劉 洋，劉雅芳，林 智，陳勤操,

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008）

白茶是我國傳統(tǒng)六大茶類之一，主要產(chǎn)區(qū)有福鼎、政和、松溪和建陽等縣，其中產(chǎn)于福鼎的白茶是我國白茶的典型代表[1]。白茶因具有滋味鮮甜、毫香顯著等風(fēng)味品質(zhì)特點(diǎn)[2]，以及良好的保健效果[3]而越來越受消費(fèi)者的關(guān)注和喜愛。根據(jù)采摘標(biāo)準(zhǔn)和制茶原料的區(qū)別，可將白茶劃分為白毫銀針、白牡丹、壽眉和貢眉4種花色，在原料的選擇上貢眉與其他3 個(gè)花色白茶有很大區(qū)別，貢眉是以當(dāng)?shù)厝后w種茶樹的嫩稍為原料，經(jīng)萎凋、干燥、揀剔等特定工藝過程制成的白茶產(chǎn)品，而其他3 個(gè)均是由福鼎大白茶、福鼎大毫等無性系茶樹的鮮葉制作而成[4]。

香氣是決定茶葉品質(zhì)的重要因子之一，其對(duì)茶葉風(fēng)味、等級(jí)評(píng)定以及大眾消費(fèi)導(dǎo)向等都具有十分重要的作用。茶葉揮發(fā)性成分中存在少量關(guān)鍵呈香成分，對(duì)茶葉的香氣品質(zhì)起到重要影響，具有重要的研究價(jià)值和研究意義[5]。直到2017年頒布白茶的新國標(biāo)[4]，貢眉才正式作為白茶的品類之一被予以認(rèn)定。目前在白茶香氣研究中多以白毫銀針、白牡丹及壽眉作為對(duì)象，這些花色白茶的香氣成分都以醇類、醛類、酮類等為主，但香氣成分的含量與手性構(gòu)型存在明顯差異[6-8]。此外，不同花色白茶在壓餅陳化后香氣也存在差異，與白毫銀針相比，白牡丹和壽眉?jí)猴炾惢笙銡馄焚|(zhì)更佳[9]。由此可見，不同原料制作的白茶香氣成分存在較大的差異。貢眉作為白茶種類中不可缺少的一類花色，有關(guān)其主要香氣組成及關(guān)鍵呈香物質(zhì)的研究鮮見報(bào)道，致使無法科學(xué)闡述所有白茶種類的香氣特點(diǎn)。

全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（two-dimensional gas chromatography-time-of-flight-mass spectrometry，GC×GC-TOFMS）技術(shù)是在傳統(tǒng)氣相色譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，具有靈敏度高、分辨率高、峰容量大、定性更準(zhǔn)確和信息量大等優(yōu)點(diǎn)，近年來已在茶葉香氣化學(xué)研究上得到了廣泛的應(yīng)用，如綠茶[10-11]、紅茶[12]、黑茶[13]等。在眾多的香氣成分中，大部分香氣成分并沒有直接的呈香作用，只有少部分香氣成分起呈香作用。茶葉中關(guān)鍵呈香成分的分析方法一般有氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）、香氣活性值（odor activity value，OAV）、香氣化合物重組與消減實(shí)驗(yàn)等。GC-OMS是通過嗅聞人員使用可變電阻器的移動(dòng)記錄氣味隨時(shí)間變化強(qiáng)度的方法，已廣泛應(yīng)用于鑒定茶葉中關(guān)鍵呈香成分研究中[14]。Brattoli等[15]在不同操作條件下評(píng)估不同氣味化合物嗅覺檢測方法，發(fā)現(xiàn)GC-O-MS相對(duì)于其他常規(guī)方法有改進(jìn)。

本研究采用GC×GC-TOFMS技術(shù)分析貢眉的香氣組成，并結(jié)合GC-O-MS技術(shù)研究貢眉的關(guān)鍵呈香成分，以期為闡明貢眉的香氣品質(zhì)化學(xué)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究選用的3 個(gè)貢眉樣品均收集于福建福鼎市，生產(chǎn)于2018年（表1）。為保證質(zhì)量，3 個(gè)樣品根據(jù)GB/T 22291—2017《白茶》進(jìn)行了鑒定和感官審評(píng)，均具有較好的香氣品質(zhì)（表1）。在進(jìn)行香氣分析之前，使用研磨機(jī)將茶樣品研磨成均勻的粉末，然后在－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 茶葉樣品信息及香氣評(píng)估Table 1 Producers and sensory evaluation of tea samples tested in this study

