張 鵬 張松林 孫來龍

(三峽大學 第一臨床醫(yī)學院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 胸心外科， 湖北 宜昌 443003)

心臟移植已成為某些終末期心力衰竭患者的標準治療方案，而心臟移植物血管病(cardiac allograft vasculopathy，CAV)仍然是制約移植后心臟長期存活的主要因素[1]。據(jù)統(tǒng)計，CAV的發(fā)生率從5年的42%到10年的50%不等，且其發(fā)生率并未隨著免疫抑制劑的應(yīng)用而得到有效控制[2]。CAV主要累及心外膜和心肌內(nèi)動脈，表現(xiàn)為動脈血管的彌漫性圓周樣增厚、內(nèi)膜下平滑肌細胞增殖及單核細胞浸潤，中膜較完整，而外膜可出現(xiàn)炎癥細胞浸潤，有時伴含有B細胞濾泡第三淋巴器官的形成[3]。在免疫抑制劑的基礎(chǔ)上，CAV治療以免疫調(diào)節(jié)為主，如保護內(nèi)皮細胞的完整性和功能性，抑制白細胞的活化和遷移，抵制促炎細胞因子的表達及平滑肌細胞的積聚和增殖等[4]?；ń范痉?xanthotoxol，XT)是一種線型呋喃香豆素，主要來源于傘形科植物蛇床、白芷等，具有抗腫瘤、抗炎、平喘和抗心律失常等多種生物活性與藥理作用[5]，可緩解大鼠腦缺血/再灌注損傷[6]，并具有抑制核因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB) /iNOS通路等作用[7]。

本實驗將利用改進的套管法大鼠胸主動脈腹腔移植模型，誘導大鼠胸主動脈CAV樣病理變化，觀察XT對CAV的血管形態(tài)變化細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎癥因子的表達作用，探討XT對大鼠心臟移植物血管病的作用及其相關(guān)機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級別雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，體質(zhì)量300～330 g，購自三峽大學實驗動物中心[SCXK(鄂) 2017-0012]；SPF級別雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量120～150 g，購自湖北省實驗動物研究中心[SCXK(鄂)2015-0018]。大鼠飼養(yǎng)溫度為(23±2)℃，相對濕度為(55±5)%，自由飲食。實驗操作在三峽大學實驗動物中心屏障實驗室[SYXK(鄂)2017-0061]完成，并遵循實驗動物的“3R”原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 實驗器材與試劑

JJ-12J脫水機(武漢俊杰電子有限公司)，JB-P5包埋機(武漢俊杰電子有限公司)，RM2016病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)，JB-L5凍臺(武漢俊杰電子有限公司)，KD-P組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)，顯微外科器械包(卓越醫(yī)療器械)，XTL-165雙目外科顯微鏡(江西鳳凰光學股份有限公司)，16G靜脈留置針(貝朗醫(yī)療(上海)國際貿(mào)易有限公司)，20G靜脈留置針(江西豐臨醫(yī)用器械有限公司)，8-0、9-0顯微帶線縫合針(寧波醫(yī)用縫針有限公司)，3-0真絲非吸收縫線(揚州市金環(huán)醫(yī)療器械廠)，肝素鈉(北京亞米生物科技有限公司)，戊巴比妥鈉(上?；瘜W試劑公司)，XT(HPLC≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司)，二甲基亞砜DMSO(津北恒興試劑)，4%多聚甲醛固定液，蘇木素-伊紅染液(武漢谷歌生物科技)，一抗：ICAM-1(稀釋比為1∶200)，TNF-α(稀釋比為1∶800)，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)(稀釋比為1∶500)，α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)(稀釋比為1∶500)，增殖細胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)(稀釋比為1∶100)，NF-κB/P65(稀釋比為1∶500)(武漢三鷹)，二抗：HRP標記的山羊抗兔鼠通用，免疫組化試劑盒DAB顯色劑(DAKO)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立及分組

