陳雨倩，雷世康，徐剛＊

(1.貴州大學貴州省森林資源與環(huán)境研究中心/貴州省高原山地林木培育重點實驗室/林學院，貴州 貴陽 550025；2.西南大學生命科學學院，重慶 400715)

油菜素內(nèi)酯（BR）是一類甾醇類植物激素，在很低的濃度下即可表現(xiàn)出很強的生理生化效應[1]，能參與調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境脅迫等許多重要的生理過程[2]。BRI1（brassinosteroid insensitive 1）作為BR 的受體，在BR 信號轉導中起重要作用。BRI1 屬于富含亮氨酸重復類受體激酶（LRRRLK），其結構主要由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)激酶區(qū)3 部分組成[3]，其中，胞外區(qū)包括1 個亮氨酸拉鏈基序，1 個N 端信號肽，25 個富含亮氨酸重復單位（LRR）以及在第21 和第22 個LRR 之間有一個由70 個氨基酸組成的ID（island domain）結構[4-5]，該結構是BR 的識別區(qū)域[6]；而BRI1-like3（BRI1-like receptor genes 3）作為BRI1 蛋白家族成員，也參與了BR 信號識別轉導過程[7-8]。

研究發(fā)現(xiàn)，BRI1 在植物花發(fā)育上有著重要的作用，Nie 等在番茄（Solanum lycopersicumL.）中過表達了SlBRI1基因，結果發(fā)現(xiàn)番茄花變大且花瓣和花柱變長[9]；Singh 等發(fā)現(xiàn)，小麥（Triticum aestivumL.）TaBRI1基因在擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）中過表達會導致轉基因擬南芥提前開花[10]；雷世康等發(fā)現(xiàn)，麻瘋樹（Jatropha curcasL.）油菜素內(nèi)酯受體基因JcBRI1介導的BR 途徑可能對麻瘋樹雌花發(fā)育有一定的促進作用[11]。然而，目前關于BRL3 參與花發(fā)育方面的研究還未見報道。

麻瘋樹果實含油率高達60%，是最具潛力的生物柴油原料樹種[12]。然而，由于麻瘋樹結實少、種子產(chǎn)量低等原因嚴重阻礙了其大規(guī)模種植和發(fā)展，而雌雄花比例低（約為1/30～1/10）是導致麻瘋樹結實少的重要原因之一[13]。本研究從麻瘋樹花蕾轉錄組數(shù)據(jù)中篩選到了一個性別差異表達的油菜素內(nèi)酯受體蛋白基因BRI1-like3（BRL3），利用RACE PCR 技術獲得了JcBRL3基因的全長cDNA；通過LC-MS/MS 技術鑒定了JcBRL3的原核表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）；通過在線軟件對JcBRL3 蛋白的結構進行了生物信息學分析；通過qRT-PCR 技術分析了該基因在麻瘋樹花發(fā)育過程中的表達模式，并通過該基因的轉基因煙草對其功能進行了初步驗證。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究材料為貴州省黔西南州貞豐縣采集而來麻瘋樹花蕾，收集完花蕾樣品后將其放進非凍型組織RNA 保護液中。將不同時期的麻瘋樹花蕾在4℃平衡48 h 后分成9類，分別為性別未分化時期、雌花大孢子母細胞時期、雌花大孢子母細胞分裂期、雌花單核胚囊期、雌花胚囊成熟期、雄花小孢子母細胞時期、雄花四分體時期、雄花單核花粉粒時期以及雄花花粉粒成熟期[11]，隨后放入?80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA 提取及JcBRL3基因全長cDNA 克隆 麻瘋樹總RNA 的提取參照Plant RNA Kit（OMEGA）說明書進行。采用SMARTer?RACE 5′/3′ Kit（Clontech）試劑盒進行5′/3′ RACE 擴增，引物見表1。PCR 產(chǎn)物用NuceloSpin Gel and PCR Clean-Up Kit（TaKaRa）膠回收純化后與pUC19載體連接，利用In-Fusion?HD Cloning Kit（TaKaRa）進行轉化，篩選陽性克隆于生工生物工程股份有限公司（上海）測序驗證。將測序成功的5′cDNA 片段、3′cDNA 片段和已知中間片段通過DNAMAN軟件拼接，從而獲得JcBRL3基因全長cDNA 序列。