芳樟醇、芳樟醇氧化物I、壬醛、水楊酸甲酯、反-3-壬烯-1-醇、反-2-壬烯醛、異戊酸順-3-己烯酯、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮（均為分析純） 日本TCI公司；1-辛烯-3-醇、苯乙醛、萘（均為分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；反,反-3,5-辛二烯-2-酮（分析純）美國AA Blocks公司；γ-壬內(nèi)酯（分析純） 上海Adamas公司；正構(gòu)烷烴（C8～C40） 北京百靈威公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Tube Mill control研磨機(jī) 德國IKA公司；Pegasus 4D GC×GC-TOFMS儀 美國Leco公司；7890B GC儀、5977B MS儀 美國安捷倫公司；GC-O儀 德國Gerstel GmbH & Co公司；AB104-S電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)性化合物的提取與解吸附

參照前期已優(yōu)化的方法進(jìn)行[12,16]。萃取方法為頂空固相微萃?。╤eadspace-solid phase microextraction，HS-SPME），萃取頭為碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS；85 μm，1 cm）。具體如下：首先將1.0 g茶粉放入20 mL玻璃小瓶中，加入6 mL沸騰去離子水；隨后立即用蓋密封，并放入60 ℃恒溫振蕩器中；待穩(wěn)定3 min后，使用CAR/PDMS萃取頭吸附60 min；最后，將揮發(fā)性化合物250 ℃解吸5 min，以進(jìn)行下一步分析。

1.3.2 揮發(fā)性化合物的GC×GC-TOFMS分析

參照前期已建立的GC×GC-TOFMS方法進(jìn)行[12]。GC-MS系統(tǒng)為Pegasus4D GC×GC-TOFMS，一維柱色譜柱為Rxi-5MS MS色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm），二維柱色譜柱為Rxi-17Sil色譜柱（1.9 m×100 μm，0.10 μm）。GC條件：一維柱升溫程序：50 ℃保持2 min，然后以8.0 ℃/min速率均勻升至265 ℃，保持5 min；二維柱升溫程序：55 ℃保持2 min，以8.0 ℃/min速率均勻升至270 ℃，保持5 min；載氣為氦氣（99.999%），恒定流量為1.0 mL/min；傳輸線溫度250 ℃；分流比例為10∶1；調(diào)制解調(diào)時(shí)間為5.0 s。MS條件：電離電壓為1 590 V；質(zhì)量掃描范圍m/z33～600；離子碰撞能量－70 eV；離子源溫度220 ℃；界面溫度270 ℃。

1.3.3 GC-O-MS分析

參照相關(guān)文獻(xiàn)的方法進(jìn)行[12]。GC條件：氣相色譜柱為Rxi-5MS色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；載氣為氦氣（99.999%），恒定流量為1.6 mL/min；氣相色譜柱升溫程序：50 ℃保持3 min，以4 ℃/min緩慢升至265 ℃，保持5 min；采用不分流進(jìn)樣模式。MS條件：電子電離源；電離電壓1 353 V；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；使用全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z50～550；離子碰撞能量－70 eV。嗅覺條件：MS檢測器和嗅覺檢測端口之間的分配比為1∶1；傳輸線和嗅聞口的溫度分別為260 ℃和230 ℃；氮?dú)猓?9.99%）作為輔助氣體，其流速為50 mL/min的恒定流量施加。為防止評(píng)估者的鼻黏膜干燥，GC嗅聞口有提供水分。

嗅聞分析小組由5 名（2 名男性和3 名女性）具有豐富審評(píng)經(jīng)驗(yàn)的審評(píng)員組成，經(jīng)過了至少90 h的培訓(xùn)[12]，并且還接受了2 個(gè)質(zhì)量控制茶樣的培訓(xùn)。香氣強(qiáng)度定義為1～4：1弱、2中等、3強(qiáng)烈、4極強(qiáng)。如果被至少3 名成員嗅聞到或2 名成員嗅聞到但香氣強(qiáng)度比較強(qiáng)烈（不小于3），且香氣描述類似，則認(rèn)為該香氣成分為關(guān)鍵呈香成分，并通過MS，保留指數(shù)（retention index，RI）和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用LECO Chroma TOF軟件處理GC×GC-TOFMS數(shù)據(jù)：一維峰寬和二維峰寬分別為25.0 s和0.1 s。最小RSN為50，最小相似匹配為750（最大1 000）；使用Statistical comparison功能完成峰匹配，一維保留時(shí)間和二維保留時(shí)間偏差分別設(shè)置為0.2 min和0.2 s；使用正構(gòu)烷烴（C8～C40）計(jì)算揮發(fā)性化合物的一維RI，如果本次實(shí)驗(yàn)RI和報(bào)道RI差異大于20，則刪除該化合物[17]。

揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量由單個(gè)揮發(fā)性化合物的峰面積（A）與單個(gè)樣品中所有鑒定得到的揮發(fā)性化合物的總峰面積（Atotal）比值計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 貢眉香氣成分的鑒定

通過對(duì)Mainlib、Replib及NIST_ri譜庫的自動(dòng)檢索，在貢眉茶樣中檢測到了近千個(gè)揮發(fā)性物質(zhì)，通過MS相似性匹配、RI比對(duì)以及標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證，總計(jì)鑒定得到236種可靠的揮發(fā)性成分，包括數(shù)量最多的醛類45種、酮類39種、酯類29種、烯烴類28種、醇類27種、芳香烴類22種、烷烴類17種、氧雜環(huán)類15種、氮雜環(huán)類8種、酸類3種、其他物質(zhì)2種及硫化物1種（表2）。

表2 貢眉揮發(fā)性成分組成及其相對(duì)含量Table 2 Volatile components and their relative contents in Gongmei white tea samples

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

續(xù)表2

2.2 貢眉香氣成分組成分析

如表3所示，醛類化合物相對(duì)含量最高（38.46%），醇類（25.58%）次之，醛類和醇類化合物的總相對(duì)含量大于60%。有研究表明，茶鮮葉中含有豐富的醇和醛類香氣物質(zhì)，并且在白茶萎凋過程中會(huì)進(jìn)一步大量增加[16,18]，這可能是貢眉中醛和醇含量高的原因。酮類、酯類和烯烴類物質(zhì)的數(shù)量雖然都多于25種，但是相對(duì)含量不高，分別為7.61%、4.56%和3.36%。芳香烴類和烷烴類物質(zhì)相對(duì)含量中等，分別為3.31%、5.59%。在此研究中，氧雜環(huán)類化合物，尤其是呋喃衍生物的相對(duì)含量相對(duì)較高，達(dá)到了7.02%，硫化物相對(duì)含量亦達(dá)到了3.67%，與現(xiàn)有的研究結(jié)果相差較大[7,19]。酸類（0.53%）、氮雜環(huán)類（0.30%）和其他（0.02%）化合物在貢眉中的相對(duì)含量極低。

表3 貢眉中不同種類揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量Table 3 Contents of different classes of volatile compounds in Gongmei white tea

就單個(gè)香氣成分而言，相對(duì)含量較高的成分（≥10‰）有18種，包括醛類6種、醇類5種及其他化合物7種，分別為苯甲醛（147.27‰）、反-2-己烯醛（90.14‰）、芳樟醇（79.80‰）、苯乙醇（50.76‰）、2-戊烷基呋喃（46.23‰）、香葉醇（39.06‰）、水楊酸甲酯（37.80‰）、二甲基硫醚（36.69‰）、正癸烷（31.68‰）、正己醛（29.39‰）、苯乙醛（25.06‰）、苯甲醇（22.15‰）、順-3-己烯-1-醇（19.30‰）、2-甲基正丁醛（17.47‰）、2-乙基呋喃（15.79‰）、壬醛（13.25‰）、反,反-3,5-辛二烯-2-酮（9.17‰）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（10.92‰）（表2）。研究表明這些化合物主要表現(xiàn)出天然的清香、花香、果香或甜香[20-21]，這可能是貢眉呈現(xiàn)純正、清鮮帶花香的原因。前期研究顯示白茶中香氣含量最高是芳樟醇[7]或己醛[19]，而本研究發(fā)現(xiàn)貢眉香氣相對(duì)含量最高的是苯甲醛（147.27‰），這可能與茶葉的原料及檢測方法不同有關(guān)。

