鄭思凡，馬長路，張文遠(yuǎn)，楊宇澤，申曉琳，姜竹茂，張書文,，呂加平

（1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；3.北京市畜牧總站，北京 100101；4.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046）

牛乳凝乳是酸乳和干酪等發(fā)酵乳制品生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵步驟[1]。在添加凝乳酶或發(fā)酵劑后，凝乳性能差（poor coagulation，PC）或不凝乳（non-coagulation，NC）現(xiàn)象的出現(xiàn)嚴(yán)重影響了產(chǎn)品得率及品質(zhì)[2]。在抗生素殘留控制十分嚴(yán)格的情況下，還是會(huì)出現(xiàn)NC或PC的現(xiàn)象，研究發(fā)現(xiàn)約有13%的奶牛包括丹麥荷蘭等國家的荷斯坦奶牛、Jersry牛等所產(chǎn)牛乳凝乳時(shí)間顯著較長，并且約有2%～4%的奶牛所產(chǎn)牛乳NC[3]，牛乳凝乳性能（milk coagulation properties，MCP）是決定牛乳加工生產(chǎn)所得奶酪得率的一個(gè)重要因素。MCP是牛乳凝固過程中多種因素共同作用的結(jié)果，其中牛乳含有的酪蛋白含量和MCP是干酪生產(chǎn)的關(guān)鍵因素，并且有研究報(bào)道，牛乳的遺傳因素中酪蛋白的多態(tài)性顯著影響MCP。

與凝乳性能好（well-coagulating，WC）的牛乳相比，PC或NC牛乳樣品中κ-酪蛋白（κ-casein，κ-CN）的基因型為AA，就酪蛋白而言，WC的牛乳酪蛋白膠束具有較大的平均直徑和較低含量的κ-CN。β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）基因型對(duì)凝乳時(shí)間有明顯影響。研究發(fā)現(xiàn)β-LG基因型為AA的牛乳比基因型為BB或AB的牛乳更適于加工干酪，前者可以加快凝乳速度并且能夠獲得更高的干酪產(chǎn)量，這可能是由于含基因型為AA的β-LG的牛乳通常酪蛋白含量較高所致，同時(shí)含A等位基因β-LG的牛乳要比含B等位基因β-LG的牛乳凝乳速度更快[4]。在生產(chǎn)Manchego干酪時(shí)，β-LG基因型為AA的牛乳加工的干酪產(chǎn)量最高。

PC牛乳的κ-CN基因型通常為AA、AE和EE，而凝乳時(shí)間短和凝塊硬度大的牛乳其κ-CN等位基因通常為B[5]。影響MCP大小的κ-CN基因型的順序?yàn)锽B＞AB＞AA，這種κ-CN基因型的順序與Hallén等[6-7]描述的κ-CN濃度和比例相對(duì)應(yīng)。除了環(huán)境因素外，已經(jīng)證實(shí)了牛乳凝固的遺傳因素中最一致的結(jié)果是，κ-CN、β-CN和β-LG與牛乳凝乳和奶酪的生產(chǎn)效率呈正相關(guān)趨勢(shì)[1,8]。個(gè)體奶牛的MCP變化主要與酪蛋白（αS1-、αS2-、β-和κ-CN）和乳清蛋白的含量和相對(duì)比例有關(guān)[1,9]，這些成分影響酪蛋白膠束的大小和穩(wěn)定性。

本實(shí)驗(yàn)研究不同乳蛋白基因型對(duì)牛乳凝乳特性的影響，通過動(dòng)態(tài)流變儀、凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相色譜技術(shù)等手段分析不同基因型原料乳的凝乳特性差異。明確造成牛乳PC或NC的內(nèi)源性因素，建立原料乳組分與凝乳特性之間的相關(guān)性，確定影響凝乳的主要乳蛋白質(zhì)組分和基因型。以期為原料乳的品質(zhì)評(píng)價(jià)和合理利用，改善發(fā)酵乳品質(zhì)，增加乳品企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益，提供重要的理論研究參考和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1 071 頭奶牛分別來自北京三元綠荷南口三場、綠荷南口二場、三石牛場、王莊牛場等。采集血樣和乳樣。

