河北中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院

張欣欣 辛 鑫 吳振華 檀 淼△ 楊鳳文 張翠輕 陳素枝 袁國棟 檀金川(石家莊 050011)

提要 目的：通過研究大黃泄?jié)岱綄?/6腎切除大鼠腎組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)相關(guān)蛋白的影響，探討其保護腎功能延緩腎間質(zhì)纖維化(RIF)的作用機制。方法：90只健康SD雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組，模型組，大黃泄?jié)岱降?、中、高劑?6.825、13.650、27.300 g/kg)組和尿毒清顆粒組(2.600 g/kg)。除假手術(shù)組外，其余均采用5/6腎切除手術(shù)誘導慢性腎衰竭(CRF)大鼠模型。模型誘導成功后，各藥物干預組分別予規(guī)定劑量的藥物混懸液灌胃，每日1次，連續(xù)8周。給藥結(jié)束后，檢測大鼠血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)水平和24 h尿蛋白定量(UTP)；Masson染色觀察RIF程度；免疫組織化學法檢測腎組織中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的表達情況。結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血Scr、BUN、UTP水平顯著增高(P<0.05)，腎間質(zhì)發(fā)生顯著纖維化，GRP78、CHOP蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，大黃泄?jié)岱礁鲃┝拷M和尿毒清顆粒組血Scr、BUN、UTP水平具有不同程度降低(P<0.05)，RIF不同程度改善，GRP78、CHOP蛋白表達顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：大黃泄?jié)岱娇蓽p輕5/6腎切除術(shù)誘導的CRF大鼠腎功能惡化、改善RIF病理改變，其機制可能與降低GRP78、CHOP蛋白表達以抑制ERS有關(guān)。

腎間質(zhì)纖維化(RIF)是各種腎臟疾病進展到一定階段表現(xiàn)出的共同病理特征，是腎臟結(jié)構(gòu)損害和腎功能障礙的重要原因之一[1- 2]。減輕RIF病理進程對于減緩慢性腎衰竭(CRF)進展和保護腎功能具有十分重要的意義。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)在RIF進程中扮有重要角色[3]，適度的ERS對于維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)、細胞存活和延緩RIF至關(guān)重要；但過強的ERS會誘導腎臟實質(zhì)細胞發(fā)生凋亡，增加腎臟結(jié)構(gòu)不可逆性損傷，進而加速了RIF的進展[4]。

中藥復方在延緩腎纖維化、減輕腎損傷和延緩腎衰進程方面具有顯著療效[5-7]。大黃泄?jié)岱?由大黃、黃芪、土茯苓、水牛角絲、丹參、當歸、醋龜甲、地龍、積雪草組成)是導師檀金川教授治療CRF的常用中藥復方，目前已經(jīng)成為河北省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，組方針對CRF患者“脾腎虧虛、濕熱瘀蘊結(jié)”特點，具有健脾益腎、清熱利濕、化瘀通絡(luò)、泄?jié)峤舛镜墓π?，臨床應用時發(fā)現(xiàn)在改善患者腎衰癥狀、降低血肌酐(Scr)和降低尿蛋白等方面均取得較好的療效，但具體的作用機制尚不明確。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白是ERS相關(guān)蛋白，本研究通過觀察大黃泄?jié)岱綄RF大鼠腎組織中ERS相關(guān)蛋白GRP78、CHOP表達的影響，探討其保護腎功能延緩RIF的作用機制，以期為其臨床運用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF級健康SD雄性大鼠[(6～8周齡、體質(zhì)量(160±20)g]90只，遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供[許可證書編號SCXK(遼)2020-0001]；在河北中醫(yī)學院SPF級實驗動物中心飼養(yǎng)，自由飲水及進食。

1.2 藥物 大黃泄?jié)岱剿兴幉木鶃碜杂诤颖笔≈嗅t(yī)院中藥房，中藥配方顆粒由廣東一方制藥有限公司提供(藥物批號：大黃0060243、黃芪0071088、土茯苓0080923、水牛角絲0066623、丹參0071563、當歸0070963、醋龜甲0076823、地龍0057083、積雪草0055443)，中藥顆粒中生藥含量分別為大黃10 g、黃芪25 g、土茯苓20 g、水牛角絲15 g、丹參12 g、當歸10 g、醋龜甲15 g、地龍9 g、積雪草15 g；尿毒清顆粒(5 g×18袋，由內(nèi)蒙古康臣藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)，國藥準字Z20073256)。

1.3 主要試劑及儀器 血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、24 h尿蛋白定量(UTP)檢測試劑盒，購自南京建成生物；馬松(Masson)染色液，購自北京雷根生物科技有限公司；CHOP、GRP78一抗，分別購自美國affinity公司和美國abcam公司；二抗，購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；BX53顯微鏡，日本奧林巴斯公司；RM2015型切片機，德國Leica公司；7170A全自動生化儀，日本日立公司。

