(cè)縱行切口，逐層切開皮膚、皮下組織、深筋膜，切斷部分三角肌，切斷胸大肌止點(diǎn)、肱二頭肌及肩袖諸肌，于內(nèi)側(cè)保護(hù)肱血管、保護(hù)后側(cè)橈神經(jīng)，充分游離腫瘤瘤段周邊，于肱骨遠(yuǎn)端保護(hù)橈神經(jīng)、正中神經(jīng)及尺神經(jīng)，將整個(gè)肱骨完整切除；以人工全肱骨假體（春立公司，重建肱骨長(zhǎng) 28 cm，肱骨頭直徑36 mm，尺骨側(cè)長(zhǎng)度7 cm、直徑6 mm）置換，骨水泥固定尺骨側(cè)髓針，術(shù)中尺骨側(cè)有輕微劈裂，予以鈦纜固定。充分止血、沖洗傷口，以止血紗布及凝血酶填充止血，近端用Mesh補(bǔ)片修復(fù)關(guān)節(jié)囊，放置傷口引流管2根，逐層縫合傷口，清點(diǎn)紗布器械無(wú)誤，術(shù)畢。

第二次手術(shù)：經(jīng)胸腔鏡肺楔形切除術(shù)。入組患者為：第一次手術(shù)化療結(jié)束后＞12月，新發(fā)肺轉(zhuǎn)移病灶。術(shù)前行PET/CT檢查明確骨肉瘤原發(fā)病變無(wú)復(fù)發(fā)，且除肺部轉(zhuǎn)移其余全身均無(wú)轉(zhuǎn)移病灶。術(shù)前不進(jìn)行新輔助化療、放療、靶向等相關(guān)治療。手術(shù)前留取血清樣本，術(shù)中留取骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移及瘤旁組織樣本。

人正常成骨細(xì)胞系CP-H111和人骨肉瘤細(xì)胞系HOS-143B均購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，CEBPB抗體和GAODH抗體及標(biāo)記二抗均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，蛋白顯影液、脫脂奶粉等均購(gòu)于上海生工生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄熒光定量等相關(guān)試劑盒以及QPCR相關(guān)試劑購(gòu)自北京慶凱華豐科技開發(fā)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

高速低溫離心機(jī)（美國(guó)，ABI公司），紫外分光光度儀（日本，Sanyo公司），真空干燥機(jī)（德國(guó)，Eppendorf公司）；分析天平（瑞士，Sartorius 公司），電熱恒溫水浴鍋（北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司，中國(guó)），高速離心機(jī)（德國(guó)，Eppendorf公司），Vortex QL-901 微型渦旋混合儀（瑞士，Tecan公司），超聲波清洗器（日本，JEOL公司），純水系統(tǒng)（美國(guó)，Millipore公司），圖像掃描儀（日本，Leica公司），高效液相系統(tǒng)（美國(guó),Agillent公司），質(zhì)譜儀（美國(guó)，Thermo Finnigan公司）。

1.3 骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進(jìn)程中miR-155的差異性檢測(cè)

1.3.1 相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)分析 利用Exiqon miRNome平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)分析系統(tǒng)以及GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫(kù)中的芯片測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析miR-155在骨肉瘤組織與正常組織、骨肉瘤細(xì)胞HOS-143B與正常成骨細(xì)胞CP-H111中miR-155的差異性。

1.3.2 qPCR技術(shù)檢測(cè)miR-155 利用qPCR技術(shù)檢測(cè)骨肉瘤組織與瘤旁組織、人正常成骨細(xì)胞系CP-H111和人骨肉瘤細(xì)胞系HOS-143B中miR-155的差異性。miR-155相關(guān)檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物472 bp，miR-155引物序列如下：Forward primer:5’-AGCTGAAGTCTACCTTGCCT-3’；Reverse primer:5’-TGTGGGCTTGAAGTTGAGATGT-3’，以U6為內(nèi)參。

1.4 應(yīng)用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)篩選骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進(jìn)程中miR-155的靶蛋白