凝乳酶（CHY-MAX POWDER EXTRA NB）科漢森中國有限公司；乳酸、氫氧化鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、尿素（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二硫代蘇糖醇、羥丙基甲基纖維素、三羥甲基胺基甲烷、鹽酸胍、Bis-Tris（均為分析純），α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）、β-LG、α-CN、β-CN、κ-CN標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；乙腈、三氟乙酸、甲醇（均為色譜純） 北京廣達(dá)恒益科技有限公司；實(shí)驗(yàn)所用水均為Millpore超純水。

樣品緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取0.295 4 g檸檬酸鈉、0.156 g二硫代蘇糖醇、2.011 1 g三羥甲基胺基甲烷，加入6 mol/L尿素溶液75 mL，定容至100 mL，調(diào)至pH 8.0。

運(yùn)行緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取4.208 3 g檸檬酸、0.582 8 g檸檬酸鈉、0.05%羥丙基甲基纖維素，加入6 mol/L尿素溶液75 mL，定容至100 mL，調(diào)至pH 3.0。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；3K15離心機(jī)德國Sigma公司；MCR502流變儀 奧地利安東帕公司；7700X電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、Alpha Ease FC凝膠成像系統(tǒng) 美國Agilent公司；L-80XP超速離心機(jī)、毛細(xì)管電泳儀 美國Beckman公司；UHPLC 1525超高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

血樣采集及檢測(cè)：通過對(duì)北京三元綠荷南口奶牛三場等牛場3 625 頭母牛系譜分析，采集其后代1 071 頭16 月齡大青年、一胎、二胎母牛血樣并提取DNA，采用競爭性等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)樣本進(jìn)行分型，之后利用基因分型技術(shù)對(duì)其進(jìn)行κ-CN和β-LG基因分型檢測(cè)。主要操作是通過蛋白酶K消化，使用苯酚-氯仿從血液樣本中分離DNA。使用MassARRAY iPLEX受體型蛋白酪氨酸磷酸酶分析對(duì)DNA進(jìn)行基因分型。匯編80 個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)，包括κ-CN和β-LG，僅對(duì)次要等位基因頻率大于5%且檢出率至少為90%的SNP進(jìn)行分析。

乳樣采集：初篩和復(fù)篩方法。在北京三元綠荷南口奶牛三場，采集已知的6種基因型原料乳樣品，每種基因型樣品每次采集至少30 份，每份50～100 mL，共180 份；相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次（每隔15 d采集1 次，共采集3 次）。從中篩選出WC、PC及NC牛乳樣品每類至少5 份樣品；然后，重復(fù)采集選出的牛乳樣品5 次（隔3 d采集1 次，每天采集早、中、晚3 次，每次采集50～100 mL）。

1.3.2 MCP判定標(biāo)準(zhǔn)

將牛乳放置于33 ℃恒溫水浴鍋，添加凝乳酶使其凝乳，按照凝乳時(shí)間劃分凝乳等級(jí)，凝乳時(shí)間在18 min以內(nèi)的劃分為WC乳樣，凝乳時(shí)間在18～30 min之內(nèi)的劃分為PC乳樣，凝乳時(shí)間大于30 min的乳樣即為NC乳樣[4]。

1.3.3 電感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定

使用電感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定樣品中可溶性鈣、鎂和磷濃度。按照文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行檢測(cè)并稍作修改。將原料乳在4 ℃、2 000×g離心30 min取脫脂乳測(cè)定乳中元素總含量。樣品前處理將牛乳分為可溶相和膠體相，使用超速離心機(jī)將10 mL樣品100 000×g離心1 h[11]，收集上清液用于可溶相元素分析。波長315.887 nm，功率1 kW，等離子流量15 L/min，輔助流量1.5 L/min，霧化器流量0.75 L/min，泵速15 r/min。所有樣品均重復(fù)3 次。在超速離心的上清液中測(cè)量可溶性礦物質(zhì)含量。計(jì)算方法見下式：

