潘麗琴，郝建，徐建民，粟宏林，梁福江，張青青，姜清彬＊

(1.西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650204；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，廣西 憑祥 532600；3.中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520)

木蘭科（Magnoliaceae）自從有自然分類以來，一直被認(rèn)為是被子植物中最原始的類群，對(duì)研究有花植物的起源和系統(tǒng)發(fā)育有重要價(jià)值[1]。木蘭科全世界有15 屬260 余種植物，是熱帶亞熱帶地區(qū)常綠闊葉林的重要組成樹種，因各樹種存在較多的性狀交叉和形態(tài)變異，目前，在屬的界限和種的確定上仍有較大的爭(zhēng)議[2-3]。灰木蓮（Manglietia coniferaDandy），原產(chǎn)越南及印度尼西亞[4]，因其樹形優(yōu)美、花大清香、干形通直、生長(zhǎng)快、木材紋理細(xì)致易加工，我國于1960 年從越南中北部引入，因其適生性強(qiáng)、生長(zhǎng)快且材性優(yōu)良而在我國推廣[5]。目前主要在我國華南、福建及云南等地大規(guī)模種植，是一種優(yōu)良的速生用材樹種，在建筑、家具、膠合板及紙漿生產(chǎn)中具有廣闊的市場(chǎng)前景[6]。

灰木蓮在我國引種地的花期為每年1月下旬至4月下旬，開花時(shí)滿樹繁花，但自然結(jié)實(shí)率幾乎為零，即使偶有結(jié)實(shí)，其聚合蓇葖果的絕大部分子房敗育，每果僅見十余粒甚至幾粒種子[7-8]。灰木蓮在我國結(jié)實(shí)率極低的問題，嚴(yán)重制約其大規(guī)模發(fā)展。目前，有關(guān)灰木蓮的研究主要集中于栽培繁育[5-6,9-11]、早期生長(zhǎng)適應(yīng)性[12]、材性[13]及生態(tài)效應(yīng)[14-15]等方面，而對(duì)其有性生殖及種實(shí)敗育機(jī)制了解甚少，為探明灰木蓮引種條件下的種實(shí)敗育原因，擬采用石蠟切片和掃描電鏡技術(shù)，對(duì)灰木蓮花藥結(jié)構(gòu)及其小孢子發(fā)育過程進(jìn)行解剖觀察，以確定是否存在雄性不育的異常現(xiàn)象。同時(shí)，與木蘭科其他近緣種的胚胎學(xué)發(fā)育資料進(jìn)行比較，為進(jìn)一步確立灰木蓮的分類學(xué)地位和木蘭科系統(tǒng)發(fā)育的研究積累資料和提供佐證。

1 材料

本研究試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)在中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心（以下簡(jiǎn)稱中國林科院熱林中心），位于廣西壯族自治區(qū)憑祥市，屬南亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年均氣溫21.5℃，≥ 10℃積溫7 500℃，年降水量1 220～1 400 mm，降水集中期為4月中旬至8月末，年均日照約1 260 h。選取中國林科院熱林中心的伏波實(shí)驗(yàn)場(chǎng)（FB）、白云實(shí)驗(yàn)場(chǎng)（BY）和中心樹木園（ZX）栽培的灰木蓮人工林為研究對(duì)象，各林分造林苗均為1.5 年生的實(shí)生苗，種源來自越南尚河，無病蟲侵害，健康狀況良好，均有零星結(jié)實(shí)，基本情況見表1。

表1 觀測(cè)林分基本情況Table 1 General information of the observation stands

2 方法

材料采集自中國林科院熱林中心灰木蓮試驗(yàn)林，選擇8～12 年生的優(yōu)良單株。2018 年10月至2020 年10月連續(xù)2 a，每隔3～6 d，采集不同發(fā)育時(shí)期花芽，體視顯微鏡解剖觀測(cè)花藥形態(tài)、結(jié)構(gòu)及數(shù)量特征；剝離出花藥保存于FAA 固定液（V70%乙醇:V 甲醛:V 冰乙酸=18:1:1）抽真空固定，50%乙醇潤(rùn)洗，經(jīng)乙醇梯度脫水，浸蠟包埋后，旋轉(zhuǎn)切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度6～8 μm，中性樹膠封片，OLYMPUS 光學(xué)顯微鏡和OLYMPUS PM-10AD 成像系統(tǒng)觀察拍照。

取新鮮花藥，輕輕劃破花藥表皮，解剖針挑出花粉，將花藥和花粉粘貼于雙面導(dǎo)電膠布上，置于金屬樣品臺(tái)進(jìn)行噴金，在掃描電鏡下觀察并拍照[16]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 雄蕊群數(shù)量結(jié)構(gòu)及形態(tài)特征

