麥艷媚 (鶴山市人民醫(yī)院，廣東 江門 529000)

人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是專門感染人表皮與黏膜鱗狀上皮的一種病毒，性行為是其主要傳播途徑，其次為唾液與皮膚接觸[1]。高危型HPV感染已被證實(shí)為宮頸上皮內(nèi)增生及宮頸癌發(fā)生與發(fā)展的主要致病因素，超過90%的宮頸癌與HPV感染有關(guān)，宮頸脫落細(xì)胞HPV DNA的檢測(cè)已成為宮頸癌的篩查方案與指引[2-3]。最新研究顯示宮頸癌有較長(zhǎng)時(shí)間的可逆轉(zhuǎn)癌前病變期，及早發(fā)現(xiàn)及時(shí)有效治療后，患者五年治愈率達(dá)到90%。大量資料證明低危型HPV可導(dǎo)致生殖器尖銳濕疣，高危型HPV的持續(xù)感染是宮頸癌以及宮頸上皮內(nèi)瘤變的主要致病原因[4-5]。因此，通過女性生殖道HPV檢測(cè)篩查以及分型檢測(cè)，能夠有效預(yù)防、降低宮頸癌發(fā)病率，給臨床疾病分流提供依據(jù)[6]。目前檢測(cè)HPV的方法眾多[7]，不同的HPV檢測(cè)方法，會(huì)因其對(duì)HPV亞型基因數(shù)量檢測(cè)結(jié)果的不同導(dǎo)致陽性檢出率出現(xiàn)一定差異。本研究對(duì)臨床上常用的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)與基因芯片法在HPV檢測(cè)中的效果進(jìn)行比較分析。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇我院2018年6月～2020年6月期間的患者作為研究對(duì)象，所有患者均做液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。年齡23～71歲，平均(37.25±7.92)歲。試劑與儀器：實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒由安徽同科生物科技有限公司提供，基因芯片試劑盒由深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供；擴(kuò)增儀是安徽同科生物科技有限公司提供的TK-6000，雜交儀是深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集方法:所有患者用窺陰器暴露宮頸，無菌生理鹽水浸濕的棉拭子擦拭去除宮頸口過多的分泌物，宮頸刷刷取宮頸口的脫落細(xì)胞，細(xì)胞保存液保存待測(cè)。用含Thinprep細(xì)胞保存液再保存一份細(xì)胞用于液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。

1.2.2基因芯片法:充分洗脫宮頸刷，并在管壁上擠干。把洗脫液全部轉(zhuǎn)移至1.5 ml的離心管中，13 000 rpm離心10 min，棄去上清，保留管底的細(xì)胞沉淀。加入100 μl病毒裂解液，混勻后100℃加熱10 min，13 000 rpm離心10 min，保留上清液待用。于反應(yīng)Ⅰ和反應(yīng)Ⅱ加入制備好的上清液各5 μl,陰陽質(zhì)控品同等處理，低速離心數(shù)秒待擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增儀反應(yīng)條件設(shè)置：50℃15 min;95℃10 min;(94℃30 s,42℃90 s,72℃ 30 s)共40個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min，4℃下保存。取擴(kuò)增的全部PCR產(chǎn)物導(dǎo)入，將標(biāo)記有HPV6、11、42、43、81、83(低危型)及16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82(高危型)等23種寡核酸探針的基因芯片，嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行導(dǎo)流雜交后，酶標(biāo)儀顯色處理。觀察芯片上HPV分型分布所對(duì)應(yīng)的陽性點(diǎn)，并對(duì)HPV亞型進(jìn)行判斷，明確相應(yīng)組織中的HPV亞型分布情況。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光PCR法:按照試劑盒說明書對(duì)HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68等15種高危型HPV進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1兩種方法HPV陽性率檢測(cè)結(jié)果比較:本研究中，采用基因芯片法檢出HPV陽性率為23.29%(17/73)，其中15種高危型HPV感染的陽性率為13.70%(10/73)；差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)采用兩種方法檢測(cè)的共有73例，兩種方法對(duì)15種高危型HPV檢出均為陽性的有24例，不符合的為2例。其中基因芯片法陽性率為35.62%(26/73)，熒光PCR法為32.88%(24/73)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2兩種方法在不同TCT分型中的HPV感染陽性率檢出結(jié)果比較:TCT分級(jí)各組中的基因芯片法與熒光PCR法的高危型HPV感染陽性檢出率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩種方法在不同TCT分型中的HPV感染陽性率檢出結(jié)果比較[例(%)]