膠束礦物質(zhì)含量＝總礦物質(zhì)含量－可溶性礦物質(zhì)含量

1.3.4 流變儀分析

參考文獻(xiàn)[11]的方法，準(zhǔn)備已預(yù)選好的牛乳樣品20 mL，用體積分?jǐn)?shù)10%的乳酸溶液將pH值調(diào)節(jié)至6.5，移取適量樣品至流變儀樣品池中，檢測(cè)條件為應(yīng)變1%，頻率1 Hz，預(yù)熱并穩(wěn)定溫度在33 ℃后，每10 mL樣品添加凝乳酶8.9 μL（酶濃度0.038 IMCU/mL），攪勻后開始測(cè)定，測(cè)定時(shí)間1 h，檢測(cè)指標(biāo)包括凝乳時(shí)間、儲(chǔ)能模量G’、損耗模量G”。

1.3.5 牛乳成分測(cè)定數(shù)據(jù)收集和整理

數(shù)據(jù)來自該采樣牛場采樣牛只的DHI記錄，主要包括牛號(hào)、基因型、采樣時(shí)間、胎次、產(chǎn)犢日期、泌乳時(shí)間、日產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率、脂蛋白比、體細(xì)胞數(shù)、體細(xì)胞評(píng)分等信息。為保證結(jié)果的可靠性，數(shù)據(jù)不完整的記錄不納入分析。

1.3.6 毛細(xì)管電泳分析蛋白多態(tài)性

操作條件為分離電壓20 kV、柱溫38 ℃、進(jìn)樣壓力0.5 psi、時(shí)間5 s、紫外檢測(cè)波長214 nm。參考文獻(xiàn)[12]方法，采用毛細(xì)管電泳定量分析樣品牛乳κ-CN和β-LG的含量。將樣品與樣品緩沖溶液按1∶3（V/V）的比例混合，室溫放置1 h，10 000 r/min離心5 min，取上清液，用0.45 μm的濾膜過濾后直接進(jìn)樣。

1.3.7 高效液相色譜法分析牛乳中蛋白質(zhì)含量

參照文獻(xiàn)[4,13-14]方法并加以修改。向樣品中加入等體積的工作液I（0.1 mol/L Bis-Tris、6 mol/L鹽酸胍、5.37 mmol/L檸檬酸鈉、19.5 mmol/L二硫蘇糖醇的混合溶液），樣品融化后振蕩10 s混勻，室溫靜置1 h。將混合溶液4 ℃、16 000×g離心5 min，除去表層乳脂，取底層溶液300 μL于新的離心管中，加入工作液II（以流動(dòng)相A為溶劑的4.5 mol/L鹽酸胍溶液）體積比1∶3稀釋，混勻，過濾到進(jìn)樣瓶中待測(cè)。流動(dòng)相A為0.1% TFA溶液，流動(dòng)相B為0.1% TFA-乙腈溶液。流動(dòng)相經(jīng)抽濾、超聲脫氣后備用。

色譜條件：Waters SunFiveTMC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測(cè)波長214 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.5 mL/min。實(shí)驗(yàn)所用水均為Millpore超純水。洗脫梯度：0～9 min，67%～65% A、33%～35% B；9～18 min，63%～60% A、37%～40% B；18～22 min，60%～59% A、40%～41% B；22～27.5 min，59% A、41% B；27.5～28 min，59%～57% A、41%～43% B；28～36 min，57%～55% A、43%～45% B；36～40 min，55%～10% A、45%～90% B。

1.4 數(shù)據(jù)處理

除另有說明，每種處理均3 次重復(fù)。利用SPSS具有相互作用的單向ANOVA以確定顯著差異。使用Duncan的多重范圍測(cè)試比較多個(gè)均值之間的差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性設(shè)定為P＜0.05，差異顯著。繪圖由Origin 9.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳蛋白基因型頻率分析

血樣采集結(jié)果顯示，κ-CN基因設(shè)計(jì)4 個(gè)SNP位點(diǎn)，β-LG基因設(shè)計(jì)2 個(gè)SNP位點(diǎn)，其中κ-CN基因有AA、AB、AE、BB、BE、EE 6種基因型，β-LG基因型有AA、AB、BB 3種基因型。