2 方法

2.1 模型制備 按照5/6腎切除法制備CRF大鼠模型[8]。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，將其固定于手術(shù)操作臺上，左側(cè)背部剔毛、備皮、常規(guī)消毒，距左肋脊角1.5 cm處做一縱向皮膚切口(長約3 cm)，逐層分離皮膚、皮下組織、脂肪肌肉等各層進入后腹腔，暴露左側(cè)腎臟，動脈夾結(jié)扎腎蒂，切除以腎皮質(zhì)為主的2/3腎組織，明膠海綿墊壓迫止血，復位腎臟，縫合切口并進行包扎，為預防感染，術(shù)后腹腔注射青霉素。1周后進行第2次手術(shù)，按照上述方法行右腎全切術(shù)。術(shù)后4周，隨機抽取2只假手術(shù)組和2只造模組化驗檢測Scr、BUN、UTP水平，造模組較假手術(shù)組比較血Scr、BUN和UTP含量明顯增加，處死大鼠并留取腎臟標本進行Masson染色觀察腎間質(zhì)纖維化程度，造模組大鼠腎間質(zhì)有明顯的纖維化，提示模型制備成功[6,8]。

2.2 分組及給藥 90只健康的SD雄性大鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分為假手術(shù)組，模型組，大黃泄?jié)岱浇M(低、中、高)，尿毒清顆粒組，每組均15只。假手術(shù)組僅做雙腎被膜剝離術(shù)，其余5組均按照2.1方法制備CRF大鼠模型，模型復制成功后，各給藥組均按照相應劑量灌胃治療。依據(jù)人與大鼠體表面積折算法計算大鼠的臨床等效劑量，大黃泄?jié)岱街袆┝拷o藥量為13.65 g/kg·d-1，中劑量的1/2、2倍分別為低劑量(6.825 g/kg·d-1)、高劑量(27.300 g/kg·d-1)，尿毒清顆粒組給藥量為2.600 g/kg·d-1，以大鼠10 mL/kg的體質(zhì)量標準灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥8周。假手術(shù)組、模型組在同等時間點給予同等劑量的蒸餾水灌胃。

2.3 指標檢測

2.3.1 血Scr、BUN及UTP定量的檢測: 全自動生化分析儀檢測大鼠血清中BUN、Scr水平，尿液分析儀檢測UTP水平。均嚴格按照試劑盒的要求進行。

2.3.2 Masson染色檢測腎臟病理學改變：將固定于4%多聚甲醛中的腎組織取出，進行脫水、透明組織、石蠟包埋，連續(xù)切片(厚度為4 μm)，進行Masson染色，光學顯微鏡下觀察腎臟膠原纖維沉積情況。

2.3.3 免疫組織化學法檢測GRP78、CHOP蛋白的表達情況：取腎組織切片，脫蠟、水化、細胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復，山羊血清封閉，加入稀釋好的一抗，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次后滴加稀釋好的二抗，37 ℃孵育。PBS清洗，DAB染色避光顯色，在顯微鏡下觀察棕褐色染色為蛋白的陽性表達后水洗、復染、脫水、透明和封片。使用image Pro plus 6.0軟件進行結(jié)果分析。

3 結(jié)果

3.1 大黃泄?jié)岱綄RF大鼠血Scr、BUN及UTP水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血Scr、BUN、UTP水平顯著增高(P<0.05)；與模型組相比，各給藥物組大鼠血Scr、BUN、UTP水平均有不同程度下降(P<0.05)，其中大黃泄?jié)岱街小⒏邉┝拷M療效明顯優(yōu)于大黃泄?jié)岱降蛣┝拷M和尿毒清顆粒組(P<0.05)。詳見表1。

表1 大黃泄?jié)岱綄RF大鼠Scr、BUN及24 hUTP水平的影響

3.2 大黃泄?jié)岱綄RF大鼠RIF的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腎組織中可見大量膠原纖維沉積；與模型組相比，大黃泄?jié)岱礁鲃┝拷M和尿毒清顆粒組各腎組織中膠原纖維沉積情況有不同程度改善，其中以大黃泄?jié)岱街小⒏邉┝拷M改善明顯。見圖1。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.低劑量組；D.中劑量組；E.高劑量組；F.尿毒清顆粒組。(圖2、圖3同)

3.3 大黃泄?jié)岱綄RF大鼠腎組織中GRP78、CHOP蛋白表達的影響 GRP78、CHOP在正常腎組織中少量表達，腎小管上皮細胞為陽性主要表達部位；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腎組織中GRP78、CHOP蛋白表達含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，大黃泄?jié)岱礁鲃┝拷M和尿毒清顆粒組大鼠腎組織中GRP78、CHOP蛋白表達含量均有不同程度降低(P<0.05)，其中大黃泄?jié)岱街?、高劑量組大鼠腎小管中GRP78、CHOP蛋白表達量降低程度明顯優(yōu)于大黃泄?jié)岱降蛣┝拷M和尿毒清顆粒組(P<0.05)。詳見表2、圖2、圖3。

