鐘姍辰，武舒，王黎，蘇曉華，張冰玉

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091)

楊屬（PopulusL.）植物分布廣泛，不僅具有較高的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值，同時(shí)也是木本模式植物，在林木分子生物學(xué)研究等方面具有重要作用。然而，作為北方城市重要的道路綠化和城市景觀樹種，楊樹在提高城市綠化水平的同時(shí)，也因其花粉在每年春季大量飄散而引起了一定的植源性污染問題。楊樹雄株散落的花粉以空氣為傳播媒介，通過人體呼吸及皮膚接觸造成呼吸道疾病和皮膚過敏等問題，危害著人體健康[1-3]。除更換樹種外，目前關(guān)于花粉污染的應(yīng)對(duì)策略主要還包括人工噴水增濕、增強(qiáng)地表對(duì)花粉的吸附能力等。另外，日益發(fā)展的生物技術(shù)推動(dòng)了林木遺傳育種進(jìn)程，有望成為解決花粉等植源性污染的有效途徑之一。目前關(guān)于楊樹的研究主要聚焦于其材性及抗逆性等方面，而對(duì)楊樹的生殖發(fā)育研究相對(duì)較少。

楊樹童期較長且雌雄異株，不同于大多數(shù)由萼片、花瓣、心皮（雌蕊/雄蕊）、胚珠4 輪結(jié)構(gòu)組成的被子植物花，楊樹的雌花和雄花均高度簡化，其中，雄花著生于苞片腋間，由退化的盤狀花被和雄蕊構(gòu)成，花藥為黃色或紅色，一般情況下藥隔無明顯突出[4]?；ㄋ帪樗逆咝?，成熟的花藥壁由一層表皮、一層內(nèi)層、兩層中層和單層絨氈層組成。表皮宿存，內(nèi)層發(fā)育成纖維狀增厚，中層是短命的，其中一層在小孢子階段變?yōu)楸馄?，最后被擠碎，另一層則在花藥開裂前解體；絨氈層細(xì)胞早期是單核的，而當(dāng)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)則成為雙核或多核的，它們?cè)诨ǚ蹎魏藭r(shí)期開始退化，至雙核期消失[5]。楊樹性別特異的花器官發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程，但與其他被子植物花發(fā)育類似，楊樹的花發(fā)育也分為開花誘導(dǎo)、花的發(fā)端和花器官發(fā)育3 個(gè)受眾多基因調(diào)控的復(fù)雜過程，且它們具有相似的花器官特性基因[6]。

隨著研究的不斷深入，花器官形成的相關(guān)理論逐步完善，由最初的“ABC”模型假說發(fā)展成為“ABCDE”模型及四聚體模型，其中，A類和E類基因決定花萼特征，A、B 和E類基因一起調(diào)控花瓣發(fā)育，B、C 和E類基因共同決定雄蕊發(fā)育，C類和E類基因決定心皮發(fā)育，D類和E類決定胚珠發(fā)育[7-8]。楊樹花發(fā)育的相關(guān)器官特異性基因的作用不全同于其他開花植物，近年來調(diào)控楊樹花器官發(fā)育的多個(gè)ABCDE類基因功能被解析，如：A類基因中的AP1同源基因PTM1、PTM2和B類基因中的AP3同源基因，它們?cè)跅顦浯?雄株中的表達(dá)有所差異，可能參與了楊樹的性別決定[9-10]；B類基因中的PI的同源基因PdPI和C類基因PTAG1和PTAG2，與楊樹花發(fā)育密切相關(guān)并且可能影響營養(yǎng)器官的形成和發(fā)育[6,11-12]；E類基因中的PTM3、PTM4及PTM6，在楊樹雌/雄株中花發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)，在胚珠、花藥原基中有著非常高的表達(dá)量[13]。