2.3兩種方法對(duì)HPV感染的診斷價(jià)值：基因芯片法對(duì)HPV感染陽性的診斷敏感度、特異度、準(zhǔn)確度分別為98.75%、98.675、98.69%；熒光PCR法的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度分別為97.50%、99.47%、96.77%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

目前，HPV基因亞型已鑒定出的有100多種，有40多種HPV亞型可侵犯女性生殖道，被稱為生殖道HPV，按照其致癌性強(qiáng)弱又分為高危型、低危型等。多數(shù)女性HPV感染期不長(zhǎng)，處理無臨床感染狀態(tài)、亞臨床感染狀態(tài)，當(dāng)受損的宮頸上皮持續(xù)存在HPV感染情況時(shí)，會(huì)使宮頸上皮出現(xiàn)不典型增生，并引發(fā)癌變[5]。部分低危型如HPV6、HPV11的感染可引起尖銳濕疣，HPV16、HPV18型的持續(xù)感染被認(rèn)為是宮頸癌的高危因素，可以預(yù)測(cè)子宮病變的進(jìn)展和預(yù)后，因此，HPV亞型的檢測(cè)對(duì)于臨床診斷分流均有一定的參考依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)中實(shí)時(shí)熒光PCR法是將熒光基團(tuán)加入PCR反應(yīng)體系中，基于多重?zé)晒釶CR技術(shù)，通過熒光信號(hào)的累積進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，在四種PCR反應(yīng)混合液中分別采用四種熒光通道共檢測(cè)15種HPV及人β-珠蛋白(HBB)基因，其中HPV16/58/35/HBB-PCR反應(yīng)液中FAM熒光通道檢測(cè)HPV16,接(或HEX)熒光通道檢測(cè)HPV58,ROX熒光通道檢測(cè)HPV35,CY5熒光通道檢測(cè)HBB;同樣原理能具體檢測(cè)HPV的各個(gè)亞型。實(shí)時(shí)熒光PCR能做到對(duì)15個(gè)HPV亞型的同時(shí)檢測(cè)并能分出具體型別，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，適合做大規(guī)模的篩查。基因芯片法是采用PCR體外擴(kuò)增和DNA反向點(diǎn)雜交相結(jié)合的HPV基因分析檢測(cè)技術(shù)，將擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在膜條上的23種HPV分型探針雜交，依據(jù)雜交信號(hào)的有無判讀結(jié)果?；蛐酒刹捎酶咄考夹g(shù)對(duì)基因進(jìn)行大規(guī)模檢測(cè)，目前被廣泛應(yīng)用于腫瘤檢測(cè)與研究中[8]。Meta分析顯示，基因芯片法對(duì)HPV感染的檢測(cè)門診患者HPV感染的敏感度為0.97(95%CI:0.96～0.98)，特異度為0.96(95%CI:0.96～0.97)，診斷優(yōu)勢(shì)比為878.72(95%CI:317.14～2434.73)；檢測(cè)宮頸癌患者HPV感染的敏感度為0.99(95%CI:0.97～1.00)，特異度為0.80(95%CI:0.75～0.84)，診斷優(yōu)勢(shì)比為166.19(95%CI:9.64～2863.74)，具有很高的準(zhǔn)確性，但也有一定的假陽性與假陰性情況[9]。目前研究顯示，熒光PCR法不區(qū)分亞型與基因芯片法在高危型HPV感染陽性診斷中具有很高的一致性[10]，本研究也顯示，熒光PCR法可區(qū)分亞型與基因芯片法也具有很高的一致性。本實(shí)驗(yàn)中熒光PCR法采用熒光探針法通過不同熒光通道來區(qū)分亞型，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，被用于我院的大規(guī)模人群篩查?；蛐酒ㄍ瑫r(shí)能檢測(cè)23種亞型，比熒光PCR法多8種亞型，故后者檢測(cè)陽性率對(duì)高于前者。不同亞型臨床的處理不一樣，后者更符合臨床的需求，被用于臨床對(duì)疑似HPV感染患者的檢測(cè)。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光PCR與基因芯片法對(duì)HPV陽性檢出情況高度一致，尤其在高危型HPV檢測(cè)中，均有良好的診斷效能，根據(jù)實(shí)際情況，合理選擇檢測(cè)方法，均能夠?qū)m頸病變作出及時(shí)有效的診斷。