牛場現(xiàn)有奶牛中已知基因型的牛乳蛋白基因型及頻率，κ-CN和β-LG的乳蛋白基因型存在比例上的差異，如表1所示。在所有奶牛組中，β-LG的AB基因型（占比48.48%）最常見，但AA型基因（30.97%）的原料乳凝乳效果較好；κ-CN的BB基因型（12.00%）凝乳效果較好，較AA、AB等凝乳時(shí)間更短和凝膠強(qiáng)度更強(qiáng)。酪蛋白和乳球蛋白的不同基因型牛乳的凝乳頻率也存在明顯差異。分泌κ-CN的AA基因型牛乳的母牛所占比例最高，在κ-CN的AB、BB、BE基因的總體凝乳效果較好，凝乳頻率都達(dá)到了70%以上。等位基因B對(duì)凝乳有積極作用[15]，與AB型相比，BB基因型更能提高干酪產(chǎn)量，等位基因A對(duì)凝乳產(chǎn)生消極作用。κ-CN的EE在整體牛群中比例含量最少，考慮到母牛的更替換代，所以在后續(xù)分析處理中并未對(duì)此基因型列入到數(shù)據(jù)庫中；在所有奶牛組中最常見的β-LG基因型是AB[6]，β-LG的AA和BB基因型的凝乳效果良好，凝乳頻率都超過了80%，而AB基因型有33.01%的MCP很差，有7.56%的牛乳NC，這導(dǎo)致其整體的MCP大大減弱。從以上結(jié)果可知，至少有4%～8%的牛乳存在NC的現(xiàn)象，若這部分牛乳應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)過程中，其對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)造成一定影響，這也證明了此研究的必要性。有相關(guān)研究[2]顯示，丹麥荷斯坦奶牛和Jersey奶牛也有類似的趨勢(shì)，本研究結(jié)果與其一致。已有研究[16-19]表明：κ-CN和β-LG的B變異體可通過縮短凝乳時(shí)間，改善凝乳硬度而對(duì)MCP產(chǎn)生有利影響。另外，前期研究報(bào)道，κ-CN的A和E型變異體對(duì)凝乳有負(fù)面影響[20]，但在本實(shí)驗(yàn)中并未顯示出E型基因?qū)CP有明顯的負(fù)面影響，原因可能是我國所用奶牛是荷斯坦牛與本土黃牛的雜交品種，其牛乳相關(guān)特性發(fā)生了改變，所以并未有明顯的負(fù)面效果，或者是E型牛乳在牛群中樣本量不足。

表1 κ-CN和β-LG蛋白各基因型牛乳的凝乳頻率Table 1 Curding frequency of milk from cows with different κ-CN and β-LG genotypes

2.2 乳成分及體細(xì)胞分析

兩種蛋白不同基因型所對(duì)應(yīng)牛乳DHI的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)（表2）顯示，κ-CN中基因型AB和AE含蛋白較高。AE基因型雖蛋白質(zhì)含量較高，但表1顯示其凝乳頻率較低，原因可能是在總蛋白中乳清蛋白含量較高、酪蛋白含量較低導(dǎo)致，酪蛋白是凝乳過程中起主要作用的蛋白。并且與具有良好凝結(jié)特性的牛乳相比，PC、NC牛乳在凝結(jié)性差和不凝結(jié)的牛乳中總蛋白、總酪蛋白和κ-CN含量較低，且礦物質(zhì)含量（Ca、P、Mg）較低[1]。其他乳糖、干物質(zhì)含量相差不大，說明這些因素對(duì)凝乳效果影響不大。但也有文獻(xiàn)指出，在制作酸乳過程中乳糖可提高酪蛋白的凝膠作用，對(duì)凝乳強(qiáng)度有積極作用[21]。乳糖可以通過增強(qiáng)凝膠中相鄰酪蛋白膠束表面上非極性氨基酸殘基或非極性板塊之間的疏水相互作用增強(qiáng)酪蛋白凝膠化作用。有必要進(jìn)一步分析乳糖在酸誘導(dǎo)乳凝中的作用[7]。

表2 κ-CN和β-LG不同基因型牛乳DHI檢測(cè)結(jié)果Table 2 DHI parameters of milk from cows with different κ-CN and β-LG genotypes