AGAMOUS(AG)是MADS-box 基因中研究較為充分的一類基因，屬于植物特有的MIKC 型C類MADS-box 基因，包括euAG/PLENA(PLE)譜系和AGAMOUS-like11(AGL11)譜系，可與其他基因互作共同控制雄蕊及心皮的發(fā)育[8,14-17]。在擬南芥中，AG可控制擬南芥花發(fā)育后期的花粉形成[18-20]。另有研究表明，在擬南芥AG突變體的花器官四輪結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)了第三輪結(jié)構(gòu)（雄蕊）轉(zhuǎn)化為花瓣、第四輪結(jié)構(gòu)(心皮)發(fā)育成一個(gè)新的花的情況，而第一、二輪的花結(jié)構(gòu)(萼片及花瓣)與野生型擬南芥花器官并無差異[21-23]。另外，抑制AG會(huì)導(dǎo)致菠菜雄性不育[24]。而AGAMOUS(AG)及其同源基因在單性花發(fā)育的研究中鮮有報(bào)道，在毛果楊雌株中，AG（PtAG1及PtAG2）和STK（AGL11）基因在楊樹種毛發(fā)育中表現(xiàn)出較強(qiáng)的功能保守性，共同抑制種毛的形成[12]，而該基因在楊樹雄花花發(fā)育中的作用尚無報(bào)道。

本研究基于AG2在被子植物花器官的決定作用，對(duì)銀腺楊‘84K’（Populus alba×P.glandulosa‘84K’）PagAG2基因時(shí)空特異性進(jìn)行了檢測，為進(jìn)一步研究其在楊樹雄花花發(fā)育中的功能，進(jìn)而有針對(duì)性地對(duì)楊樹生殖發(fā)育進(jìn)行調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及相關(guān)試劑

銀腺楊‘84K’（Populus alba×P.glandulosa‘84K’）花序于2019 年2月22 日采自北京市中國林科院內(nèi)（115.7°～117.4° E，39.4°～41.6° N），組培材料生長于溫度25℃、光強(qiáng)2300 Lx、光周期16 h/8 h 的組織培養(yǎng)間中；RNA 提取試劑盒購自Aidlab 公司（北京）；Premix TaqTM 酶購、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR 試劑盒均購自Takara 公司（日本）；固定液由50%FAA 固定液100 mL、無水乙醇50 mL、37%甲醛溶液10 mL、冰乙酸5 mL加DEPC·H2O 定容至100 mL；RNA 預(yù)雜交液/雜交液由20×SSC 30 mL、50×Denhardt's 10 mL、10%SDS 5 mL、10 mg·mL?1Salmon DNA 1 mL、Formamide（甲酰胺）50 mL、ddH2O 4 mL，充分混勻后使用0.45 μm 濾膜去雜質(zhì)后使用；抗熒光淬滅封片劑購自生工生物公司（上海）。

1.2 方法

1.2.1 銀腺楊‘84K’雄花的水培及石蠟切片制作 取‘84K’楊越冬花枝，2019 年2月22 日置于溫室水培（0 d），每日更換一次水。對(duì)水培后1 周內(nèi)的花序連續(xù)采樣（0、3、4、5、6、7 d），置于PBS 固定液中立即真空抽氣固定，并依次完成脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、粘片、脫蠟步驟，以番紅—固綠法染色[25]。染色完成染色后，在光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS 公司（BX51）產(chǎn)品）下觀察、拍照記錄。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）分別提取‘84K’楊組培苗的根、莖、葉及水培后2 周內(nèi)的花序連續(xù)采樣（水培后0、3、4、5、6、7 d 的花序）的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用熒光定量PCR 儀（Roche 公司（Light Cycle 480Ⅱ）產(chǎn)品）進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系為cDNA 模板2 μL，Primer-F(10 μmol·L?1) 0.8 μL，Primer-R(10 μmol ·L?1) 0.8 μL，XTB Green Premix TaqII（TliRNaseH Plus，2×）10 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。其擴(kuò)增條件為預(yù)變性95℃，30s；變性95℃，5s，退火60℃，30s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線為95℃ 5 s，65℃ 1 min。以Actin為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)，用2?ΔΔCT算法進(jìn)行分析[26]，引物見表1。