1.4.1 制備樣品 蛋白樣本選擇組織中的全蛋白質(zhì)進(jìn)行組學(xué)分析。因?yàn)楣侨饬銎鹪从陂g葉組織細(xì)胞，所以骨肉瘤的瘤體組織中摻雜較多的血管、骨組織等不均一組織?；诖嗽?，骨肉瘤實(shí)驗(yàn)組織的取材常采取腫瘤瘤體組織與瘤旁組織進(jìn)行差異性對(duì)比，其實(shí)質(zhì)是多種細(xì)胞及組織的蛋白混合物的相關(guān)對(duì)比。所以本實(shí)驗(yàn)的組織取材為各組骨肉瘤及其瘤旁組織、肺轉(zhuǎn)移瘤及其瘤旁組織、以及骨肉瘤患者的血清及健康者的血清。實(shí)驗(yàn)組為：骨肉瘤組織、骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移組織、骨肉瘤患者的血清；對(duì)照組為：骨肉瘤瘤旁組織、骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移瘤旁組織、健康者的血清。

1.4.2 樣本蛋白的濃度測(cè)定及蛋白分離 本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的是不同組織及血清中蛋白含量的差異性，因此樣品蛋白濃度的測(cè)定對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要，本實(shí)驗(yàn)采用的是BCA試劑盒來(lái)測(cè)定蛋白濃度。

蛋白濃度檢測(cè)完成后進(jìn)行蛋白分離實(shí)驗(yàn)：配制7 mm厚度為4%～12%的膠SDS-PAGE。等比例將兩種蛋白混合，然后加入等體積的Loading buffer，進(jìn)行混勻，隨后煮沸5 min，進(jìn)而離心（10 000 g,10 min），取上清液，滴加至濃縮膠，蛋白上樣量約為每泳道60 μg。電泳步驟：恒流10 mA,運(yùn)行30 min后，20 mA持續(xù)至分離膠末端，然后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。

1.4.3 蛋白質(zhì)酶切標(biāo)準(zhǔn) 將SDS-PAGE獲得的分離膠按分子量由大到小的順序，分解成15個(gè)部分，再把每部分剪切成1 mm左右的微粒，將微粒浸泡于50%ACN/25 mmol/L碳酸氫銨溶液中，顏色脫洗完全后氮?dú)夂娓?，以便微粒脫水完全，體積減??；滴加DTT溶液，37℃水浴鍋4 h，滴加 55 mmol/L IAA溶液，避光室溫存放1 h，滴加少量酶液，4℃冰箱存放1 h后除去上層酶液，37℃保溫箱內(nèi)存放16 h后，滴加2%TFA，再于60%ACN超聲15 min，取上層清液。再次重復(fù)上述步驟后，兩次上層清液合并。

1.4.4 蛋白酶切混合物的液相分離 色譜分離需在Agillent系統(tǒng)上進(jìn)行：利用自動(dòng)上樣器進(jìn)行蛋白上樣，蛋白體積約為20 μl，蛋白流速是10 μl/min；色譜洗脫在二元泵系統(tǒng)上進(jìn)行：洗脫后成分通過(guò)ESI離子源進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)，液相色譜設(shè)置為：流動(dòng)相A：0.1%的FA-98%水溶液；流動(dòng)相B：0.1%的FA-80%ACN溶液；洗脫設(shè)置：0～90 min，流動(dòng)相比例由2%B線性上升到40%B；90～105 min，流動(dòng)相比例由40%B線性上升到100%B；維持15 min后，以100%流動(dòng)相A平衡色譜柱30 min，流速為300 μl/min。

1.4.5 質(zhì)譜分析檢測(cè) 質(zhì)譜分析檢測(cè)：質(zhì)譜儀為線性離子阱-傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（LTQ-FT,Thermo），設(shè)置的磁場(chǎng)強(qiáng)度：7 T。噴霧電壓設(shè)置：1.8 kV；毛細(xì)管溫度設(shè)置：180℃；掃描模式：Ⅰ級(jí)質(zhì)譜依靠的是Ⅱ級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)；質(zhì)譜Ⅰ級(jí)全掃描質(zhì)荷比范圍為400～2 000 m/z（Mass range,m/z）。依次截?、窦?jí)質(zhì)譜篩選的強(qiáng)度排名前十的離子進(jìn)行Ⅱ級(jí)質(zhì)譜串聯(lián)，實(shí)驗(yàn)通過(guò)質(zhì)譜串聯(lián)掃描的動(dòng)態(tài)排除方法，排除時(shí)間為30秒；離子自動(dòng)增益控制設(shè)置為：一級(jí)質(zhì)譜掃描為1×106個(gè)電荷，二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜為1×103個(gè)電荷。Ⅰ級(jí)質(zhì)譜在400 m/z處的分辨率設(shè)置為100 000；Ⅱ級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜歸一化碰撞能量設(shè)置為35%。

