黃亞東，張 翔，陶書中，陳正東

(1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223005；2.江蘇省食品微生物工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 223005；3.江蘇畢豪食品有限公司，江蘇 漣水 223400)

硒是一種重要的微量元素。天然食品中的硒含量普遍較低，不能滿足人體對硒的需求。因此，開發(fā)富硒食品的前景十分廣闊。醬油作為家庭必備的調(diào)味品之一，是人們攝入有益活性物質(zhì)的重要途徑。黑豆因其活性物質(zhì)含量高于黃豆，逐漸成為醬油改良的主要原料。本研究結(jié)合醬油生產(chǎn)工藝探索符合生產(chǎn)實(shí)際的微生物富硒條件，以優(yōu)化黑豆醬油富硒技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

米曲霉(滬釀3.042)：江蘇畢豪食品有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

察氏培養(yǎng)基：NaNO33 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蔗糖30 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂20 g，pH自然，純水定容至1000 mL，121 ℃滅菌30 min。

加硒豆芽汁培養(yǎng)基：將黃豆芽30 g于500 mL純水中蒸煮過濾，加入可溶性淀粉20 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、(NH4)2SO40.5 g，pH值6.8左右，添加亞硒酸鈉至所需濃度，加水定容至1000 mL，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑

NaNO3、K2HPO4、KCl、MgSO4·7H2O、蔗糖、FeSO4·7H2O、HCl、瓊脂：均為分析純；環(huán)己烷(C6H12)：色譜純；2,3-二氨基萘(DAN)；乙二胺四乙酸二鈉。

1.2 方法

1.2.1 富硒米曲霉菌種復(fù)壯

將冷凍保藏的菌種接入察氏培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)3 d，獲得長勢良好的米曲霉菌體。傳代培養(yǎng)三次，使其活性最高，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 米曲霉菌種液制備

從培養(yǎng)基上刮取一環(huán)孢子，接種到豆芽汁培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)(180 r/min、37 ℃)48 h，裝液量100 mL/250 mL。

1.2.3 米曲霉培養(yǎng)條件

接種量10%，恒溫?fù)u床培養(yǎng)(180 r/min、37 ℃)，裝液量100 mL/250 mL。

1.2.4 生物量測定

取米曲霉培養(yǎng)液，紗布過濾，蒸餾水洗滌3次，離心5 min，烘干稱重，以菌體干重作為米曲霉的生物量。

1.2.5 硒含量測定

參照GB 5009.93—2017，采用熒光分光光度法測定硒含量。

1.2.6 米曲霉生長曲線

設(shè)置4組實(shí)驗(yàn)，亞硒酸鈉濃度分別為0、50、75、100 mg/L，按1.2.3條件培養(yǎng)，每12 h取樣測定生物量。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組，結(jié)果取均值。

1.2.7 硒含量曲線的測定

設(shè)置4組實(shí)驗(yàn)，亞硒酸鈉濃度分別為0、50、75、100 mg/L，按1.2.3條件培養(yǎng)，每12 h取樣測定米曲霉細(xì)胞中的硒總量。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組，結(jié)果取均值。

1.2.8 蛋白酶活性測定

參照GB/T 23527—2009，采用福林酚法測定蛋白酶活性。

1.3 醬油生產(chǎn)

以富硒實(shí)驗(yàn)得到的米曲霉為菌種，采用高鹽稀態(tài)工藝生產(chǎn)醬油。醬油釀造工藝流程見圖1。

圖1 高鹽稀態(tài)醬油釀造工藝流程

2 結(jié)果與討論

2.1 亞硒酸鈉濃度對米曲霉生物量的影響

硒是重金屬離子，在培養(yǎng)基中添加亞硒酸鈉會對米曲霉產(chǎn)生抑制作用，而菌體數(shù)量對醬油生產(chǎn)至關(guān)重要。米曲霉生長曲線見圖2。

圖2 米曲霉生長曲線

由圖2可知，亞硒酸鈉濃度高(100 μg/L)時(shí)生物量最大、濃度低(50 μg/L)時(shí)生物量最小，可能是由于在一定濃度范圍內(nèi)，硒作為生物體的必需元素會促進(jìn)菌體的生長。

2.2 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線

在酸性條件下，Se 4+與2,3-二氨基萘(DAN)反應(yīng)生成4,5-苯并苤硒腦，用環(huán)己烷萃取后，在波長為376 nm的激發(fā)光作用下，發(fā)射波長為520 nm的熒光，測定其熒光強(qiáng)度。硒標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 亞硒酸鈉濃度對米曲霉富硒量的影響

最佳的亞硒酸鈉濃度不僅可以優(yōu)化醬油富硒效果、提高產(chǎn)品質(zhì)量，還可以避免富硒培養(yǎng)時(shí)間過長而導(dǎo)致的菌體老化。菌體硒含量變化見圖4。

圖4 菌體硒含量變化

2.4 亞硒酸鈉濃度對米曲霉蛋白酶活性的影響

在醬油生產(chǎn)過程中，米曲霉的主要作用是分泌產(chǎn)生中性蛋白酶，將培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)水解成氨基酸。蛋白酶活力變化見圖5。

圖5 蛋白酶活力變化

2.5 醬油感官指標(biāo)

以不同濃度亞硒酸鈉富硒培養(yǎng)釀造的醬油感官指標(biāo)略有不同。醬油感官指標(biāo)分析見表1。

表1 醬油感官指標(biāo)分析

2.6 醬油理化指標(biāo)

亞硒酸鈉濃度為50 μg/L時(shí)，氨基酸態(tài)氮和全氮含量最高；濃度為75 μg/L時(shí)，氨基酸態(tài)氮和全氮含量與空白組相近；濃度為100 μg/L時(shí)，三項(xiàng)指標(biāo)均最低。醬油理化指標(biāo)分析見表2。

表2 醬油理化指標(biāo)分析

2.7 醬油中硒元素含量

富硒培養(yǎng)米曲霉可以顯著提高醬油中硒含量。醬油中硒元素含量變化見表3。

表3 醬油中硒元素含量變化

3 結(jié)論

通過添加不同濃度的亞硒酸鈉富硒培養(yǎng)米曲霉，再以米曲霉為菌種，運(yùn)用高鹽稀態(tài)釀造工藝生產(chǎn)黑豆醬油。根據(jù)所釀造醬油的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)及富硒結(jié)果，分析得出黑豆醬油最優(yōu)富硒工藝，即以75 μg/L的亞硒酸鈉富硒培養(yǎng)米曲霉、以高鹽稀態(tài)釀造工藝生產(chǎn)醬油。