張 銘，梁軍,2＊，李箐，謝憲，程元，張星耀,2

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，國家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點實驗室，北京 100091；2.昆崳山森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，山東 煙臺 264100；3.北京市西山林場，北京 100083)

松枯梢病(又名松梢枯病shoot blight of pine)是世界范圍內(nèi)針葉樹種上分布最廣、最常見的重要林木枝干病害之一[1]。自從我國自20 世紀(jì)70 年代末報道以來，松枯梢病已蔓延至黑龍江、吉林、遼寧、陜西、江蘇、湖北、福建、安徽、江西、廣東和廣西等10 余個省份[2]，嚴(yán)重危害松屬（Pinus）、冷杉屬（Abies）、落葉松屬（Larix）、崖柏屬（Thuja）、雪松屬（Cedrus）、刺柏屬（Juniperus）、云杉屬（Picea）和黃杉屬（Pseudotsuga）約8 屬60 多種針葉樹種[3]。該病害病原存在基因型的分化，De Wet 通過多基因系譜學(xué)和微衛(wèi)星標(biāo)記手段將松枯梢病原菌劃分為3 個不同類型，分別為A 型Diplodia scrobiculata，B 型Diplodia seriata和C 型Sphaeropsis sapinea（同物異名：Diplodia pinea）[4]。在中國引起松枯梢病的病原菌是C 型松球殼孢菌（Sphaeropsis sapinea）[5]，該病原菌可危害大樹和幼樹，大樹多為側(cè)枝發(fā)病，小樹上頂梢發(fā)病，導(dǎo)致頂芽枯死、枯梢、根腐，嚴(yán)重時會出現(xiàn)流脂現(xiàn)象[6]，對松樹人工林造成了嚴(yán)重危害。目前，對松枯梢病主要采取化學(xué)防治與營林措施相結(jié)合的防治技術(shù)[7]。但長期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會導(dǎo)致環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、威脅人類健康，而且容易誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生抗藥性[8]，甚至?xí)?dǎo)致病害的再次流行。而營林措施見效慢，投入成本較大。為有效防控松枯梢病，必須尋求一種生態(tài)友好的防治策略，木霉菌由于特有的拮抗和促生作用，現(xiàn)已成為一類應(yīng)用較多的生防真菌[9]，它通過競爭、寄生或產(chǎn)生抗菌素等次生代謝產(chǎn)物，從而對病原菌起到抑制作用[10]，并能促進(jìn)植物生長[11]，提高寄主抵抗性。常見的生防木霉有哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、綠色木霉（T.viride）、棘孢木霉（T.asperellum）等。研究表明，哈茨木霉ES323可有效抑制番茄灰霉病菌灰葡萄孢菌菌絲生長，引起菌絲腔質(zhì)液泡化并導(dǎo)致菌體裂解[12]。非洲哈茨木霉菌（Trichoderma afroharzianum）株NAIMCC-F-01938 發(fā)酵液可使葡萄白粉病原菌分生孢子扭曲變形，可作為安全殺菌劑在田間使用，可使葡萄白粉病發(fā)病率降低43%[13]。接種棘孢木霉可使洋蔥鱗莖內(nèi)酚類化合物含量提高97.6%，提高了洋蔥對葉枯病的抵御能力，對洋蔥葉枯病病原菌Stemphylium vesicarium具有顯著的防控效果[14]。內(nèi)生木霉菌株V76-12 可抑制油棕葉斑病原菌Curvularia oryzae菌絲生長，同時提高了油棕幼苗苯丙氨酸解氨酶PAL、過氧化物酶POD 和多酚氧化酶PPO 的活性[15]，提高了寄主植物的抗性。在前期的研究中，本實驗室以松枯梢病原松球殼孢菌（Sphaeropsis sapinea）為目標(biāo)菌株，從土壤真菌中分離篩選到1 株對松球殼孢菌具有良好抑菌效果的森吉木霉菌株M75。為明確森吉木霉M75 對松球殼孢菌的抑制作用機理，本研究從森吉木霉M75 對病原菌代謝系統(tǒng)酶活性和電導(dǎo)率、丙二醛含量等方面，探究生防菌森吉木霉M75 發(fā)酵粗提液對松球殼孢菌的抑菌機制，為松枯梢病的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

松球殼孢菌（Sphaeropsis sapinea）由中國林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)重點實驗室菌種保藏中心提供。森吉木霉M75 由本實驗室分離篩選獲得，現(xiàn)保藏于中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號：CFCC54490。