灰木蓮雄蕊群具花藥平均98 枚(n=30，sd=21)，花藥長(zhǎng)平均7.4 mm (n=30，sd=1.2)，花藥寬平均2.1 mm(n=30，sd=0.2)。雄蕊群的花藥獨(dú)立分離、輻射螺旋狀排列于花軸的基部（圖1-1），花粉囊呈絲管狀平行排列于花藥內(nèi)側(cè)或側(cè)向面的兩邊，無花絲，尖端伸出約1～1.5 mm 的藥隔（圖1-3）。成熟花藥具4～6 個(gè)花粉囊，多數(shù)為4 個(gè)花粉囊，偶見6 個(gè)花粉囊（圖1-2）。

圖1 花藥結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of anthers

具有活力的花粉粒兩側(cè)對(duì)稱，異極，極面觀為橢圓形或長(zhǎng)圓形，赤道面觀為舟形，具遠(yuǎn)極單溝，溝直達(dá)端部，閉合或不閉合，極軸約25.5 μm，赤道軸約62.3 μm，花粉壁光滑，極軸面具稀疏穴狀紋飾（圖1-4～5），失活花粉?？s為球形，花粉壁皺縮（圖1-6）。

3.2 花藥壁的發(fā)育

灰木蓮雄蕊原基約12月下旬至1月初開始分化，內(nèi)側(cè)花粉囊較外側(cè)的分化發(fā)育早（圖2-1）。最初的花藥原基只有一層外表皮細(xì)胞和表皮內(nèi)部分生組織，1月中旬，隨著內(nèi)部分生組織細(xì)胞的分化，在花藥四個(gè)角隅處分化出孢原細(xì)胞（圖2-2）；孢原細(xì)胞經(jīng)平周分裂形成初生壁細(xì)胞和內(nèi)層初生造孢細(xì)胞（圖2-3），初生壁細(xì)胞分裂后形成3～4 層花藥壁細(xì)胞（圖2-4）；當(dāng)小孢子母細(xì)胞形成時(shí)，花藥壁發(fā)育完成，此時(shí)的花藥壁自內(nèi)向外分別為絨氈層1～2 層、中層1 層、藥室內(nèi)壁2 層、表皮細(xì)胞1 層（圖2-5）；2月上旬，小孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂，中層細(xì)胞逐漸解體、退化或變成長(zhǎng)條狀或殘跡，絨氈層在形成四分體時(shí)也開始部分原位變形，但中層細(xì)胞較絨氈層細(xì)胞提前被吸收（圖2-6～7），絨氈層屬較原始的腺質(zhì)型；小孢子從四分體釋放后發(fā)生變形，但隨著細(xì)胞增殖擴(kuò)大，殘余的絨氈層和中層細(xì)胞重新恢復(fù)并被擠壓為扁平狀（圖2-8～9）；變形小孢子發(fā)育后期多數(shù)能發(fā)育正常，此時(shí)中層和絨氈層再次解體為其發(fā)育提供營養(yǎng)，花粉成熟時(shí)，藥室內(nèi)壁發(fā)育為纖維層1 層，中層和絨氈層被吸收（圖2-10～11）；3月初，小孢子發(fā)育成熟，花粉囊纖維層徑向加厚，同側(cè)花粉囊連接處細(xì)胞壁較薄，受機(jī)械牽拉，花粉從同側(cè)兩花粉囊連接處散出（圖2-12）。

3.3 小孢子的發(fā)生及雄配子體的形成

小孢子母細(xì)胞在減數(shù)分裂前，與花藥壁細(xì)胞有明顯區(qū)別，細(xì)胞體積最大，核大，胞質(zhì)濃厚，為行使小孢子母細(xì)胞功能儲(chǔ)備物質(zhì)（圖3-1）。第1 次減數(shù)分裂末期，小孢子細(xì)胞質(zhì)從外向內(nèi)發(fā)生縊裂，形成二分體，但未見細(xì)胞新壁形成（圖3-2）；進(jìn)入第2 次減數(shù)分裂時(shí)，二分體發(fā)生同時(shí)或不同時(shí)縊裂形成四分體，四個(gè)子細(xì)胞被共同的胼胝質(zhì)包圍（圖3-3）；隨著胼胝質(zhì)溶解，小孢子彼此分開并形成細(xì)胞新壁（圖3-4）。四分體的排列方式以左右對(duì)稱型和四面體型為主（圖3-5～7），偶見直列型（圖3-8），小孢子母細(xì)胞胞質(zhì)分裂方式為修飾性同時(shí)型和連續(xù)型兼有。

圖3 小孢子的發(fā)生及雄配體子的形成Fig.3 The occurrence of microspore and the formation of male gametophyte