1.4.6 蛋白檢測(cè)、矯正及定量檢測(cè) 蛋白檢測(cè)、矯正及定量利用MASCOT相關(guān)軟件，通過(guò)對(duì)質(zhì)譜相關(guān)文件的結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。蛋白質(zhì)檢測(cè)設(shè)置為：酶切點(diǎn)為胰酶切點(diǎn)；最長(zhǎng)漏切位點(diǎn)為2；Ⅰ級(jí)相關(guān)離子誤差為12 ppm；Ⅱ級(jí)離子誤差為0.4 Da；存在可變修飾檢測(cè)：存在固定修飾檢測(cè)；檢測(cè)結(jié)束后再對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行定量：最小定量的肽段數(shù)為3氨基酸時(shí)，蛋白及肽段檢測(cè)的假陽(yáng)性率需降低到1%及以下；最小定量的肽段數(shù)為6氨基酸時(shí)，蛋白定量需保證至少有一條非冗余肽及銻刀肽。

1.5 篩選miR-155在骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進(jìn)程中靶蛋白

實(shí)驗(yàn)參考miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)[6]（miRanda、TargetScan和PicTar）進(jìn)行靶蛋白預(yù)測(cè)。將骨肉瘤及肺轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)量降低50%以上的蛋白分別與 miR-155數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行對(duì)比分析，查看其是否具有miR-155的結(jié)合位點(diǎn)。

1.6 骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進(jìn)程中miR-155篩選蛋白的驗(yàn)證

利用Western blot檢測(cè)骨肉瘤組織與瘤旁組織、肺轉(zhuǎn)移瘤與瘤旁組織、人正常成骨細(xì)胞系CP-H111和人骨肉瘤細(xì)胞系HOS-143B中篩選蛋白的差異性。各組細(xì)胞或組織中分別加入RIPA裂解液，冰上裂解20 min，4℃，18 000g，離心20 min（r=10 cm），取上清液并采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量。取35 μg蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，用封閉液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，BSA）封閉，分別加入一抗4℃過(guò)夜（以GAPDH抗體為參照），洗滌后，再加入二抗室溫孵育1 h。ECL曝光成像，最后采用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6軟件處理。采用（±s）表示正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料，行t檢驗(yàn)；采用百分?jǐn)?shù)表示計(jì)數(shù)資料，行χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤及肺轉(zhuǎn)移進(jìn)程中miR-155的差異性檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 臨床樣本miR-155的差異性檢測(cè)結(jié)果 分析骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者的血清樣本數(shù)據(jù)（GSE65071），利用Exiqon miRNome平臺(tái)（human panelsⅠ+Ⅱ,V3）對(duì)比來(lái)自10例骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者和15例正常對(duì)照的血清中miR-155的表達(dá)水平。結(jié)果提示，正常對(duì)照組血清中miR-155的含量?jī)H為肺轉(zhuǎn)移患者血清中的0.292倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0032），見圖1A。

共收集骨肉瘤患者12例：肱骨近端骨肉瘤4例，股骨遠(yuǎn)端骨肉瘤8例，男:女=7:5，年齡分布15～43歲，平均年齡28.33±2.87歲。收集入組骨肉瘤患者兩次手術(shù)術(shù)前的血清，以評(píng)估患者在出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移前后血清中miR-155含量的差異性，結(jié)果顯示：miR-155在出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移前為1.87±0.09；肺轉(zhuǎn)移后為2.05±0.11，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.78）。為進(jìn)一步證實(shí)miR-155在骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進(jìn)程中的差異性，qRT-PCR檢測(cè)骨肉瘤組織與其瘤旁組織、骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移瘤組織與其瘤旁組織中的miR-155含量。病理切片HE染色，確診為骨肉瘤或骨肉瘤轉(zhuǎn)移組織。

結(jié)果顯示，miR-155表達(dá)量在骨肉瘤組織：1.45±0.06；骨肉瘤瘤旁組織：0.78±0.05；肺轉(zhuǎn)移瘤組織：1.71±0.07；肺轉(zhuǎn)移瘤旁組織：0.60±0.05。miR-155含量在骨肉瘤組織和肺轉(zhuǎn)移瘤組織中，較對(duì)照組瘤旁組織均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0001,P=0.0001）；肺轉(zhuǎn)移瘤組織中較骨肉瘤組織中miR-155含量亦出現(xiàn)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），見圖1B～C。