表1 qRT-PCR 表達(dá)分析引物Table 1 Primers used in qRT-PCR analysis

1.2.3 熒光原位雜交（FISH）基于堿基互補(bǔ)的原則，利用熒光原位雜交技術(shù)將細(xì)胞原位雜交技術(shù)和熒光技術(shù)有機(jī)結(jié)合，用熒光素標(biāo)記的已知外源RNA 作探針，與‘84K’楊雄花組織切片雜交，與待測核酸的靶序列專一性結(jié)合，通過檢測雜交位點(diǎn)熒光來顯示PtAG2核苷酸序列在‘84K’楊雄花中的位置。根據(jù)待檢測目的基因序列，采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)，并用探針合成儀器（UNICORN 5.31，沃特曼）合成RNA 探針（表2），熒光素標(biāo)記反義RNA 核酸探針，以正義RNA 探針為陰性對(duì)照。將‘84K’楊雄花序樣品放入配制好的固定液（50%FAA 固定液100 mL、無水乙醇50 mL、37%甲醛溶液10 mL、冰乙酸5 mL，加DEPC·H2O 定容至100 mL）中固定12 h 后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟、包埋、切片（SQ2125，徠克公司）、攤片（PPTHK-21B，徠克）、撈片，62℃烤箱烤片2 h。石蠟切片脫蠟后，將切片于修復(fù)液中煮沸10～15 min，自然冷卻。滴加蛋白酶K（20 ug·mL?1）37℃消化，純水沖洗后PBS 洗3 次，每次5 min。滴加預(yù)雜交液，37℃于雜交儀（S500-24，Thermo-Brite）孵育1 h。傾去預(yù)雜交液，滴加探針雜交液，置于恒溫箱57℃度雜交過夜。洗去雜交液，2×SSC，37℃洗10 min，1×SSC，37℃洗2 次，每次5 min，0.5×SSC 室溫洗10 min。切片滴加DAPI 染液，避光孵育8 min，沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑（Anti-Fade Mounting Medium，生工）封片，置于熒光顯微鏡下（CX41，OLYMPUS）觀察并采集圖像（紫外激發(fā)波長330～380 nm，發(fā)射波長420 nm，發(fā)藍(lán)光；FAM(488)綠光激發(fā)波長465～495 nm，發(fā)射波長515～555 nm，發(fā)綠光；CY5 紅光激發(fā)波長510～560 nm，發(fā)射波長590 nm，發(fā)紅光）。所有試劑、儀器均需DEPC 處理。

表2 RNA 探針序列Table 2 RNA probe sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹雄花發(fā)育形態(tài)學(xué)觀察

楊樹雄花為柔荑花序，著生于苞片腋間，雄蕊被退化的盤狀花被所包圍。‘84K’楊越冬花枝自水培之日（0 d）起，其雄花花芽迅速膨大并將苞片撐開，整個(gè)花序覆有白色絨毛（3 d），第4 天可見紅色花藥，之后整個(gè)花序繼續(xù)伸長，隨著花藥的成熟花藥顏色由紅轉(zhuǎn)為黃，由于花發(fā)育的順序由下向上，花序軸上端的花和下部的花的發(fā)育時(shí)期相差較大，雄花開始有部分花粉散出，至7 d 時(shí)，花粉大量散出，苞片脫落。水培后第0、3、4、5、6、7 天的花序度（3 個(gè)樣品）測量均值分別為0.8、2.5、3.1、3.7、6.5、8 cm（圖1）。

圖1 ‘84K’楊雄花序Fig.1 Male inflorescences of Populus alba×P.glandulosa ‘84K’

從石蠟切片結(jié)果看出：取樣時(shí)楊樹雄花花藥中的單倍體的小孢子已從四分體中釋放，游離于花粉囊中，取樣0～7 d 隨花藥橫切面增大，纖維狀帶逐漸展開，絨氈層濃縮繼而解體，中層降解，至7 d 時(shí)藥隔每側(cè)的2 個(gè)花粉囊互相連通，待花粉囊開裂出現(xiàn)花藥裂口，成熟的花粉依而從花粉囊內(nèi)散出而傳粉（圖2）。

