瑪依拉·艾尼瓦爾，湯新樂，張裕祥

新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院檢驗科，新疆烏魯木齊 830002

人乳頭瘤病毒(HPV)的主要傳播方式為性傳播，多數(shù)女性在感染HPV后可自行清除，仍有部分患者無法完全清除，而當(dāng)高危型HPV在機體長期處于高載量時，將會導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)或?qū)m頸癌[1]。流行病學(xué)資料顯示，2012年全球范圍內(nèi)約有52.76 萬例新發(fā)宮頸癌患者及26.57萬因?qū)m頸癌死亡患者，且隨著社會的發(fā)展，宮頸癌呈年輕化、高發(fā)病率的趨勢[2-4]。近年來，手術(shù)、化療、放療等的綜合治療已成為早期宮頸癌的主要治療方式，宮頸癌患者5年生存率可達90%,但對于晚期及復(fù)發(fā)性宮頸癌患者5年生存率仍不足20%和5%[5]。因此，探討一種可用于指示宮頸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)歸的特異性指標(biāo)具有十分重要的意義。microRNA(miRNA)是一類長度為19～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后負性調(diào)控靶基因的表達，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲中具有一定的調(diào)控作用[6-7]。有研究表明，miR-18a及miR-92a在多種實體瘤中呈過表達，提示其可作為新型腫瘤標(biāo)志物用于腫瘤診斷及預(yù)后評價[8-10]。宮頸癌作為實體瘤之一，是否這一類患者也存在血清miR-18a、miR-92a過表達，二者對HPV陽性宮頸癌診斷及評估預(yù)后的臨床價值如何是筆者關(guān)注的重點之一。基于此，本研究擬分析HPV陽性宮頸癌患者血清miR-18a及miR-92a的表達，以及二者與預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床上診治HPV陽性宮頸癌患者提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年3月至2019年3月本院收治的79例HPV陽性宮頸癌患者為觀察組，79例HPV陽性宮頸上皮內(nèi)瘤變患者為對照組。觀察組納入標(biāo)準：(1)經(jīng)病理檢查診斷為宮頸癌；(2)HPV檢測為陽性，分型為HPV16型或18型；(3)未接受放射治療、化療及生物免疫治療；(4)不存在其他惡性腫瘤或其他感染性疾病。對照組納入標(biāo)準：(1)HPV檢測為陽性，分型為HPV16型或18型；(2)經(jīng)病理檢查診斷為宮頸上皮內(nèi)瘤變；(3)近3個月內(nèi)未接受過抗菌藥物治療；(4)近1周內(nèi)無性生活史。兩組排除標(biāo)準：(1)合并免疫、內(nèi)分泌等其他系統(tǒng)嚴重疾?。?2)處于經(jīng)期或陰道不規(guī)則出血；(3)妊娠期或哺乳期女性；(4)依從性差，不能配合完成本研究；(5)既往有子宮手術(shù)史；(6)合并陰道炎或其他炎癥性疾??；(7)近1年內(nèi)接受過放療、化療及生物免疫治療。所有納入研究對象及其家屬對本研究知情且同意，并簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2檢測方法 所有研究對象于入組次日清晨空腹抽取靜脈血5 mL。血液標(biāo)本以3 000 r/min離心15 min，分離血清后提取總mRNA，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法(Takara PCR試劑盒，日本Takara公司)檢測各組miR-18a及miR-92a水平。引物設(shè)計及合成均由北京鼎國生物科技有限公司提供，引物序列見表1。miR-18a及miR-92a下游通用引物來自Mir-XTM miRNA First Strand反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，根據(jù)SYBR RT-PCR試劑盒(日本Takara公司)說明書進行RT-PCR。反應(yīng)體系：95 ℃ 預(yù)變性 30 s，95 ℃ 變性5 s，60 ℃ 退火30 s，循環(huán)35 次。采用2-ΔΔCt法檢測各組miR-18a 和 U6基因相對表達量，內(nèi)參為U6，每份標(biāo)本重復(fù)檢測3次，取平均值。

表1 引物序列

1.3觀察指標(biāo) 收集兩組研究對象基線資料，并比較兩組miR-18a及miR-92a水平。采用受試者工作特征(ROC)曲線分析血清miR-18a及miR-92a在診斷HPV陽性宮頸癌中的效能。比較不同年齡、病理類型、分化程度、腫瘤最大徑、血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期情況宮頸癌患者血清miR-18a及miR-92a水平。隨訪1年，觀察組根據(jù)存活情況分為存活組和死亡組，比較兩組miR-18a及miR-92a水平。分析miR-18a及miR-92a評估患者預(yù)后的效能。

2 結(jié) 果

2.1觀察組與對照組基線資料比較 觀察組與對照組年齡、產(chǎn)次等基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 觀察組與對照組基線資料比較

2.2觀察組與對照組血清miR-18a及miR-92a水平比較 與對照組比較，觀察組血清miR-18a及miR-92a水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 觀察組與對照組血清miR-18a及miR-92a水平比較

2.3不同特征HPV陽性宮頸癌患者血清miR-18a及miR-92a水平比較 HPV陽性宮頸癌患者中，與臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤陰性的患者比較，臨床分期Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤陽性的患者miR-18a及miR-92a水平更高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同特征HPV陽性宮頸癌患者血清miR-18a及miR-92a水平比較