圖2 大黃泄?jié)岱綄RF大鼠腎組織中GRP78蛋白表達的影響(免疫組化，×400)

表2 大黃泄?jié)岱綄RF大鼠腎組織中GRP78、CHOP蛋白表達的影響

圖3 大黃泄?jié)岱綄RF大鼠腎組織中CHOP蛋白表達的影響(免疫組化，×400)

4 討論

中醫(yī)學上將CRF歸屬為“水腫”“腰痛”“腎勞”等范疇。導師檀金川教授認為“虛、濁、瘀、毒”是CRF發(fā)生發(fā)展過程中的四大主要病機。虛為病之根本，以脾腎兩虛為主，是RIF形成的根本。脾腎虧虛，水濕不化積聚日久化熱成瘀，濕熱瘀蘊結(jié)，濁毒內(nèi)生，濕熱、瘀血、濁毒錯綜交叉為病之關(guān)鍵，是RIF形成的病理學基礎(chǔ)。治療上應當標本兼顧，健脾益腎培其本，針對標實之邪，更應注重清熱利濕、化瘀通絡(luò)、泄?jié)峤舛镜戎畏?。大黃泄?jié)岱?由大黃、黃芪、土茯苓、水牛角絲、丹參、當歸、醋龜甲、地龍、積雪草組成)是導師檀金川教授根據(jù)CRF患者的臨床癥狀特點，以“脾腎兩虛、濕熱瘀蘊結(jié)”的病機要點為依據(jù)提出的治療CRF的常用中藥復方，取得較好的臨床療效。方中大黃、黃芪為君藥，健脾補腎兼活血化瘀、泄?jié)峤舛?，標本兼顧；土茯苓、積雪草清熱利濕、泄?jié)峤舛?，共為臣藥以助君藥健脾益腎；丹參活血祛瘀、當歸活血且補血，使瘀血得散、活血而不傷正氣；醋龜甲滋陰清熱、水牛角絲清熱涼血；蟲類藥地龍，善行走竄，通腎絡(luò)、清除久積之邪。諸藥合用，切合“脾腎虧虛、濕熱瘀蘊結(jié)”的基本病機，具有健脾益腎、清熱利濕、化瘀通絡(luò)、泄?jié)峤舛局π?，適用于CRF早、中期治療。在本研究中，模型組在造模后出現(xiàn)UTP、血Scr、BUN水平升高，腎臟病理顯示腎組織大量膠原纖維沉積提示模型復制成功；給予大黃泄?jié)岱礁深A后，血Scr、BUN、UTP水平降低，腎臟膠原纖維沉積減少，表明大黃泄?jié)岱骄哂袦p緩RIF、降低尿蛋白和改善腎功能進而緩解CRF進展的作用。

研究表明，CRF疾病過程中存在ERS反應的激活，這可能與尿毒癥毒素的積聚、微炎癥狀態(tài)及脂類代謝紊亂密切相關(guān)[9]。若ERS持續(xù)存在，超過未折疊蛋白反應(UPR)能力，激活下游凋亡相關(guān)基因，會誘導細胞發(fā)生不可逆的凋亡[10]。ERS誘導的細胞凋亡加速了腎臟纖維化進程，抑制ERS表現(xiàn)出顯著的腎臟保護作用[11]。GRP78是一種廣泛存在于真核生物細胞中ER膜上的分子伴侶熱休克蛋白，是UPR跨膜壓力的重要傳感器[12]。通常GRP78是無活性的，然而ERS發(fā)生時，GRP78解離恢復活性優(yōu)先和錯誤折疊的蛋白結(jié)合以促使恢復正常結(jié)構(gòu)，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)穩(wěn)態(tài)[12]。本研究中，模型組大鼠GRP78表達量顯著增高，提示ERS反應被激活，這與既往研究一致[3, 7]。CHOP在多種功能不同蛋白質(zhì)的基因表達方面扮有重要角色，是ERS誘導細胞發(fā)生不可逆性凋亡的關(guān)鍵調(diào)控基因。既往研究顯示，沉默CHOP基因降低其表達可有效降低C57BL/6小鼠尿蛋白水平，腎間質(zhì)炎癥和纖維化也隨之減輕，證實調(diào)控CHOP轉(zhuǎn)錄活性在腎臟損害中發(fā)揮重要作用[13]。本研究中，模型組大鼠GRP78、CHOP表達量均明顯增加，給予大黃泄?jié)岱礁深A后其含量較模型組均明顯減少，表明大黃泄?jié)岱娇赡芡ㄟ^抑制ERS，減少凋亡，發(fā)揮腎臟保護的作用。

綜上所述，大黃泄?jié)岱侥苊黠@降低血Scr、血BUN水平，降低UTP水平，減緩RIF進程，其機制可能與調(diào)控ERS相關(guān)蛋白GRP78、CHOP的表達、抑制ERS的激活有關(guān)，但其他具體的分子機制有待于進一步探討。