1.2 試驗方法

1.2.1 森吉木霉M75粗提液制備將保藏的M75菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上，28℃活化5 d，用打孔器選取直徑5 mm 菌餅，接入裝有250 mL PDB 培養(yǎng)液的三角瓶中，180 r·min?1、28 ℃振蕩培養(yǎng)4 d，10000 r·min?14℃離心10 min，取上清經(jīng)0.45 μm 無菌微孔濾膜過濾，得到發(fā)酵粗提液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 松球殼孢菌菌絲團(tuán)制備 將保藏的松球殼孢菌菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃活化5 d，用打孔器選取直徑5 mm 菌餅，接入裝有250 mL PDB 培養(yǎng)液的三角瓶中，160 r·min?1、28 ℃振蕩培養(yǎng)3～4 d，將產(chǎn)生的直徑約為2 cm 的病原菌菌絲團(tuán)用無菌水洗凈后置于20 mL 含20%發(fā)酵粗提液的無菌水溶液中，靜置2、4、6、8、10、12、24、48、72、96 h 后測定松球殼孢菌各項代謝酶活性和生理指標(biāo)。以不添加發(fā)酵粗提液作為空白對照，每個時間段處理重復(fù)3 次，指標(biāo)測定時技術(shù)重復(fù)3 次。

1.2.3 測定的指標(biāo) 測定的病原菌代謝系統(tǒng)酶包括：保護(hù)酶系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）；糖酵解途徑中的己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）和乳酸脫氫酶（LDH）；三羧酸循環(huán)中的琥珀酸脫氫酶（SDH）和蘋果酸脫氫酶（MDH）；輔酶Ⅰ含量和ATP 酶。酶活性測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

生理指標(biāo)包括電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）含量2 個指標(biāo)。電導(dǎo)率測定使用電導(dǎo)儀測定[16]，丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸法[17]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和分析，繪圖使用Origin 2018 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 森吉木霉M75 粗提液對松球殼孢菌代謝系統(tǒng)相關(guān)酶活性的影響

2.1.1 對松球殼孢菌保護(hù)酶活性的影響 如圖1 所示，經(jīng)森吉木霉M75 粗提液處理的前8 h 內(nèi)，與對照組相比，松球殼孢菌代謝系統(tǒng)SOD 酶活性顯著上升，并在處理8 h 時達(dá)到峰值，此時酶活性為72.717 U·（g·min）?1。說明病原菌在粗提液的處理下，前期SOD 酶活性增加以達(dá)到保護(hù)菌體的作用。處理8 h 后，SOD 酶活性大幅降低，在處理96 h 時酶活性最低，為1.510 U·（g·min）?1，說明隨著處理時間增加，SOD 酶活性不斷降低。對照組在前8 h 內(nèi)SOD 酶活性也呈上升趨勢，8 h 時酶活性達(dá)37.167 U·（g·min）?1，顯著低于同時段處理組酶活性。但8 h 后，對照組SOD 酶活性呈平穩(wěn)變化趨勢，無大幅下降，48 h 時達(dá)峰值62.180 U·（g·min）?1，在處理96h時酶活性為52.985 U·（g·min）?1。

圖1 森吉木霉M75 粗提液對松球殼孢菌保護(hù)系統(tǒng)酶活性的影響Fig.1 Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on pathogen protective enzyme activities

經(jīng)森吉木霉M75 粗提液處理的前12 h 內(nèi)，CAT 酶活性快速上升并在12 h 時達(dá)到峰值，0.067 U·（g·s）?1，說明發(fā)酵粗提液導(dǎo)致松球殼孢菌代謝系統(tǒng)中過氧化氫含量增加，但處理12 h 后酶活性大幅下降，并逐漸趨于零，在處理96 h 時為0.004 U·（g·s）?1，是由于SOD 酶活性逐漸降低，及膜脂過氧化嚴(yán)重，導(dǎo)致CAT 酶活性不斷降低。而對照組在48 h 內(nèi)CAT 酶活性都處于上升狀態(tài)，在48 h 時達(dá)到峰值0.064 U·（g·s）?1，在之后隨時間增加酶活性緩慢下降，96 h 時為0.054 U·（g·s）?1，且在24 h 后對照組CAT 酶活性始終高于處理組。

在經(jīng)森吉木霉M75 粗提液處理的前12 h 內(nèi)，與對照組相比，松球殼孢菌代謝系統(tǒng)POD 酶活性顯著上升，在12 h 時達(dá)到峰值，為5.733 U·（g·s）?1，在12 h 后，處理組酶活性大幅下降，并在48 h 后趨于平穩(wěn)。對照組POD 酶活性一直呈上升趨勢。PPO 酶活性與POD 酶活性變化趨勢基本一致，處理組在10 h 時達(dá)到酶活性峰值，11.909 U·（g·s）?1，此后酶活性大幅快速下降，并在處理96 h 時達(dá)到最低值0.046 U·（g·s）?1。