從四分體釋放后的小孢子形態(tài)發(fā)生不同程度的變形，出現(xiàn)扭曲、收縮或變?yōu)槟I型，細(xì)胞壁薄，細(xì)胞質(zhì)液泡化（圖3-9～10）；變形小孢子細(xì)胞壁進(jìn)一步擴(kuò)張、加厚，形成形狀規(guī)則、無液泡的單核小孢子，胞質(zhì)變濃且分布均勻（圖3-11）；隨后小孢子細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)液泡化形成一個(gè)中央大液泡，細(xì)胞核被擠到細(xì)胞的邊緣，此時(shí)小孢子為單核靠邊期（圖3-12）；經(jīng)歷單核靠邊期后，小孢子核物質(zhì)不斷積累，隨即發(fā)生1 次不均等的有絲分裂，分裂過程中可觀察到染色體從赤道面被拉向兩極，將細(xì)胞質(zhì)分成不均等的兩部分而形成具營養(yǎng)核和生殖核的二核小孢子（圖3-13～15）；二核小孢子發(fā)育后期，大液泡消失，大部分細(xì)胞質(zhì)和營養(yǎng)核形成營養(yǎng)細(xì)胞，小部分細(xì)胞質(zhì)和生殖核形成生殖細(xì)胞，營養(yǎng)細(xì)胞占據(jù)花粉的絕大部分體積（圖3-16），成熟小孢子形成。

3.4 花藥發(fā)育過程中的敗育

通過對(duì)灰木蓮花藥發(fā)育的解剖觀察，在其發(fā)育過程中主要存在以下異?，F(xiàn)象：（1）小孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂到四分體形成時(shí)，絨氈層和中層細(xì)胞提前解體（圖4-1），僅剩少量殘余，不能為小孢子后期發(fā)育提供營養(yǎng)，經(jīng)切片數(shù)量統(tǒng)計(jì)，此異常現(xiàn)象比例約占14%。（2）花粉壁收縮變形，形成心型花粉嚢，從四分體分離的小孢子因過度扭曲變形不能再正常發(fā)育（圖4-2～3），因變形而敗育的小孢子約占9%。（3）在小孢子母細(xì)胞分裂時(shí)期，小孢子母細(xì)胞因退化、發(fā)育異?；蛳?，空心花粉嚢的比例約占10%（圖4-4）。

圖4 雄配子體發(fā)育過程中的異常現(xiàn)象Fig.4 The abnormal phenomenon in the process of male gametophyte development

4 討論

灰木蓮的雄蕊含花藥平均98 枚，4～6 個(gè)小孢子囊呈線型或蝴蝶型排列于扁平花藥的向心面或側(cè)向面，其花藥開裂同時(shí)具側(cè)向開裂和內(nèi)向開裂2 種方式。在較為原始的雙子葉植物中，整個(gè)雄蕊為具3 條維管束的扁平葉狀，花粉囊則著生于近軸面的中脈與側(cè)脈之間。據(jù)統(tǒng)計(jì)，進(jìn)化后95%的被子植物具單脈雄蕊，這被認(rèn)為是葉狀雄蕊在寬度和脈跡減少的進(jìn)化過程中的產(chǎn)物[17]。已報(bào)道的木蘭科花粉嚢數(shù)均為4 個(gè)，且數(shù)量較穩(wěn)定[4,18]，本研究觀察到灰木蓮花藥橫切結(jié)構(gòu)具4～6 個(gè)花粉嚢，其花粉嚢數(shù)目具一定的可變性，這在木蘭科其他植物中尚未見報(bào)道。通常認(rèn)為，花部數(shù)目多數(shù)和不定數(shù)是原始性狀，少數(shù)和定數(shù)是進(jìn)化性狀[19]，這表明灰木蓮的花粉嚢數(shù)量在系統(tǒng)演化中保留了更為原始的性狀。在植物的系統(tǒng)發(fā)育中，不同器官的演化速度是不同的，因而造成同一分類群在具有原始特征的同時(shí)，又兼具有許多進(jìn)化特征，被稱為異步進(jìn)化或鑲嵌進(jìn)化現(xiàn)象，這在原始的有花科植物中表現(xiàn)得最明顯[20]。同已報(bào)道同屬的紅花木蓮(M.insignis)、大果木蓮(M.grandis)和毛果木蓮(M.hebecarpa)相比，就花藥特征而言，灰木蓮花藥數(shù)目較少，屬較進(jìn)化類型，但其花粉嚢數(shù)目卻比紅花木蓮、大果木蓮和毛果木蓮的原始[21-22]。