表1 本研究所用引物及其序列 Table 1 Primers sequences and ways of use in this study

1.2.2 原核表達載體構建及誘導表達 使用限制性內(nèi)切酶Hind III 和NdeI 對目的基因ORF 與原核表達載體pET-30a（+）進行雙酶切，經(jīng)膠回收純化連接后轉化到Escherichia coliDH5α 感受態(tài)細胞中。提取陽性菌株質(zhì)粒進行測序驗證，將測序正確的重組載體（pET-30a-JcBRL3）分別轉化到E.coliBL21（DE3）和E.coliRosetta（DE3）感受態(tài)細胞中。挑取單克隆接種于含卡那霉素（50 μg·mL?1）的LB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，其中，E.coliRosetta（DE3）中需再加入氯霉素（20 μg·mL?1）。次日以1:100 的體積比接種到LB 液體培養(yǎng)基中（抗生素與之前相同），待OD600為0.5～0.8 時，向液體培養(yǎng)基中加入IPTG（終濃度為0.1 mmol·L?1），分別置于15℃和37℃下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間均為16 h，誘導JcBRL3 重組蛋白的表達，再用SDSPAGE 電泳對重組蛋白的表達進行檢測。

1.2.3 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析及鑒定 將SDS-PAGE 凝膠的目的條帶切下裝入離心管中，經(jīng)脫水脫色后使用胰蛋白酶于37℃水浴過夜酶解，之后提出肽段制成凍干粉。取5 μL 含0.1%TFA 的溶液將干粉重新溶解，再按1:1 的比例與α-氰基-4-羥基肉桂酸飽和溶液混合（含50%ACN 和1%TFA），制成上樣液，取1 μL 樣品進行質(zhì)譜點靶鑒定[11]。質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析和蛋白鑒定采用Mascot 2.1（Matrix S cience）軟件進行。

1.2.4 JcBRL3 蛋白結構分析 利用在線工具分別對麻瘋樹JcBRL3 蛋白的信號肽（SignalP 4.1 Server）、跨膜結構（TMHMMServerV.2.0）、磷酸化位點（NetPhos3.1Server）、二級結構（GOR4）、三級結構（SWISS-MODEL）以及保守結構域（NCBI-CDD）進行預測和分析。利用Uniport 數(shù)據(jù)庫檢索JcBRL3 蛋白，通過Clustal X 軟件對與JcBRL3 蛋白含相同結構域的同源蛋白進行多重比對分析。通過MEGA 6.0 軟件的鄰接法（Neighbor-Joining），Poissoncorrection 模型，Bootstrap 檢驗為1 000 來構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5JcBRL3在花發(fā)育過程中的表達分析 按照Plant RNA Kit（OMEGA）試劑盒說明書分別提取麻瘋樹花蕾9 個關鍵發(fā)育時期的RNA，對RNA 濃度和質(zhì)量進行檢測后，取等量RNA 反轉錄形成cDNA。所用熒光定量PCR 引物見表1。以麻瘋樹花蕾未分化時期為對照組，以β-Actin和Tubulin為內(nèi)參基因，每個樣品設置3 個技術重復與3 個生物重復，相對表達量采用2?ΔΔCT法計算，再利用SPSS20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（Oneway ANOVA）。

1.2.6JcBRL3基因過表達載體的構建通過Golden Gate assembly 技術構建JcBRL3基因ORF與載體pBWA（V）KS-ccDB 的植物過表達載體。通過凍融法將pBWA（V）KS-BRL3 質(zhì)粒轉化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404 感受態(tài)細胞，涂板于含卡那霉素（50μg·mL?1）和利福平（20μg·mL?1）的YEP 固體培養(yǎng)上，挑取陽性菌落測序驗證。將測序正確的農(nóng)桿菌菌液劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于YEP 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，第2 天取1 mL 菌液加入到50 mL YEP 液體培養(yǎng)基中，當OD600培養(yǎng)到0.4～0.7 時，將菌液轉移到離心管中，離心收集菌體。