2.1.2 對松球殼孢菌糖酵解途徑中PK、HK 和LDH 的影響 如圖2 所示，經(jīng)M75發(fā)酵粗提液處理后，松枯梢病原菌松球殼孢菌菌絲團(tuán)的PK、HK、LDH均隨時間增加呈下降趨勢，PK酶活性從初始2h時的0.550U·（g·min）?1，至96h時下降至0.033U·（g·min）?1。HK酶活性從初始2h時的0.066U·（g·min）?1，至96h時下降至0.005U·（g·min）?1。LDH 酶活性由初始2 h 的2.351 U·（g·min）?1，至96h時下降至0.122 U·（g·min）?1。而對照組的PK、HK 活力都隨時間增加呈持續(xù)上升趨勢，PK酶活性由初始2h的0.492U·（g·min）?1，至96h時上升至0.952 U·（g·min）?1；HK酶活性由初始2h的0.060 U·（g·min）?1，至96h時上升至0.204 U·（g·min）?1；對照組的LDH 酶活性整體趨于平穩(wěn)，且酶活性始終高于處理組，說明M75 發(fā)酵粗提液對糖酵解途徑中的PK、HK 及LDH 的合成產(chǎn)生了抑制作用，嚴(yán)重干擾了其正常代謝。

圖2 森吉木霉M75 粗提液對松球殼孢菌糖酵解途徑中關(guān)鍵酶活性的影響Fig.2 Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on pathogen key enzyme activities in sugar metabolic pathways

2.1.3 對松球殼孢菌三羧酸循環(huán)中MDH與SDH酶活性的影響 琥珀酸脫氫酶SDH 是細(xì)胞能量代謝的重要酶類，其活性變化可直接反應(yīng)細(xì)胞能量代謝狀況[18]。如圖3 所示，經(jīng)生防菌M75 粗提液處理后，松球殼孢菌菌絲團(tuán)的MDH 與SDH 酶活性在處理后的12 h 內(nèi)急速下降，MDH 酶活性由初始2 h 時的15.550 U·（g·min）?1下降至24 h 時的1.275 U·（g·min）?1，之后下降趨勢變緩，但仍隨時間呈逐漸下降趨勢，在96 h 時為0.196 U·（g·min）?1。SDH 酶活性在處理12 h 內(nèi)由初始2 h 的30.327 U·（g·min）?1急速下降至9.997 U·（g·min）?1，之后下降趨勢減緩，處理96 h 時為0.948 U·（g·min）?1。而對照組MDH 與LDH酶活性則隨時間呈逐漸上升趨勢。這說明粗提液抑制了病原菌代謝系統(tǒng)中MDH 和SDH 的正常合成，導(dǎo)致三羧酸循環(huán)停滯。

2.1.4 對松球殼孢菌輔酶I 和ATP 酶活性的影響 如圖4 所示，經(jīng)森吉木霉菌M75 發(fā)酵粗提液處理后的12 h 內(nèi)，松枯梢病原菌松球殼孢菌菌絲團(tuán)的輔酶I 含量快速下降，由2 h 的5.700%下降至1.340%，在之后隨處理時間的增加不斷趨于零。對照組輔酶I 含量則不斷增加。

圖4 森吉木霉M75 粗提液松球殼孢菌輔酶I 含量的影響Fig.4 Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on the content of pathogens enzyme I

如圖5 所示，經(jīng)森吉木霉菌M75 發(fā)酵粗提液處理的Na+，K+-ATP、Mg2+-ATP、Ca2+-ATP 酶活性總體上呈先上升后急速下降的趨勢。處理4h時，Na+，K+-ATP酶活性達(dá)到峰值0.902 μmol Pi·（g·h）?1，處理12h時，Mg2+-ATP、Ca2+-ATP 酶活性達(dá)到峰值，分別為1.759 和3.184 μmol Pi·（g·h）?1，此后急劇下降并逐漸趨于零。對照組酶活性在24 h 內(nèi)處于快速上升趨勢，后上升趨緩，但酶活性在10 或12 h 后高于處理組。

圖5 森吉木霉M75 粗提液對松球殼孢菌ATP 酶活的影響Fig.5 Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on ATP enzyme activities

2.2 森吉木霉M75 粗提液對松球殼孢菌生理生化指標(biāo)的影響

2.2.1 對松球殼孢菌電導(dǎo)率的影響 如圖6 所示，松球殼孢菌經(jīng)森吉木菌M75 發(fā)酵粗提液處理后，電導(dǎo)率隨處理時間呈明顯增大趨勢，并且在各處理時段都遠(yuǎn)高于對照組，說明經(jīng)處理的病原菌體電解質(zhì)泄露，導(dǎo)致電導(dǎo)率值增加。