灰木蓮的花藥壁由表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層組成，中層和絨氈層僅由1～2 層細(xì)胞組成，腺質(zhì)絨氈層，成熟花粉粒為二細(xì)胞型，這和已報(bào)道其他木蓮屬的花藥發(fā)育特征基本相同[21,23-26]?；ǚ郾诠饣?，極軸面具極稀疏穴狀紋飾，為木蓮屬中的最原始類型，花粉極軸約25.5 μm，屬木蓮屬中花粉極軸的最短區(qū)間，花粉赤道軸約62.3 μm，處于木蓮屬花粉赤道軸范圍的中等區(qū)間[27]。在灰木蓮的小孢子發(fā)育過程中，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂具連續(xù)型和同時(shí)型2 種方式，連續(xù)型分離的小孢子以左右對(duì)稱型和直線型排列方式為主，同時(shí)型分裂出的小孢子為四面體型排列，而其他木蘭科樹種一般僅具一種同時(shí)型的胞質(zhì)分裂方式[21,24-25,28]?；夷旧徯℃咦釉谒姆煮w時(shí)發(fā)生收縮變形，剛釋放的小孢子呈扭曲、梭狀或骨形，這與紅花木蓮、西疇含笑（Michelia coriaceaChang et B.L.Chen）和凹葉厚樸（Magnolia officinalisRehd.et Wils）的四分體變形特征相似[21,25,28-30]，西疇含笑和凹葉厚樸的大部分小孢子因收縮過度而不能再進(jìn)一步正常發(fā)育，但在灰木蓮和紅花木蓮中，大多數(shù)小孢子在發(fā)生不規(guī)則的收縮變形的同時(shí)進(jìn)行液泡化過程，因此，大部分小孢子仍能正常發(fā)育形成花粉粒。潘躍芝等認(rèn)為，這種收縮現(xiàn)象可能是為了將細(xì)胞質(zhì)擠到細(xì)胞的邊緣，以有利于細(xì)胞核有絲分裂的進(jìn)行[21,25]，此現(xiàn)象發(fā)生的機(jī)理和作用如何？是否為更進(jìn)化的類型？需進(jìn)一步系統(tǒng)的研究。

木蘭科作為原始被子植物的現(xiàn)存類群，花粉敗育與結(jié)籽率低是木蘭科瀕危植物生殖失敗的原因之一[31]，對(duì)其瀕危機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，許多屬在花粉發(fā)育中存在不同環(huán)節(jié)的敗育現(xiàn)象，如紅花木蓮因次生造孢細(xì)胞、花粉母細(xì)胞部分?jǐn)∮投煮w敗育，其花粉萌發(fā)率僅為14.7%；毛果木蓮存在花粉量少，且因原生質(zhì)提前解體形成無細(xì)胞核不規(guī)則的敗育花粉率為29%[31]；香港木蘭（M.championii）的小孢子敗育率較高，四分體到單核花粉形成期出現(xiàn)異常發(fā)育[32-33]；凹葉厚樸在小孢子形成時(shí)，母細(xì)胞膠合在一起不能發(fā)生減數(shù)分裂，或是分離出的小孢子因過度收縮變形不能形成正?；ǚ哿?，或是部分花粉囊在二核花粉形成時(shí)，花藥壁的絨氈層和中層細(xì)胞仍未退化完全而缺乏繼續(xù)發(fā)育的營養(yǎng)物質(zhì)[28]；觀光木（Tsoongiodendron odorumChun）的花粉發(fā)育敗育，主要發(fā)生于從四分體分離出小孢子時(shí)，同側(cè)花粉囊有50%的四分體退化，35%的小孢子因過度收縮發(fā)育為敗育的小孢子[34]。本研究中，灰木蓮小孢子發(fā)育的敗育主要發(fā)生于四分體時(shí)期，絨氈層和中層細(xì)胞提前解體，花粉囊萎縮，剛釋放的小孢子呈扭曲、梭狀或骨形而致使部分小孢子不能發(fā)育為正?；ǚ哿５臄∮蕿?3%。

生殖敗育是植物引種栽培條件下常發(fā)生的問題，其原因是多方面的。灰木蓮在自然狀態(tài)結(jié)實(shí)率幾乎為零，但對(duì)其異株異花授粉的結(jié)實(shí)率可達(dá)57.67%[35]，本研究所觀察到的灰木蓮花粉敗育率為33%，這雖然在一定程度上減少了其授粉機(jī)率，但若按其花粉胚珠比1 146 來計(jì)算，每胚珠獲得的花粉量概率依然很大。因此，花粉敗育對(duì)其結(jié)籽率較低的影響是有限的，栽培區(qū)內(nèi)是否缺少足夠量的有效傳粉昆蟲，有待今后進(jìn)一步研究證實(shí)。

5 結(jié)論

灰木蓮花藥結(jié)構(gòu)和發(fā)育特征與其他木蓮屬相似，但在花粉囊結(jié)構(gòu)、胞質(zhì)分裂方式和小孢子四分體排列方式表現(xiàn)不同，小孢子發(fā)育過程的異?，F(xiàn)象主要發(fā)生于四分體時(shí)期，為引起灰木蓮花粉敗育和結(jié)實(shí)率低的原因之一。