圖1 骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進(jìn)程臨床樣本miR-155的差異性檢測(cè)分析結(jié)果Figure 1 Expression of miR-155 in clinical samples of osteosarcoma and its pulmonary metastasis process

2.1.2 骨肉瘤細(xì)胞與正常成骨細(xì)胞中miR-155的差異性檢測(cè)結(jié)果 分析GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫(kù)中的芯片測(cè)序數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞系中miR-155的表達(dá)量顯著上調(diào)。對(duì)比三個(gè)常見的骨肉瘤細(xì)胞系與正常骨組織的microRNAs表達(dá)（Agilent-019118 Human miRNA Microarray 2.0 G4470B,GSE28425），分析發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤細(xì)胞系HOS-143B、HOS-MNNG和MG-63中miR-155的表達(dá)水平是正常骨組織中的15.57倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0043,FDR=0.036），見圖2A。

為進(jìn)一步證實(shí)miR-155在骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進(jìn)程中的差異性，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-155表達(dá)量在人骨肉瘤細(xì)胞系HOS-143B中為1.61±0.07，在人正常成骨細(xì)胞系CP-H111中為0.46±0.06，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0003），見圖2B。

圖2 人骨肉瘤細(xì)胞系與人正常成骨細(xì)胞系miR-155的差異性Figure 2 Comparison of miR-155 expression between human osteosarcoma cell lines and human normal osteoblast cell lines

2.2 骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進(jìn)程中miR-155靶蛋白的篩選結(jié)果

2.2.1 質(zhì)譜鑒定檢測(cè)結(jié)果 利用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)骨肉瘤組織和正常骨組織進(jìn)行蛋白鑒定，結(jié)果顯示：共檢測(cè)收集到194 867張質(zhì)譜圖，從中鑒定到46 895條肽段，其中10 985條為非冗余肽，肽段的平均質(zhì)量誤差為0.89 ppm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終鑒定到 3 714個(gè)蛋白組。

2.2.2 差異表達(dá)蛋白鑒定結(jié)果 在骨肉瘤組織中，根據(jù)FDR＜0.05，倍數(shù)變化大于2倍為標(biāo)準(zhǔn)，骨肉瘤組織中共篩選出差異表達(dá)蛋白253個(gè)，其中上調(diào)144個(gè)，下調(diào)109個(gè)，見圖3A～B。

圖3 miR-155在骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進(jìn)程組織中靶蛋白的篩選Figure 3 Screening of target proteins of miR-155 in osteosarcoma and its pulmonary metastasis process

2.2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能注釋 基因GO注釋分析顯示，差異表達(dá)蛋白主要富集于細(xì)胞骨架、細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞遷移等注釋，見圖3C～E。差異表達(dá)蛋白中還存在一些參與腫瘤行為調(diào)控的蛋白，如：煙酰胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide N-methyltransferase,NNMT）參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程，在癌細(xì)胞的胞質(zhì)中出現(xiàn)高表達(dá)；同源框蛋白CDX-10（Homeobox protein CDX-10）能夠調(diào)控腫瘤相關(guān)的特異性基因表達(dá)和上皮細(xì)胞分化；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2,bcl-2），與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)；基因沉默調(diào)節(jié)蛋白（Sirtuin 1,SIRT1）活化后可以從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子活性，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化的相關(guān)生物學(xué)過(guò)程；eIF4E（eukaryotic translation initiation factor 4E）可在蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中，通過(guò)與轉(zhuǎn)運(yùn)RNA結(jié)合影響和調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯進(jìn)程；細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1和2（checkpoint kinase 1 and 2,Chk 1 and 2）為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族相關(guān)成員，廣泛參與細(xì)胞代謝相關(guān)生物學(xué)過(guò)程，尤其是在多種信號(hào)通路中影響及調(diào)節(jié)下游蛋白的表達(dá)，進(jìn)而使細(xì)胞代謝出現(xiàn)相關(guān)障礙；EHD2（C-terminal EH domaincontaining protein 2）是一種細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，在細(xì)胞膜水平參與蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)后，仍影響核內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)程；組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（SET and MYND domain containing 3,SMYD3）能夠使組蛋白甲基化，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)代謝周期，在蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有重要作用。