2.3 貢眉香氣成分的GC-O-MS分析

茶葉中香氣成分眾多，但僅有很少一部分起主要作用，具有這樣性質(zhì)的揮發(fā)性組分稱為關(guān)鍵呈香成分或香氣活性成分[22]。因此，揮發(fā)性成分含量的高低并不能說明其對(duì)香氣的貢獻(xiàn)度大小，關(guān)鍵呈香成分還需要結(jié)合GCO-MS結(jié)果做進(jìn)一步判斷。

如表4所示，本次研究檢測到26種關(guān)鍵香氣活性化合物，其中鑒定出了21種，包括醇類9種、醛類5種、酮類4種、酯類2種和芳香烴類1種；此外，可能歸因于相應(yīng)揮發(fā)物的濃度極低，以及當(dāng)前的HS-SPME-GC-MS方法不完善，有5種香氣活性化合物沒有被鑒定出來，其依次被命名為未知1～5。根據(jù)這些香氣活性物質(zhì)的氣味特征，上述26種化合物可分為如下3種氣味類型：A類主要表現(xiàn)出類似草本的氣味，如清香、青草香或清爽香味；B類主要表現(xiàn)出令人愉悅的氣味，如花香、果香、奶香或甜香；C類中的氣味主要表現(xiàn)出令人不愉悅的氣味，如臭味、辛味或藥劑味。

表4 貢眉中關(guān)鍵呈香成分的香氣特征及強(qiáng)度Table 4 Aroma characteristics and intensity of key aroma compounds in Gongmei white tea samples

A類香氣物質(zhì)包括正己醛、順-3-壬烯-1-醇、1-庚醇、1-辛烯-3-醇、反,反-3,5-辛二烯-2-酮、反-3-壬烯-1-醇、反-2-壬烯醛、水楊酸甲酯及異戊酸順-3-己烯酯，這些香氣物質(zhì)主要來源于脂肪酸降解[16,20]。其中，反-2-壬烯醛是一種重要的呈香物質(zhì)，有助于綠茶[23-24]和抹茶[25]香氣品質(zhì)的形成；己醛也是綠茶[10]和烏龍茶[26]香氣品質(zhì)形成的重要貢獻(xiàn)者。值得注意的是，通常A類香氣物質(zhì)是具有雙重氣味特征，在低濃度下會(huì)散發(fā)出令人愉悅的清香和鮮爽氣味，而在高濃度下會(huì)呈現(xiàn)令人不快的草味或青臭味[27-28]。因此，適量的A類香氣成分將使貢眉具有令人愉悅的清香或清鮮香味，而高比例的A類香氣成分則可能使貢眉具有青氣。

B類香氣物質(zhì)包括苯甲醇、苯乙醛、芳樟醇氧化物I、芳樟醇、壬醛、苯乙醇、香葉醇、γ-壬內(nèi)酯、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮以及未知化合物1、2、4、5，這些物質(zhì)主要由揮發(fā)性萜類、氨基酸衍生的揮發(fā)性物質(zhì)和類胡蘿卜素衍生的揮發(fā)性物質(zhì)組成[16,20]。不同于A類香氣成分具有雙重氣味特性，B類香氣無論低濃度或高濃度都呈現(xiàn)出花香、果香、甜味或其他令人愉悅的氣味。芳樟醇、香葉醇、β-紫羅蘭酮、芳樟醇氧化物I和苯乙醇是紅茶[12,21,29]和烏龍茶[26]的關(guān)鍵香氣活性化合物。Feng Zhihui等[30]發(fā)現(xiàn)β-紫羅蘭酮是白茶香氣成分中香氣影響因子最高的成分，這與本實(shí)驗(yàn)中β-紫羅蘭酮的香氣強(qiáng)度為3這一結(jié)果相似。苯乙醇的香氣強(qiáng)度最高，達(dá)到了4.0，據(jù)報(bào)道苯乙醇具有芳香氣味且香氣閾值為0.62 mg/kg，閾值較低[31]，而其含量則相對(duì)較高（50.76‰），這可能是本研究中苯乙醇有較高香氣強(qiáng)度的原因。

C類香氣物質(zhì)包括萘、5-乙基-6-甲基-3-庚烯-2-酮和未知3，并呈現(xiàn)中高等強(qiáng)度（2～3）的難聞味道，如辛味、青臭味。萘是茶葉揮發(fā)性物質(zhì)中常見的不愉悅氣味，在綠茶[11]中呈現(xiàn)泥土氣味，在宜紅茶[29]中呈現(xiàn)柏油、樟腦味，在青磚茶[32]中表現(xiàn)為辛辣、陳腐等氣味。