1.2.7 葉盤法轉化煙草及轉基因煙草的分子檢測 用MS 重懸液重懸農(nóng)桿菌，再通過葉盤轉化法將目的基因轉入煙草K326，之后置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)到煙草幼苗形成，再對其進行移植。分別提取野生型煙草和轉基因煙草的DNA 與RNA，進行PCR 與RT-PCR 檢測，判斷目的基因是否整合至煙草抗性植株基因組中以及能否在煙草體內(nèi)轉錄成功，檢測所用引物見表1。

1.2.8 煙草花粉粒電鏡掃描觀察 采集2 株野生型及3 株轉基因煙草處于散粉期的花藥，每株3 個（共15 個），經(jīng)戊二醛和鋨酸雙重固定、脫水干燥、對花粉粒噴金處理后于掃描電鏡（SU8100）下觀察拍照并計算花粉?；温?。

2 結果與分析

2.1 麻瘋樹JcBRL3 基因cDNA 全長序列的克隆

利用RACEPCR技術獲得JcBRL3基因的5'RACE 和3'RACE 片段（圖1），經(jīng)拼接得到cDNA全長4755bp，該基因的開放閱讀框（ORF）為3618 bp，編碼1 205 個氨基酸，分子量為130.71 kDa，等電點（pI）為6.06（GenBank登錄號：MG879232）

圖1 麻瘋樹JcBRL3 基因RACE PCR 電泳檢測Fig.1 The JcBRL3 gene of Jatropha curcas RACE PCR electrophoresis detection

2.2 原核表達載體構建及誘導表達分析

將構建好的原核表達載體pET-30a（+）-JcBRL3 轉化到E.coliBL21（DE3）與E.coliRosetta（DE3）感受態(tài)細胞中，在15℃與37℃溫度下誘導16 h 后，離心收集菌體進行SDS-PAGE 分析。結果表明：JcBRL3 蛋白大約在80 kDa 左右出現(xiàn)目的條帶，與預測的蛋白理論分子量幾乎一致，說明JcBRL3基因在E.coliBL21（DE3）與E.coliRosetta（DE3）中均可成功表達，且在相同的誘導時間，15℃與37℃不同的誘導溫度下，JcBRL3蛋白有同樣的表達情況（圖2）。

圖2 pET-30a-JcBRL3 重組蛋白的SDS-PAGE 檢測Fig.2 SDS-PAGE detection of pET-30a-JcBRL3

2.3 麻瘋樹JcBRL3 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定

質(zhì)譜鑒定結果表明：JcBRL3 在原核表達系統(tǒng)得到表達，共有16 條特異的肽段與JcBRL3 蛋白（A0A067KCE7）氨基酸序列相匹配（表2），序列覆蓋率達到了100%，蛋白分子量為84.7 kDa，蛋白得分為615，這表明JcBRL3基因的表達產(chǎn)物就是JcBRL3 蛋白（A0A067KCE7）。