2.3 流變儀分析MCP

G’和G”是反映牛乳黏彈性的重要指標(biāo)；G’代表牛乳流動(dòng)時(shí)的彈性大小，描述樣品的固態(tài)特性。G”代表樣品流動(dòng)時(shí)的黏性大小，表示流動(dòng)時(shí)由于內(nèi)部摩擦而損失的變形能量，描述樣品的液態(tài)特性。一般認(rèn)為，G’值越高，其凝膠結(jié)構(gòu)越致密。凝乳時(shí)間定義為凝膠G’值大于1 Pa時(shí)所需的時(shí)間點(diǎn)[22]。通過流變數(shù)據(jù)可以看出，在初篩出的全部樣品中，可以明顯界定出WC、PC與NC的樣品。由表3可知，將WC、PC與NC牛乳樣品的凝乳時(shí)間和凝乳硬度進(jìn)行比較，結(jié)果表明差異極顯著（P＜0.01）。對(duì)應(yīng)的動(dòng)態(tài)流變示意圖如圖1所示，WC牛乳的G’值最高，其凝膠結(jié)構(gòu)最為緊密，并且凝乳時(shí)間最短，凝乳效率最高；而PC牛乳雖能形成凝膠，但其凝乳時(shí)間較長，G’值普遍比WC牛乳要低，證明其凝膠結(jié)構(gòu)不夠緊致，不堅(jiān)硬，形成的凝乳狀態(tài)不好，會(huì)影響生產(chǎn)品質(zhì)；NC牛乳顯而易見基本未形成凝乳狀態(tài)，其G’值甚至未達(dá)到10 Pa，沒有形成凝膠狀態(tài)，影響最終產(chǎn)品品質(zhì)。表4顯示了β-LG的AA基因型凝乳時(shí)間較短，且凝膠強(qiáng)度最高，但乳球蛋白含量較高會(huì)對(duì)凝乳產(chǎn)生不利影響，延長凝乳時(shí)間并降低凝乳強(qiáng)度；κ-CN的BB基因型較其他4種基因型，其凝乳時(shí)間最短，G’30值最高，證明形成的凝膠結(jié)構(gòu)更為致密，形成了高度交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，BB型基因?qū)εＨ槟楫a(chǎn)生有利影響[20]。

表3 動(dòng)態(tài)流變數(shù)據(jù)定義牛乳凝乳等級(jí)的顯著性分析結(jié)果（x±s）Table 3 Significance analysis results of rheological data defining milk coagulation grades (x ± s)

表3 動(dòng)態(tài)流變數(shù)據(jù)定義牛乳凝乳等級(jí)的顯著性分析結(jié)果（x±s）Table 3 Significance analysis results of rheological data defining milk coagulation grades (x ± s)

注：**.三者差異極顯著，P＜0.01；1.主觀評(píng)價(jià)凝乳30 min的硬度：堅(jiān)固=足以形成立方體；柔軟=不足以形成立方體；等級(jí)按照G’18的時(shí)間劃分；NC時(shí)間統(tǒng)一選取檢測(cè)總時(shí)長60 min作為最終時(shí)間。

指標(biāo) 凝乳等級(jí) 顯著性WC（n=30） PC（n=13） NC（n=8）凝乳時(shí)間/min 11±2.18 21.91±2.98 ＞30 **G′max/Pa 139.35±26.30 59.51±17.64 6.53±5.32 **30 min凝乳硬度1 堅(jiān)固 柔軟 不凝乳

圖1 3 類牛乳樣品動(dòng)態(tài)流變示意圖Fig.1 Dynamic rheological curves of milk samples with different coagulation abilities

表4 基因型與凝乳時(shí)間及凝乳硬度的關(guān)系Table 4 Relationship of genotype with RCT and curd hardness