圖2 ‘84K’楊雄花花藥切片F(xiàn)ig.2 Anther section of Populus alba×P.glandulosa ‘84K’

2.2 PagAG2 在‘84K’楊雄花序不同發(fā)育時(shí)期及營養(yǎng)器官的表達(dá)分析

利用qRT-PCR 技術(shù)檢測了PagAG2在‘84K’楊不同器官及其雄花花序不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異。結(jié)果表明，PagAG2在雄花發(fā)育的過程中，水培后1 周內(nèi)的花序樣品中PagAG2的表達(dá)量逐漸升高后降低，6 d 達(dá)到頂峰（圖3A），之后回落，7 d 可見PagAG2降至整個(gè)觀察期最低，藥隔兩側(cè)花粉囊互相連通、花粉成熟將大量散開花粉，這一過程十分迅速，PagAG2基因與楊樹雄花花發(fā)育密切相關(guān)。然而，值得注意的是，PagAG2在根、莖、葉這些營養(yǎng)器官中也有一定表達(dá)（圖3B），并且在莖中的表達(dá)量高于根和葉，但均低于整個(gè)觀察期的雄花。

圖3 PagAG2 在‘84K’楊雄花序（A）及營養(yǎng)器官（B）中的表達(dá)檢測Fig.3 Expression of PagAG2 inPopulus alba×P.glandulosa ‘84K’

2.3 PagAG2 在‘84K’楊雄花中的原位表達(dá)

通過原位雜交的技術(shù)手段檢測了PagAG2在楊樹雄花中的具體表達(dá)部位。用PagAG2特異性探針對(duì)‘84K’楊雄花花序進(jìn)行原位雜交，洗脫后，其熒光顯微鏡鏡檢拍照結(jié)果見圖4。在樣本中可以清晰地觀察到亮綠色雜交信號(hào)覆蓋整個(gè)視野中的花序組織，而紅色陰性對(duì)照僅出現(xiàn)在花藥周圍的花被組織。PagAG2在‘84K’楊雄花花藥中特異性表達(dá)。

圖4 PagAG2 在‘84K’楊雄花中的原位雜交分析Fig.4 In situ hybridization analysis of PagAG2 expression in male flowers Populus alba×P.glandulosa ‘84K’