2.2.4 miR-155在骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進(jìn)程中靶蛋白的篩選 miRanda的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，有3個(gè)靶基因具有miR-155的靶位點(diǎn)：CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β（C/EBPβ，基因CEBPB），發(fā)現(xiàn)C/EBPβ是細(xì)胞內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，廣泛參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖等相關(guān)通路；B淋巴細(xì)胞瘤-10（B-cell lymphoma-10,bcl-10）參與腫瘤細(xì)胞的凋亡調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程；異戊二烯基二磷酸合酶亞基2（prenyl/decaprenyl diphosphate synthase 2,PDSS 2）在多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)差異性表達(dá)。TargetScan的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，有2個(gè)基因具有miR-155的靶位點(diǎn)：C/EBPβ（與 miRanda 相同）；細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白1（suppressor of cytokine signaling 1,SOCS 1）能夠阻斷部分腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，進(jìn)而降低腫瘤相關(guān)代謝進(jìn)程。PicTar的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，有2個(gè)基因具有miR-155的靶位點(diǎn)：C/EBPβ（與miRanda和TargetScan均相同）；PDSS2（與miRanda相同）。其余蛋白未找到相匹配的結(jié)果，這可能是因?yàn)閙iR-155通過(guò)間接調(diào)節(jié)的方式抑制了某些基因及蛋白的表達(dá)，或者通過(guò)其他非結(jié)合的方式進(jìn)而影響相關(guān)蛋白的表達(dá)。

2.3 miR-155篩選蛋白C/EBPβ的Western blot驗(yàn)證結(jié)果

與瘤旁組織相比，骨肉瘤及肺轉(zhuǎn)移瘤組織中C/EBPβ的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0003,P=0.0002），見圖4A；與人正常成骨細(xì)胞系CP-H111相比，人骨肉瘤細(xì)胞系HOS-143B中C/EBPβ表達(dá)亦顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004），見圖4B。

圖4 miR-155篩選蛋白C/EBPβ的Western blot驗(yàn)證結(jié)果Figure 4 Western blot validation results of miR-155 screening protein C/EBP β

3 討論

骨肉瘤因其發(fā)病年齡偏小且預(yù)后不佳，一直是骨相關(guān)腫瘤研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)。近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，miRNAs對(duì)腫瘤的相關(guān)影響研究逐漸進(jìn)入人們的視野[7]。miRNAs是廣泛存在于真核生物中的非編碼小RNAs，長(zhǎng)度為19～24個(gè)核苷酸序列，能在轉(zhuǎn)錄后水平影響靶基因的表達(dá)及翻譯，通過(guò)與mRNA的不完全堿基配對(duì)，從而影響其生物學(xué)過(guò)程[8]。近年來(lái)，miRNAs越來(lái)越受到重視，研究發(fā)現(xiàn)其在機(jī)體生理及病理學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、腫瘤復(fù)發(fā)等多種生物學(xué)過(guò)程[9]。

miR-155是一類多功能的miRNA，參與了包括炎性反應(yīng)、細(xì)胞調(diào)控、腫瘤復(fù)發(fā)、自噬、細(xì)胞凋亡等[10]多種生物學(xué)過(guò)程。綜述相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)：miR-155在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[11]。Shi等[12]發(fā)現(xiàn)膜蛋白可以通過(guò)調(diào)控miR-155抑制胃癌細(xì)胞中Smad2的表達(dá)；Ulivi等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-155能夠作為判斷貝伐單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌療效的相關(guān)預(yù)測(cè)因子之一；Santos等[14]指出外泌體介導(dǎo)的miR-155移位能夠影響乳腺癌化療的藥物耐受性；Wei等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-155可以阻斷TGF-β1信號(hào)通路，進(jìn)而緩解肺癌細(xì)胞的纖維化進(jìn)程；Xue等[16]研究發(fā)現(xiàn)miR-155能夠降低SOCS1、SOCS6和PTEN的表達(dá)，進(jìn)而加速非小細(xì)胞肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