采用隨機數(shù)表法將大鼠隨機分為模型組和藥物組，其中模型組和藥物組再分為空白對照組(不做任何處理)、7天組、28天組和56天組(n=5)。以Wistar大鼠胸主動脈為供體，SD大鼠為受體(Wistar→SD)，造模前禁食12 h，自由飲水，腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，取出修剪好的供體動脈后，肝素鈉生理鹽水反復沖洗管腔，將動脈穿過切取的長約4 mm的靜脈留置針管，翻轉(zhuǎn)血管后，8-0顯微線對稱吻合固定，一端打結(jié)固定，完成套管的制作，置于4℃生理鹽水備用；同樣方法將受體大鼠麻醉后，打開腹腔，分離腎動脈平面下方腹主動脈約1.5 cm，動脈夾阻斷血流后，用顯微剪剪開動脈前壁約1/3周徑血管，將制備的套管置于0.5 mm半針管筆尖上，平行插向遠心端，9-0顯微線縫合剪口，觀察遠端血管是否充盈通暢，術(shù)后48 h大鼠四肢能自由活動，大小便正常視為手術(shù)成功。

1.2.2 給藥

藥物組大鼠在關(guān)腹前給予XT 10 mg/kg(DMSO溶解終濃度為25%)腹腔注射，關(guān)腹后置于保溫墊上，待蘇醒后轉(zhuǎn)動物房，此后每天同樣劑量改灌胃給藥，模型組大鼠術(shù)后每天以同等劑量的生理鹽水灌胃，直到各觀察時間點。

1.2.3 HE染色和動脈內(nèi)膜厚度測量

在術(shù)后7天、28天和56天，麻醉處死大鼠后，分離切取移植的套管動脈，肝素鈉生理鹽水反復沖洗，置于4%的多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、4 μm切片和HE染色，顯微鏡下取血管橫截面3、6、9、12點鐘的不同視野，計算機攝像系統(tǒng)進行拍照，Image-pro plus 6.0圖像分析軟件進行分析。模型組因無藥物干預，個別樣本在觀察點出現(xiàn)管腔堵塞，應(yīng)給予排除，以免影響數(shù)據(jù)分析，因此統(tǒng)一從樣本中隨機選取6張圖片進行分析。模型組56天，由于管壁結(jié)構(gòu)消失，我們以內(nèi)膜邊緣到再通血管紅細胞滲出處代表內(nèi)膜增生厚度(n=6)。

1.2.4 免疫組織化學染色(SP法)

同樣在各觀察時間點，取得移植動脈后，步驟同HE染色，切片常規(guī)脫蠟，檸檬酸緩沖液(pH 6.0)對組織切片進行抗原修復，3%過氧化氫溶液(雙氧水∶純水=1∶9)滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加3%BSA封閉液，室溫封閉30 min，逐一滴加一抗、二抗，再用PBS洗2 min，共3次，滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡鏡檢，陽性表達區(qū)顯示棕黃色，細胞核顯示藍色。Image-pro plus 6.0軟件分析圖像，測量各組積分光密度值(integrated optical density，IOD)(n=6)，計算其平均積分光密度值(average integral optical density，AIOD)=IOD/面積(Area)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色和內(nèi)膜厚度變化

正常大鼠胸主動脈如圖1A和1E所示，可見內(nèi)膜的單層內(nèi)皮細胞，中膜為大量排列整齊的平滑肌細胞，外膜為疏松結(jié)締組織，動脈結(jié)構(gòu)完整。模型組在7天和28天，內(nèi)膜和中膜出現(xiàn)大量單核巨噬細胞堆積，管腔側(cè)有血栓機化形成(圖1B和1C)；在56天炎癥細胞侵蝕動脈管壁，中膜彈性纖維斷裂，管壁機化(圖1D)，管腔狹窄或閉塞。藥物組在7天，中膜出現(xiàn)大量單核巨噬細胞的聚集，內(nèi)皮細胞受損(圖1F)；28天中膜彈性纖維部分斷裂，內(nèi)膜有大量單核細胞和少量平滑肌細胞的堆積，管腔側(cè)可見連接緊密的單層內(nèi)皮細胞(圖1G)；56天動脈中膜彈性纖維比較完整，內(nèi)膜可見大量梭形核狀平滑肌細胞及完整的內(nèi)皮細胞(圖1H)。我們同時測量了各組動脈內(nèi)膜厚度，如表1所示，與空白對照相比，模型組56天內(nèi)膜厚度達到最大值；與同期模型組相比，藥物組在7天與56天動脈內(nèi)膜增厚程度明顯減輕(P<0.05)。

注：A、E：空白對照； B～ D：分別為模型組7天、28天和56天血管形態(tài)； F～H：分別為藥物組7天、28天和56天血管形態(tài)圖1 各時間點供體動脈HE染色