如圖1所示，B類香氣物質(zhì)總強(qiáng)度最高，A類次之，C類最低。B類香氣的總強(qiáng)度（40.2）高于A類（23.5），A類香氣的總強(qiáng)度又高于C類（6.7）。B類香氣主要呈現(xiàn)愉悅的花香、果香或甜香等氣味，A類香氣主要呈現(xiàn)清香、清鮮或青氣等氣味，因此，高比例的B類香氣（57.1%）和適中比例的A類香氣（33.4%）是貢眉香氣呈現(xiàn)清鮮帶花香的基礎(chǔ)。

圖1 貢眉中不同類別香氣活性成分的總強(qiáng)度示意圖Fig.1 Total intensities of different classes of aroma-active compounds in Gongmei white tea

2.4 GC×GC-TOFMS和GC-O-MS結(jié)果聯(lián)合分析

如圖2所示，鑒定出的21種芳香化合物在其相對(duì)含量和香氣強(qiáng)度上表現(xiàn)出較大差異。在相對(duì)含量和香氣強(qiáng)度上表現(xiàn)都很突出的化合物有芳樟醇和苯乙醇，并且都呈現(xiàn)出花果香類型的氣味，這與之前研究報(bào)道的芳樟醇、苯乙醇等是白茶主要的香氣物質(zhì)相符[6-7]。值得注意的是，有一些香氣成分的相對(duì)含量低，但香氣強(qiáng)度較高，主要有1-庚醇、反-3-壬烯-1-醇、反-2-壬烯醛、異戊酸順-3-己烯酯、γ-壬內(nèi)酯、α-紫羅蘭酮和β-紫羅蘭酮，這應(yīng)該歸因于它們的呈香閾值比較低。如β-紫羅蘭酮的香氣閾值極低，僅為0.007 μg/kg，是橘紅茶中花香馥郁的特征物質(zhì)[29]，這與本實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果相符，因此推測β-紫羅蘭酮對(duì)貢眉花香的貢獻(xiàn)較大；肖作兵等[33]在對(duì)工夫紅茶香氣進(jìn)行定性定量分析時(shí)發(fā)現(xiàn)γ-壬內(nèi)酯（閾值0.025 μg/kg）的OAV為9.33，是工夫紅茶花香的關(guān)鍵香氣成分。此外，正己醛、苯甲醇、苯乙醛、壬醛、水楊酸甲酯等其他大部分香氣相對(duì)含量較高且香氣強(qiáng)度亦較高，這些香氣成分也在不同程度上對(duì)貢眉香氣的形成作出了貢獻(xiàn)。

圖2 貢眉中關(guān)鍵呈香成分的相對(duì)含量和香氣強(qiáng)度比較圖Fig.2 Comparison of relative contents and aroma intensities of key aroma-active compounds in Gongmei white tea

從GC×GC-TOFMS結(jié)果看，醛類和醇類物質(zhì)是貢眉的主要香氣成分（表2和表3）；從GC-O-MS結(jié)果看，醇類和醛類亦是貢眉的主要呈香成分（表4），因此，高比例的醇類和醛類香氣成分是貢眉香氣品質(zhì)形成的基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

本研究采用GC×GC-TOFMS技術(shù)詳細(xì)研究了貢眉中的香氣成分組成，鑒定得到236種香氣成分，其中醛類（38.46%）和醇類（25.58%）是貢眉中最豐富的香氣成分；苯甲醛、反-2-己烯醛、芳樟醇、苯乙醇、2-戊烷基呋喃、香葉醇等是貢眉中含量相對(duì)較高的揮發(fā)性物質(zhì)。進(jìn)一步采用GC-O-MS技術(shù)檢測到26種關(guān)鍵呈香物質(zhì)，其中鑒定出21種，主要為醇類和醛類香氣；這些關(guān)鍵呈香成分主要呈現(xiàn)清香、清鮮、花香、果香或甜香等令人愉悅的天然香味，其中苯乙醇、芳樟醇、反-2-壬烯醛、壬醛和β-紫羅蘭酮等化合物的香氣強(qiáng)度較高。GC×GCTOFMS和GC-O-MS結(jié)果聯(lián)合分析，高比例的醇類和醛類香氣成分是貢眉呈現(xiàn)清鮮香氣特征的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果將加深對(duì)白茶香氣品質(zhì)化學(xué)的認(rèn)識(shí)。