研究表明miR-155能夠影響與腫瘤相關(guān)的多種生理病理過(guò)程。Yu等[17]利用miR-155基因敲除小鼠建立骨髓瘤相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制骨髓中miR-155基因能夠顯著增加腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移；Wang等[18]利用miR-155基因敲除小鼠建立骨髓瘤相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，通過(guò)沉默miR-155基因顯著促進(jìn)了骨髓腫瘤的發(fā)生發(fā)展及生長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)闡釋miR-155在骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進(jìn)程中的作用，并利用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選miR-155在骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進(jìn)程中潛在的靶蛋白，最終鑒定到蛋白3 714個(gè)，骨肉瘤組織中差異表達(dá)蛋白253個(gè)。通過(guò)與miRNA靶基因的數(shù)據(jù)庫(kù)的匹配分析，經(jīng)臨床樣本實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)的蛋白定量驗(yàn)證，提示C/EBPβ是miR-155潛在的作用靶蛋白。

C/EBPβ是堿性亮氨酸拉鏈蛋白（bZIP）的家族成員之一。CEBPB的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA能夠經(jīng)過(guò)差異性剪切形成4種蛋白異構(gòu)體（LAP、LIP、LAP2及14 kDa的蛋白）。C/EBPβ也被發(fā)現(xiàn)在許多組織及器官內(nèi)廣泛表達(dá)，參與調(diào)控許多病理生理進(jìn)程，其中包括細(xì)胞分化及增殖、組織及細(xì)胞再生、腫瘤、炎性反應(yīng)等。另外，C/EBPβ已被證實(shí)與乳腺癌、胰腺癌、軟骨肉瘤等多種腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移相關(guān)[19]，尤其是能夠參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition,EMT）過(guò)程。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)C/EBPβ參與調(diào)控尼古丁誘發(fā)的乳腺上皮細(xì)胞的EMT激活過(guò)程，從而影響乳腺癌的發(fā)展；Cheng等[21]研究指出C/EBPβ能夠激活CDKN2A轉(zhuǎn)錄并抑制胰腺腫瘤細(xì)胞EMT，進(jìn)而抑制胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生及發(fā)展；Lu等[22]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染C/EBPβ可以下調(diào)CLEC5A，進(jìn)而緩解骨肉瘤細(xì)胞的增殖，但對(duì)其作用機(jī)制并未作深入的相關(guān)研究。

骨肉瘤為惡性骨腫瘤之一，腫瘤切除術(shù)后需進(jìn)行化療等進(jìn)一步治療。臨床上需首先保證患者得到有效且及時(shí)的治療，故在本實(shí)驗(yàn)中無(wú)法收集無(wú)化療的肺轉(zhuǎn)移瘤及瘤旁組織樣本，因此不能完全避免化療對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。但是本項(xiàng)目制定了嚴(yán)格的入組標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)方案，以減少實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏移。首先，所有入組的骨肉瘤患者，第一次手術(shù)前均無(wú)新輔助化療等相關(guān)治療，術(shù)后化療的方案、劑量、次數(shù)均無(wú)差異，以保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程的均一性；其次，入組為化療后＞12月新發(fā)肺轉(zhuǎn)移的患者，保證新發(fā)肺轉(zhuǎn)移瘤與化療治療具有較長(zhǎng)的時(shí)間間隔，以減輕化療治療因素的干擾和偏移；最后，肺轉(zhuǎn)移瘤手術(shù)前不進(jìn)行化療等相關(guān)治療，且PET/CT明確骨肉瘤無(wú)復(fù)發(fā)且除肺轉(zhuǎn)移外無(wú)其他轉(zhuǎn)移，以排除化療及其他因素對(duì)肺轉(zhuǎn)移瘤體的影響。項(xiàng)目初期進(jìn)入臨床觀察的患者96例，因入組標(biāo)準(zhǔn)較嚴(yán)格，最后入組的僅有12例患者。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然不能完全避免化療治療對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，但是通過(guò)嚴(yán)格的入組管理和長(zhǎng)時(shí)間的臨床隨訪最大限度地降低其對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏移，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較高的可信性及準(zhǔn)確性。

本研究揭示了miR-155在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展及其肺轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用，并成功篩選其靶向蛋白C/EBPβ?；诖搜芯?，進(jìn)而探究在骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移過(guò)程中miR-155及其相關(guān)靶蛋白具體的通路及相關(guān)機(jī)制，不但可以明確miR-155在骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)分子基礎(chǔ)，而且對(duì)開發(fā)其新的治療策略具有重要意義。