2.2 移植動脈免疫組織化學染色ICAM-1、TNF-α、PCNA、α-SMA、TGF-β1和NF-κB/P65的表達情況

各時間點ICAM-1的平均光密度值如圖2A所示，與同期模型組相比，藥物組ICAM-1在28天和56天時表達均明顯降低(均P<0.05)。TNF-α在模型組7天、28天和56天都持續(xù)高表達，而藥物組TNF-α的表達量均低于同期模型組(均P<0.05)，見圖2B。模型組α-SMA的含量逐漸減少，與同期模型組相比，藥物組在28天和56天時α-SMA的表達均明顯增加(均P<0.05)，見圖2C。TGF-β1的表達量如圖2D所示，與模型組相比，藥物組7天和28天時TGF-β1表達量明顯減少(均P<0.05)，而56天時兩組差別不明顯(P>0.05)。NF-κB/P65的各期表達量如圖2E所示，與模型組相比，藥物組28天和56天時NF-κB/P65的表達量均明顯降低(均P<0.05)。模型組PCNA的平均光密度值持續(xù)增加，與同期模型組相比，藥物組PCNA表達量無減少(圖2F)，其中模型組56天時PCNA陽性表達區(qū)主要分布于機化管壁的炎癥細胞和平滑肌細胞中，藥物組56天時主要分布于新生內(nèi)膜平滑肌細胞中(圖3)。

注：A：各組ICAM-1的平均光密度值； B： TNF-α的平均光密度值； C： α-SMA的平均光密度值； D：TGF-β1的平均光密度值； E：NF-κB/P65的平均光密度值； F：PCNA的平均光密度值。與同期模型組相比，*P<0.05圖2 各組免疫組織化學染色平均光密值

注：A：空白對照； B：模型組56天； C：藥物組56天圖3 各組56天時PCNA免疫組織化學染色

3 討論

CAV是心臟移植術(shù)后的晚期并發(fā)癥，表現(xiàn)為心臟脈管系統(tǒng)的進行性閉塞，最終導致移植物功能喪失[8]。Huibers等[9]通過尸檢發(fā)現(xiàn)了三種不同形態(tài)的CAV：①內(nèi)膜單核炎癥細胞的浸潤；②單核細胞浸潤伴平滑肌細胞增殖；③致密結(jié)締組織沒有明顯炎癥細胞的浸潤。而其變化程度與心臟移植后時間、受者年齡、動脈粥樣硬化疾病和感染發(fā)生密切相關(guān)[9]，在CAV嚴重病變中微脈管系統(tǒng)床密度減少、血管重塑、心肌間質(zhì)纖維化可導致微循環(huán)結(jié)構(gòu)的喪失和功能減退，最終引起心臟舒張功能障礙[10]。

人體分配血管動脈中膜富含血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMCs)和彈性纖維，其內(nèi)膜是由單層內(nèi)皮細胞及內(nèi)皮下的結(jié)締組織和內(nèi)彈性膜構(gòu)成，主要功能是將血液運輸至各器官組織[11]。正常Wistar大鼠降主動脈中膜含有大量VSMCs和彈性纖維，與完整的內(nèi)皮細胞和外膜疏松結(jié)締組織共同構(gòu)成了動脈的完整結(jié)構(gòu)，可以很好地模擬人冠狀動脈。我們通過大鼠胸主動脈的同種異體移植，建立了大鼠同種異體移植物血管的慢性排斥反應(yīng)模型。與空白對照組相比，模型組各時間點動脈管壁逐漸被炎癥細胞浸潤，彈性纖維部分斷裂，內(nèi)膜VSMCs分化活躍，結(jié)構(gòu)疏松，內(nèi)膜增厚。與模型組相比，XT藥物組28天時動脈中膜彈性纖維較完整，炎癥細胞減少，內(nèi)皮細胞較完整，56天時中膜彈性纖維較完整，炎癥細胞明顯減少，內(nèi)皮下可見大量梭形核狀的平滑肌樣細胞及少量膠原沉積，管腔尚且通暢。以上表明XT可抑制移植物中炎癥細胞的浸潤，改善移植動脈管壁結(jié)構(gòu)，部分緩解VSMCs在內(nèi)膜下的積聚，減輕移植動脈管腔阻塞程度，從而延緩CAV的發(fā)展。