2.4 不同凝乳種類牛乳組成及礦物元素分布

由表5可知，在NC牛乳樣品中的礦物元素含量明顯低于凝乳WC樣品，此結(jié)果與Jensen等[1]的研究結(jié)果一致。尤其膠體鈣含量明顯較低，以及可溶相和膠體相中磷元素含量差異明顯。結(jié)果說明離子含量和分布的差異影響牛乳的凝乳能力。WC樣品比NC樣品中總鈣含量高，膠體相鈣含量與MCP呈正相關(guān)趨勢(shì)，結(jié)果差異顯著。酪蛋白膠束和可溶性礦物質(zhì)的分布，尤其是鈣和磷離子含量，影響酪蛋白膠束的大小和穩(wěn)定性[23]。但礦物元素分布不受蛋白質(zhì)遺傳多態(tài)性的影響。Ca2＋有助于凝乳酶凝結(jié)，但不能促進(jìn)酸凝結(jié)[22]。高鈣含量會(huì)促使酪蛋白膠束凝結(jié)，從而提高干酪產(chǎn)量。離子鈣的積極作用體現(xiàn)在通過改善聚集過程中的相互作用，降低了酪蛋白的表面電荷等方面[24]。另外，在凝乳酶誘導(dǎo)過程中，當(dāng)超過85%的κ-CN水解時(shí)，酪蛋白膠束會(huì)大量聚集。疏水相互作用和鈣鍵是凝乳酶誘導(dǎo)的凝膠的主要作用力。Jensen等[1]研究表明膠束礦物元素分布比例與泌乳階段差異有關(guān)。

表5 牛乳組成和礦物質(zhì)成分（x±s）與凝乳等級(jí)的關(guān)系Table 5 Milk composition and mineral composition (x ± s) as a function of milk coagulation grades

表5 牛乳組成和礦物質(zhì)成分（x±s）與凝乳等級(jí)的關(guān)系Table 5 Milk composition and mineral composition (x ± s) as a function of milk coagulation grades

注：*.P＜0.05，差異顯著；**.P＜0.01，差異極顯著；***.P＜0.000 1，差異高度顯著。基于ANOVA檢驗(yàn)計(jì)算顯著性。

檢測(cè)項(xiàng)目 WC PC NC 顯著性測(cè)定值 最小值 最大值 測(cè)定值 最小值 最大值 測(cè)定值 最小值 最大值牛乳成分及pH值脂肪/（g/100 mL） 3.86±0.73 2.24 5.33 3.77±0.89 2.24 5.88 3.72±0.59 2.92 5.01 NS pH 6.76±0.10 6.53 6.96 7.08±0.14 6.75 7.38 7.16±0.13 6.97 7.44 ***乳糖/% 5.23±0.12 4.90 5.45 5.22±0.21 4.14 5.46 5.19±0.10 4.98 5.40 NS蛋白質(zhì)/（g/100 mL） 3.34±0.24 2.94 4.10 3.27±0.26 2.74 4.19 3.07±0.27 2.77 3.35 *酪蛋白/（g/100 mL） 2.23±0.08 2.45 2.18 2.13±0.15 2.32 2.02 2.05±0.21 2.12 1.95 *乳清蛋白/（g/100 mL） 0.59±0.02 0.56 0.62 0.59±0.04 0.54 0.65 0.61±0.06 0.54 0.71 NS體細(xì)胞數(shù) 163±157.07 17 487 177.19±259.04 10 1427 314.80±429.51 18 1 367 NS鹽分布總Ca/（mg/kg） 1 205.44±139.04 1 016.41 1 265.65 1 097.89±54.08 949.27 1156.13 978.35±61.29 849.44 1 070.75 *可溶相Ca/（mg/kg） 467.46±100.02 323.31 509.73 451.86±44.57 408.39 497.45 436.34±60.67 366.80 478.49 *膠體Ca/（mg/kg） 667.98±132.70 524.51 786.31 546.03±57.95 490.83 606.39 582.01±216.71 370.95 803.95 NS總Mg/（mg/kg） 108.38±7.47 99.77 113.08 108.20±1.69 106.37 109.70 106.55±20.04 84.53 123.72 *可溶相Mg/（mg/kg） 69.30±6.09 64.15 76.02 77.28±6.32 70.50 83.03 71.71±3.84 69.26 76.13 NS膠體Mg/（mg/kg） 39.08±13.46 23.74 48.93 30.92±5.20 25.49 35.87 34.84±19.84 14.79 54.46 NS總P/（mg/kg） 991.88±204.48 827.07 1 220.70 957.24±57.13 891.69 996.47 1 020.84±217.77 780.59 1 205.25 NS可溶相P/（mg/kg） 464.48±94.95 385.14 569.68 531.01±66.83 477.10 605.78 534.65±44.49 501.38 585.19 NS膠體P/（mg/kg） 527.40±131.96 388.44 651.02 426.23±55.20 377.78 486.33 486.19±204.37 279.21 687.85 NS