表2 16 條匹配肽段 Table 2 16 matched peptide segments

2.4 麻瘋樹JcBRL3 蛋白結構分析

信號肽預測結果表明：JcBRL3 蛋白存在信號肽結構，切割位點位于第24 位與第25 位氨基酸之間（圖3A）?？缒そY構預測結果表明：JcBRL3 屬于跨膜蛋白，具有1 個跨膜區(qū)，位于第813 至第835 氨基酸處，推測該蛋白可能定位至細胞膜上，作為膜受體蛋白參與信號轉導（圖3B）。磷酸化位點分析表明：JcBRL3 蛋白有101 個絲氨酸（Ser）、9 個酪氨酸（Tyr）和21 個蘇氨酸（Thr）磷酸化位點（圖4A）。Uniport 數(shù)據(jù)庫分析表明：JcBRL3蛋白結構域位于898～1 175 位氨基酸之間，為絲氨酸/蘇氨酸（Serine/Threonine Kinase）活性位點蛋白激酶家族成員。蛋白二級結構分析發(fā)現(xiàn)：JcBRL3蛋白二級結構主要為無規(guī)則卷曲和α 螺旋，α 螺旋占比25.06%，無規(guī)則卷曲占比56.27%，延伸鏈占比18.67%。（圖4B）。蛋白三維結構分析發(fā)現(xiàn)：JcBRL3 蛋白的三維結構呈彎曲螺旋管狀，是個同源二聚體，以同源二聚體的形式行使功能（圖4C）。

圖3 JcBRL3 蛋白信號肽（A）和跨膜結構（B）預測Fig.3 Signal peptide (A) and transmembrane structure (B) prediction of JcBRL3 protein

圖4 JcBRL3 蛋白磷酸化位點（A）、二級結構（B）和三級結構預測圖（C）Fig.4 Prediction of phosphorylation site (A),secondary structure (B) and tertiary structure (C) of JcBRL3 protein

氨基酸序列分析表明：JcBRL3 蛋白含有多個富含亮氨酸重復序列（LRR），并且具有保守重復序列：LxxLxLxxN/CxL，屬于富含亮氨酸重復序列類受體蛋白激酶（LRR-RLK）（圖5）。對其功能域氨基酸序列多重比對分析發(fā)現(xiàn)：JcBRL3蛋白與蓖麻（Ricinus communisL.）和亞洲棉（Gossypium arboreumL.）的BRI1 蛋白相似性分別達94.6%和93.5%，與油桐（Vernicia fordii）的一個LRR-RLK 相似性高達96.8%，表明JcBRL3蛋白可能與它們具有相似的結構（圖6）。此外，系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示：JcBRL3 與油桐的一個LRRRLK 蛋白聚集在同一個分支上，表明二者具有較高的同源性（圖7）。

圖5 JcBRL3 蛋白保守結構域Fig.5 Conserved domain of JcBRL3 protein

圖6 麻瘋樹JcBRL3 蛋白結構域與其他植物的多序列比對結果Fig.6 Multiple sequence alignment of the JcBRL3 protein domain of Jatropha curcas and other plants

圖7 麻瘋樹JcBRL3 蛋白系統(tǒng)進化樹分析Fig.7 Phylogenetic tree analysis of Jatropha curcas JcBRL3 protein

2.5 麻瘋樹JcBRL3 基因在花發(fā)育過程中的表達分析

通過qRT-PCR 技術檢測了JcBRL3基因在麻瘋樹9 個關鍵花發(fā)育時期的相對表達量。結果顯示：JcBRL3基因的表達量在雌花中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中，在大孢子母細胞時期表達水平最低，在單核胚囊期時表達量達到最高；JcBRL3基因的表達量在雄花中則呈現(xiàn)先上升，后下降，最后再上升的趨勢，其中在小孢子母細胞時期表達量最低，在花粉粒成熟期表達量達到最大且高于其它任何時期（圖8）。這些分析結果表明JcBRL3基因很可能參與了麻瘋樹的雌花單核胚囊期發(fā)育和雄花花粉粒的成熟過程。

圖8 JcBRL3 基因不同發(fā)育時期的表達量Fig.8 The expression level of JcBRL3 gene at different development stages

2.6 轉基因植株的獲得及轉基因煙草的分子檢測結果

采用葉盤法侵染K326 煙草，經(jīng)卡那霉素篩選、共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)及生根培養(yǎng)等過程，成功獲得了一批轉基因煙草。以轉基因煙草基因組DNA為模板進行PCR 擴增，結果顯示：野生型煙草未檢測到目的條帶，9 株轉基因植株能成功檢測到目的條帶，推斷麻瘋樹JcBRL3基因已成功導入K326 煙草基因組中（圖9A）。提取了轉基因煙草的總RNA 合成cDNA 第一鏈，通過RTPCR 擴增表明，JcBRL3基因在轉基因煙草中成功表達（圖9B）。