3 討論

楊樹花發(fā)育過程涉及大量的基因調(diào)控，C類基因AG編碼的MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子在其中起著關(guān)鍵作用，包括終止花分生組織的生成、調(diào)控雄蕊/心皮/胚珠的發(fā)育，并與A類基因相互拮抗[27-31]。Brunner 等[11]的研究表明，PtAG2在毛白楊雌株和雄株中的表達(dá)模式一致，表明它們不太可能在功能上與樹的性別相關(guān)，但卻對(duì)楊樹雌/雄花相關(guān)組織的形成和發(fā)育有著重要作用。本試驗(yàn)中，PagAG2在‘84K’楊雄花花序中的表達(dá)具有時(shí)空特異性。通過實(shí)時(shí)定量PCR 檢測水培后0～7 d 的‘84K’楊雄花花序PagAG2基因表達(dá)量，時(shí)間上PagAG2在花組織中的相對(duì)表達(dá)量先增加后降低，從對(duì)應(yīng)的雄花花序外部形態(tài)及石蠟切片上看，其表達(dá)量是隨著雄花花序發(fā)育而逐漸升高，在花藥成熟時(shí)達(dá)到頂峰，并在花粉成熟散落后降低。另外，本試驗(yàn)通過實(shí)時(shí)定量檢測了PagAG2‘84K’楊根、莖、葉的表達(dá)量，利用熒光原位雜交展現(xiàn)了PagAG2花序中的表達(dá)部位，空間上PagAG2的轉(zhuǎn)錄水平在楊樹花序表達(dá)量高于營養(yǎng)器官，并且花粉為PagAG2在花序中具體表達(dá)部位，在花序中的整個(gè)花藥均有表達(dá)。PagAG2表達(dá)與‘84K’楊雄花發(fā)育密切相關(guān)，有望作為基因工程改良楊樹花粉的目標(biāo)基因。植物生殖發(fā)育的整個(gè)過程在一定程度上均受到MADS-box 基因調(diào)控[32]。另外，已有研究表明，MADS-box 蛋白在楊樹營養(yǎng)器官生長發(fā)育中也發(fā)揮重要作用，如楊樹SVL參與營養(yǎng)芽休眠過程，PTM5、ADF、LRR、FPF1被證明能夠調(diào)控木質(zhì)部的形成等[9,33-37]。目的基因PagAG2除可能參與楊樹雄花花發(fā)育，還可能參與楊樹營養(yǎng)組織的生長發(fā)育調(diào)控。實(shí)時(shí)定量PCR 試驗(yàn)中，‘84K’楊幼期根、莖、葉營養(yǎng)組織中也檢測到了PaAG2轉(zhuǎn)錄物，但其轉(zhuǎn)錄水平低于試驗(yàn)材料自水培日起到花粉成熟并大量散落的整個(gè)觀察期的花組織。已有研究表明，AG表達(dá)的水平對(duì)于確定器官身份是重要的[38]，AG的表達(dá)受其它基因的調(diào)節(jié)，如CURLY LEAF能夠阻止?fàn)I養(yǎng)期AG在葉中表達(dá)[39]，Brunner 等[11]推測，PtAG2營養(yǎng)表達(dá)可能是楊樹中不太嚴(yán)格的抑制控制的結(jié)果，但該基因是否參與楊樹其他組織的某些生長發(fā)育調(diào)控，需要對(duì)其做進(jìn)一步的基因功能分析。

楊樹基因組幾乎包含了擬南芥所有調(diào)控開花的主要同源基因[40-41]，在對(duì)模式植物擬南芥的研究中，發(fā)現(xiàn)了促進(jìn)花器官發(fā)育的多聚MADS-box 蛋白復(fù)合物的形成。MADS-box 蛋白以二聚體的形式與下游靶基因結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)擬南芥生長發(fā)育的調(diào)控作用，如AG、AP2和AGL1在擬南芥中能夠形成同源二聚體蛋白共同決定花器官特性[42-43]。隨著研究的深入又提出了四分子模型，即2 個(gè)MADS 蛋白形成二聚體，又分別與靶基因結(jié)合后形成蛋白四聚體，共同對(duì)花器官的建成起作用，四聚體PIAP3-SEP3-AG 控制雄蕊的分化，過表達(dá)PI-AP3-SEP3-AG 植物的營養(yǎng)葉轉(zhuǎn)化為雄蕊狀器官[44]，這也為其他物種中MADS-box 基因相關(guān)調(diào)控機(jī)理的研究提供了參考，楊樹PagAG2也可能與其他它因形成多聚體，共同實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的調(diào)控作用。

4 結(jié)論

本研究對(duì)‘84K’楊PagAG2基因的表達(dá)模式進(jìn)行了研究。時(shí)間上PagAG2表達(dá)量隨著花粉成熟先增加后降低，空間上PagAG2在楊樹花序表達(dá)量高于營養(yǎng)器官，并且花粉為PagAG2在花序中具體表達(dá)部位，PagAG2與‘84K’楊雄花花發(fā)育密切相關(guān)，有望作為基因工程改良楊樹花粉的目標(biāo)基因，而PagAG2的轉(zhuǎn)錄物在楊樹幼期根、莖、葉組織中也能被檢測得到，其是否參與楊樹其他組織的生長發(fā)育調(diào)控，在相關(guān)育種工作中需要對(duì)該基因做進(jìn)一步的基因功能分析，以便利用基因編輯等技術(shù)沉默楊樹花發(fā)育相關(guān)基因PagAG2，產(chǎn)生對(duì)營養(yǎng)生長無副作用的少花粉、無花粉表型，從而為從源頭上解決楊樹花粉過敏的問題提供一種有效途徑。