WC牛乳體細(xì)胞數(shù)明顯低于NC及PC牛乳樣品，體細(xì)胞數(shù)含量越高，MCP越差，當(dāng)然還包括有乳房炎的個(gè)體牛，泌乳量減少，牛乳中體細(xì)胞數(shù)含量增加。體細(xì)胞數(shù)增加與纖溶酶活性高有關(guān)，纖溶酶會(huì)影響乳蛋白含量進(jìn)而影響凝乳。另外乳蛋白和和乳脂肪含量越高，牛乳的凝乳效果越好[25]。凝乳過程包含多種機(jī)制，如已知pH值的變化會(huì)影響酶的活性，證明纖溶酶在低pH值牛乳中的活性較低[26-27]。乳糖含量與MCP呈正相關(guān)趨勢(shì)，在WC牛乳樣品中含量略有增高，但其中機(jī)制尚不清楚。有解釋說乳糖是牛乳中重要的滲透調(diào)節(jié)劑，當(dāng)乳腺發(fā)炎時(shí)，血液中的離子流入乳汁的量增加，會(huì)導(dǎo)致高體細(xì)胞數(shù)乳汁中的電導(dǎo)率增加和乳糖含量降低。在PC或NC牛乳中，乳脂含量低于凝乳中乳脂含量，但這一結(jié)果與Jensen[1]的結(jié)果相符。

另外，結(jié)果顯示W(wǎng)C牛乳樣品的pH值整體比PC和NC牛乳樣品低，可能是由于在高pH值下溶解膠束P和Ca的時(shí)間更長，所以pH值越高，MCP越差[28]。不同MCP牛乳中乳蛋白含量無明顯差異或顯著趨勢(shì)，但總蛋白中酪蛋白含量與凝乳性能呈正相關(guān)趨勢(shì)，牛乳中酪蛋白含量越高，MCP越好，凝乳時(shí)間越短，凝膠強(qiáng)度越高。

2.5 毛細(xì)管電泳和高效液相色譜HPLC檢測(cè)結(jié)果

由圖2可知，利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法可快速地檢測(cè)出牛乳中幾種蛋白質(zhì)。通過峰形和峰值的對(duì)比，WC牛乳樣品的β-CN的大部分樣品都存在2 個(gè)峰，并且在NC牛乳樣品中其他小峰，可能是水解產(chǎn)物，或者蛋白磷酸化水平較高。國外相關(guān)使用毛細(xì)管電泳法判斷乳酪發(fā)酵過程中酪蛋白含量變化發(fā)現(xiàn)牛乳的特征也很明顯。

圖2 3種牛乳樣品毛細(xì)管電泳圖Fig.2 Capillary electrophoregrams of α-LA, β-LG and CNs in milk samples with different coagulation abilities

由圖3可知，液相色譜結(jié)果和毛細(xì)管電泳結(jié)果相互對(duì)應(yīng)，WC牛乳蛋白相對(duì)含量比PC和NC高，PC和NC牛乳樣品的圖譜中出現(xiàn)了除主要乳清蛋白和酪蛋白5種蛋白的其他峰值，可能是在PC和NC牛乳樣品中的其他種類蛋白含量較多，如proteolyticβ-CN、para-κ-CN等一些磷酸化程度較高的蛋白峰。乳蛋白質(zhì)的多態(tài)性不僅表現(xiàn)在蛋白質(zhì)的種類和不同遺傳變異體上，而且還表現(xiàn)在蛋白質(zhì)翻譯后的修飾上，如磷酸化、糖基化、二硫鍵的形成及蛋白質(zhì)的水解。

圖3 不同凝乳特性牛乳的液相色譜圖Fig.3 HPLC profiles of α-LA, β-LG and CNs in milks with different coagulation properties