ICAM-1在CAV發(fā)展的初始階段起著重要的促進作用。在心肌缺血/再灌注損傷研究中，ICAM-1基因敲除小鼠的心肌壞死風險區(qū)域明顯降低，單克隆抗體ICAM-1可明顯減少缺血/再灌注心肌組織中多形核粒細胞的浸潤[12-13]。本實驗中，模型組ICAM-1表達范圍和強度在56天時達到最大；與同期模型組相比，藥物組28天與56天時ICAM-1平均光密度值明顯減少。以上表明，XT可抑制ICAM-1的表達，減少單核細胞粘附和跨內(nèi)皮細胞遷移，減輕CAV進展中的炎癥反應(yīng)。

TGF-β1在CAV新生內(nèi)膜平滑肌細胞增殖中有促纖維化作用。人心臟移植標本中，TGF-β1在冠狀動脈管壁的表達量與α-SMA的表達和內(nèi)膜VSMCs的面積呈正相關(guān)，而與心臟移植物存活時間呈一定的負相關(guān)，TGF-β1在CAV冠脈管壁中表達量明顯增加，并能促進VSMCs增殖與分化[14]。心臟移植物脈管系統(tǒng)中，纖維化過程主要表現(xiàn)為冠狀動脈內(nèi)膜和外膜膠原的過量沉積。內(nèi)皮細胞功能損傷將誘導炎癥細胞向管壁中膜遷移，釋放的TGF-β進一步促進VSMCs增殖、遷移和膠原產(chǎn)生，從而導致新生內(nèi)膜組織纖維化[15]。PCNA存在于細胞核內(nèi), 是DNA聚合酶δ的輔助作用蛋白，其量的變化與DNA合成一致，可作為評價平滑肌細胞增殖狀態(tài)的指標[16]。在我們的大鼠模型實驗中，PCNA免疫組化顯示：隨移植時間的增加，模型組中PCNA的表達范圍和強度不斷增加；與模型組相比，XT藥物組PCNA的表達強度和范圍也呈增加趨勢，主要分布于內(nèi)皮及內(nèi)皮下分化的平滑肌細胞中。同期模型組和藥物組相比，PCNA平均光密度值差異無統(tǒng)計學意義。我們推測模型組血管重塑是以細胞凋亡、增生為主，而藥物組血管是以平滑肌樣細胞分化、增殖和遷移為主。

α-SMA是構(gòu)成血管平滑肌細胞收縮裝置的細胞結(jié)構(gòu)蛋白，在分化成熟的VSMCs中高表達，當VSMCs出現(xiàn)凋亡、纖維化或由“收縮型”轉(zhuǎn)換為“合成型”時α-SMA表達量將減少[17-19]。與空白對照相比，模型組各時間點α-SMA的表達強度和范圍逐漸減少，藥物組在移植后的28天和56天，其α-SMA平均光密度值比同期模型組要高；模型組和藥物組中TGF-β1表達范圍和強度不斷增加，以56天最為顯著，而藥物組7天和28天 TGF-β1平均光密度值較同期模型組明顯降低。以上結(jié)果表明，藥物組保留了部分平滑肌細胞α-SMA的表達，并降低了早期移植物血管中TGF-β1的表達；模型組內(nèi)膜增厚可能由于供體源循環(huán)細胞的沉積，以細胞凋亡和去分化為“合成型”平滑肌樣細胞為主，而藥物組移植物血管新生內(nèi)膜的形成可能由于受體源血管中膜平滑肌細胞增殖、遷移所致，PCNA表達增高和α-SMA表達降低提示兩組增殖的“平滑肌樣細胞”存在表型差異。

NF-κB信號通路可調(diào)控促炎細胞因子的產(chǎn)生、白細胞的招募與存活，在急/慢性炎癥反應(yīng)中具有重要作用。內(nèi)皮細胞受損、缺血/再灌注損傷、固有免疫反應(yīng)、平滑肌細胞增殖和遷移以及冠狀動脈粥樣硬化形成過程都能激活NF-κB信號通路，且與CAV的形成與發(fā)展密切相關(guān)[20-22]。在我們的試驗中，藥物組與同期模型組相比，TNF-α表達范圍和強度明顯減小，NF-κB/p65在28天和56天時表達量明顯降低。以上表明，XT對TNF-α表達有明顯抑制作用，并能部分抑制NF-κB p65信號通路的活化。

綜上所述，XT能明顯降低大鼠同種異體移植物血管病中ICAM-1、TNF-α和TGF-β1的表達量，保留新生內(nèi)膜平滑肌細胞的收縮表型，改善血管形態(tài)從而有效緩解CAV的進展，這可能與部分抑制NF-κB的活化相關(guān)，其具體機制仍需進一步探索。