圖6 森吉木霉M75 粗提液對球殼孢菌電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on pathogens conductivity

2.2.2 對松球殼孢菌丙二醛含量的影響 如圖7 所示，經(jīng)森吉木霉M75 粗提液處理后，松球殼孢菌MDA 含量在24 h 內(nèi)呈急速增加趨勢，在24 h 時達(dá)到峰值，1.063 nmol·g?1，而后呈下降趨勢。對照組MDA 含量整體隨時間增加呈平穩(wěn)上升趨勢，且對照組MDA 含量始終低于處理組。

圖7 森吉木霉M75 粗提液對松球殼孢菌丙二醛含量的影響Fig.7 Effects of the crude extract of Trichoderma songyi M75 on pathogens MDA contents

3 討論

木霉菌作為應(yīng)用最廣泛的一類生防真菌，對18 個屬的29 種植物病原真菌表現(xiàn)出顯著的抑菌活性[19]，生防菌株能夠抑制病原菌的生長，必然是破壞了菌體正常的生理代謝途徑[20]。森吉木霉M75發(fā)酵粗提液對松枯梢病原菌松球殼孢菌的抑制作用主要體現(xiàn)在，發(fā)酵粗提液有效抑菌成分可使松球殼孢菌代謝保護(hù)酶系統(tǒng)中的SOD、CAT、POD、PPO酶活性先上升后下降，并在處理10 h 至12 h 后顯著低于正常水平，說明隨著處理時間增加，氧自由基不斷增多，細(xì)胞膜脂過氧化加重，導(dǎo)致保護(hù)系統(tǒng)酶活性不斷降低，影響了病原菌保護(hù)酶系統(tǒng)的正常代謝。同時導(dǎo)致糖酵解途徑中的HK、PK 和LDH酶活性持續(xù)下降，影響了松球殼孢菌正常的糖酵解途徑[21]。作為三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，SDH 和MDH 代表TCA 循環(huán)活化狀態(tài)[22]，其酶活數(shù)值變化能直接反應(yīng)細(xì)胞能量代謝的情況[23]，SDH 與MDH 活性降低，代表菌體的TCA 循環(huán)受阻，正常的細(xì)胞代謝無法進(jìn)行。ATP 是生命體維持生命活動的能量庫，其含量能在一定程度上反應(yīng)出自身的生理狀態(tài)[24]，輔酶I 含量可用于評價糖酵解和TCA 循環(huán)的強弱，ATP 和輔酶I 的變化曲線反映出菌體在受到發(fā)酵粗提液脅迫時，細(xì)胞代謝路徑受阻，糖酵解和TCA 循環(huán)合成減慢，細(xì)胞能量供給不足[25]。MDA 是細(xì)胞膜脂過氧分解的主要產(chǎn)物，MDA 的含量可直接反映細(xì)胞膜過氧化程度[26]，當(dāng)生物體受到脅迫時，會引起細(xì)胞質(zhì)膜過氧化，使得MDA 含量大幅上升[27]，本研究中松球殼孢菌MDA 含量在處理24 h 內(nèi)急劇上升，且處理組MDA 含量始終高于對照組，說明發(fā)酵液導(dǎo)致病原菌菌體過氧化程度加劇[28]。細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)成分滲出是菌體膜脂受損的標(biāo)志，能直接反映菌體細(xì)胞膜通透性的變化[29]，本研究中松球殼孢菌的電導(dǎo)率隨處理時間增加，電導(dǎo)率值不斷上升，說明發(fā)酵粗提液破壞了菌體細(xì)胞膜的完整性，使菌體細(xì)胞膜透性改變，導(dǎo)致電解質(zhì)滲漏[30]，抑制了松球殼孢菌的正常生長。本研究中所用為此前分離得到的森吉木霉M75，這是森吉木霉首次應(yīng)用于生物防治，目前還未見有關(guān)森吉木霉菌抑菌機理的報道，本研究對豐富生防木霉菌的資源庫具有重要意義。

4 結(jié)論

通過對松枯梢病病原菌松球殼孢菌代謝系統(tǒng)中保護(hù)酶系統(tǒng)、糖代謝、三羧酸循環(huán)、能量代謝中各關(guān)鍵酶和電導(dǎo)率、MDA 含量等指標(biāo)的測定，說明森吉木霉M75 發(fā)酵粗提液對松枯梢病原松球殼孢菌有較好的抑制作用，可使其代謝系統(tǒng)相關(guān)酶活性降低，并導(dǎo)致電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率升高，MDA 大量累積，阻礙松球殼孢菌正常的生理代謝途徑，使得病原菌無法進(jìn)行正常的生理生化反應(yīng)，從而抑制病原菌的生長。