牛乳中含有4種不同的酪蛋白，分別為αS1-、αS2-、β-和κ-CN，占總酪蛋白的比例分別約為37%、10%、35%和12%，牛乳中蛋白的相對(duì)含量如表6所示。檢測(cè)前，已將不同類型牛乳蛋白含量規(guī)范到相同濃度。已有研究提出，κ-CN在凝乳酶誘導(dǎo)凝乳過程中起著至關(guān)重要的作用，κ-CN含量越高，牛乳凝乳能力越高，特別源自占主要比例的未糖基化κ-CN 1P的影響最大，在其他研究中，發(fā)現(xiàn)NC牛乳中的κ-CN含量較低[9]，較高的κ-CN含量可以改善牛乳的整體凝結(jié)能力。

表6 牛乳中蛋白的相對(duì)含量Table 6 Relative contents of milk proteins

κ-CN上的碳水化合物使其具有親水性和較高的水溶性。當(dāng)凝乳酶作用時(shí)，含有碳水化合物的C-末端被水解下來，形成糖巨肽，糖巨肽結(jié)構(gòu)域消除了膠束的極性靜電和空間穩(wěn)定作用，增加了表面疏水性并導(dǎo)致凝塊形成[29-30]。Frederiksen等[11]指出，在PC牛乳中κ-CN含量相對(duì)較低，αS1-、αS2-CN的磷酸化程度較高，κ-CN的AA型蛋白是導(dǎo)致PC和NC牛乳不凝的重要因素，但只靠它本身的強(qiáng)度并不夠，主要是乳蛋白之間存在緊密的遺傳聯(lián)系，并且高含量κ-CN與較小的膠束有關(guān)，與凝膠強(qiáng)度呈正相關(guān)。但κ-CN含量的增加會(huì)使酪蛋白總體含量增加[23]，而不是僅κ-CN相對(duì)含量的變化，這是一個(gè)整體關(guān)聯(lián)的關(guān)系。Wedholm等[31]指出，PC和NC牛乳樣品主要與κ-CN在總酪蛋白中含量較低有關(guān)，此外，AB基因型牛乳中κ-CN濃度高于AA基因型。對(duì)于總酪蛋白和β-LG含量相當(dāng)?shù)呐Ｈ槎?，選擇高濃度的αS1-、β-和κ-CN牛乳可以提高奶酪制作性能。

3 結(jié) 論

本研究統(tǒng)計(jì)分析的奶牛樣本中，β-LG AB基因型最常見，研究發(fā)現(xiàn)β-LG基因型為AA的牛乳比基因型為BB或AB的牛乳更適于加工干酪，前者可以加快凝乳速度并且能夠獲得更高的干酪產(chǎn)量，這可能是由于含基因型AA的β-LG的牛乳通常酪蛋白含量較高所致；κ-CN BB基因型具有較好MCP，較AA、AB等其凝乳時(shí)間更短和凝膠強(qiáng)度更強(qiáng)。WC的樣品中酪蛋白含量及鈣離子含量較高，總膠體鈣含量越高，對(duì)酶凝膠越有利；此外，WC牛乳的pH值較PC和NC牛乳樣品低。凝結(jié)受κ-CN含量的有利影響，酪蛋白和乳清蛋白組成和基因頻率的變化會(huì)影響MCP的變化。牛乳中α-LA對(duì)酶凝具有不利影響，相反，κ-CN相對(duì)含量越高，MCP越好。

乳蛋白的遺傳多態(tài)性主要影響牛乳蛋白的相對(duì)含量及其磷酸化和糖基化程度，對(duì)凝乳的影響主要是通過影響蛋白含量而產(chǎn)生間接影響，未來需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)牛乳蛋白組成和翻譯后修飾對(duì)凝乳能力的影響，但此研究結(jié)果表明，酪蛋白牛乳和乳清蛋白基因座處的牛乳蛋白組成和基因頻率的變化對(duì)牛乳的凝結(jié)特性產(chǎn)生影響。牛乳蛋白質(zhì)組分含量和蛋白質(zhì)組成的遺傳參數(shù)，需要進(jìn)一步研究。