2.4miR-18a及miR-92a水平對HPV陽性宮頸癌的診斷效能 當(dāng)miR-18a截斷值為3.161時，診斷HPV陽性宮頸癌的AUC為0.849(P<0.05)；當(dāng)miR-92a截斷值為1.665時，診斷HPV陽性宮頸癌的AUC為0.827(P<0.05)。見表5、圖1。

表5 miR-18a及miR-92a水平對HPV陽性宮頸癌的診斷效能

圖1 miR-18a及miR-92a水平診斷HPV陽性宮頸癌的ROC 曲線

2.5存活組與死亡組血清miR-18a及miR-92a水平比較 與存活組比較，死亡組miR-18a及miR-92a水平更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 存活組與死亡組血清miR-18a及miR-92a水平比較

2.6miR-18a及miR-92a水平評估HPV陽性宮頸癌預(yù)后的效能 當(dāng)miR-18a截斷值為5.334時，評估HPV陽性宮頸癌預(yù)后的AUC為0.766(P<0.05)；當(dāng)miR-92a截斷值為2.361時，評估HPV陽性宮頸癌預(yù)后的AUC為0.790(P<0.05)。見表7、圖2。

表7 miR-18a及miR-92a水平評估HPV陽性宮頸癌預(yù)后的效能

圖2 miR-18a及miR-92a水平評估HPV陽性宮頸癌預(yù)后的ROC曲線

3 討 論

宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與HPV感染、核苷酸多態(tài)性變化、染色體突變等因素密切相關(guān)[11-13]。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對宮頸癌的分子生物學(xué)機制也有了深入研究。miRNA作為基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因素，其參與多個信號通路的調(diào)控。已有研究證實，miRNA與多種腫瘤細胞的增殖、分化、遷移等生物學(xué)行為密切相關(guān)，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[14-15]。在一項多因素分析研究中，HPV感染，以及miR-18a、miR-92a水平的上升均為宮頸癌發(fā)生的獨立危險因素[16]。但根據(jù)現(xiàn)有臨床經(jīng)驗，HPV一過性感染比例較高，因此，通過HPV感染診斷宮頸癌的特異度較低。而miRNA以穩(wěn)定、豐富的形式存在于血液中，因此，以血清為生物學(xué)標(biāo)本，無創(chuàng)、操作簡便，更易提高患者的依從性。

miR-18a屬于miR-17-92基因簇成員，有研究表明，miR-18a可作為抑癌基因，通過調(diào)控其下游的靶基因進而抑制腫瘤細胞體外增殖，并誘導(dǎo)G1期阻滯，促進腫瘤細胞的凋亡[17-18]。但有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤等多種腫瘤中，miR-18a的表達有所上升[19]。因此，miR-18在HPV陽性宮頸癌患者中是否表達異常是筆者探討的重點之一。miR-92a作為miRNA家族成員之一，其參與多種腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展，并與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，相較于HPV陽性宮頸上皮內(nèi)瘤變患者，HPV陽性宮頸癌患者血清miR-18a及miR-92水平均明顯上升，這與既往研究結(jié)果一致，說明miR-18a及miR-92水平異常與HPV陽性宮頸癌發(fā)生關(guān)系密切。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，相較于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期患者、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤陰性的患者，臨床分期為Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤陽性的患者miR-18a及miR-92a水平更高，這也說明血清miR-18a及miR-92a水平在一定程度上可反映宮頸癌惡性程度。本研究進一步通過ROC曲線分析了miR-18a及miR-92a水平在診斷HPV陽性宮頸癌患者中的臨床價值，結(jié)果顯示，當(dāng)miR-18a截斷值為3.161時，診斷HPV陽性宮頸癌的AUC為0.849(P<0.05)；當(dāng)miR-92a截斷值為1.665時，診斷HPV陽性宮頸癌的AUC為0.827(P<0.05)，說明miR-18a及miR-92a在診斷HPV陽性宮頸癌中均具有一定臨床價值，血清miR-18a及miR-92a檢測有望成為HPV陽性宮頸癌篩查的生物學(xué)標(biāo)志物。目前，宮頸癌的發(fā)病率及病死率仍居高不下，且患者的預(yù)后較差，因此，探討其預(yù)后指標(biāo)對于臨床上評估患者治療措施的效果具有重要的臨床意義。隨訪1年結(jié)果顯示在HPV陽性宮頸癌患者中，死亡組血清miR-18a及miR-92a均明顯高于存活組。ROC曲線結(jié)果顯示：當(dāng)miR-18a截斷值為5.334時，評估HPV陽性宮頸癌預(yù)后的AUC為0.766(P<0.05)；當(dāng)miR-92a截斷值為2.361時，評估HPV陽性宮頸癌預(yù)后的AUC為0.790(P<0.05)。提示血清miR-18a及miR-92a可作為評估HPV陽性宮頸癌患者預(yù)后的輔助指標(biāo)。

綜上所述，HPV陽性宮頸癌患者血清miR-18a及miR-92a水平明顯上升，并在HPV陽性宮頸癌的診斷及預(yù)后評估中具有一定臨床價值。