圖9 轉基因煙草PCR（A）與RT-PCR 檢測（B）Fig.9 PCR (A) and RT-PCR (B) detection of genetically modified tobacco

2.7 轉基因煙草花和花粉粒的形態(tài)學分析

為了進一步研究JcBRL3基因在花發(fā)育的作用，對2 株野生型和3 株轉基因煙草的花和花粉進行形態(tài)結構分析。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)：2 株野生型K326煙草柱頭的位置均高于花藥，而3 株轉基因煙草的柱頭的位置均低于花藥（圖10A、B）。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：2 株野生型煙草花粉部分凹陷空癟，平均畸形率為25.4%（圖10C、D），而3 株轉基因煙草花粉粒基本較為飽滿，凹陷空癟較少，平均畸形率僅為7.1%（圖10E、F）。推測JcBRL3基因可能參與了麻瘋樹雄花發(fā)育。

圖10 野生型煙草K326 和轉基因煙草花及花粉粒的形態(tài)分析Fig.10 Morphological analysis of flowers and pollen grains of wild-type tobacco K326 and transgenic tobacco

3 討論

BR 是一種高活性的植物激素，廣泛存在于各種植物中。BR 能調(diào)控植物細胞伸長和分裂、維管組織分化、種子萌發(fā)和成熟、葉片的形態(tài)建成和衰老、生殖發(fā)育等一系列植物生長發(fā)育過程，還具有增強植物抵抗低溫、高溫、高鹽等非生物逆境的能力[14-15]。在BR 信號傳導過程中，首先細胞膜表面受體BRI1 和輔助受體BAK1（BRI1-associated receptor kinase 1）互作形成具有活性的復合物識別BR 信號；之后BR 信號途徑通過一系列磷酸化和去磷酸化作用，使BZR1（brassinozole-resisent 1）和BES1（BRI1-EMS-SUPOPRESSOR 1）等轉錄因子被激活，從而調(diào)控BR 應答相關基因的表達[16]。而BRL3 受體作為BRI1 受體蛋白家族成員，也參與了BR 的信號轉導[17]。

本研究從麻瘋樹花發(fā)育的轉錄組中篩選到一個性別差異表達的油菜素內(nèi)酯受體蛋白基因BRL3，其開放閱讀框長3 618 bp，編碼1 205 個氨基酸。對其原核表達產(chǎn)物質(zhì)譜鑒定及蛋白結構分析表明：JcBRL3 蛋白包含1 個胞內(nèi)功能域、1 個跨膜區(qū)以及1 個胞外富亮氨酸重復序列結構，且胞內(nèi)區(qū)具有絲氨酸/蘇氨酸活性位點，這與LRR-RLK 的結構一致[18]，初步判定JcBRL3 蛋白是一個LRR-RLK類受體激酶。在三維結構上JcBRL3 與擬南芥BRI1-like1 高度相似；在功能域上JcBRL3 蛋白與亞洲棉BRI1 蛋白、蓖麻BRI1 蛋白及油桐的一個LRRRLK 序列相似性極高，這些結果表明JcBRL3 蛋白很可能屬于BRI1 家族蛋白。

目前，對于BRL3基因的研究還十分有限，且大都集中于韌皮部形成、維管分化及抗旱性方面[19-20]，其參與生殖發(fā)育調(diào)控的研究尚未涉及。本研究通過對JcBRL3基因在麻瘋樹花發(fā)育過程中的表達模式分析發(fā)現(xiàn)，JcBRL3的表達水平在麻瘋樹雄花花粉粒成熟期達到最高，表明其可能參與了雄花花粉粒成熟的過程；將JcBRL3基因導入煙草中過量表達發(fā)現(xiàn)，野生型煙草柱頭位置高于花藥，而轉基因煙草柱頭位置低于花藥，且其花粉粒較飽滿畸形率低，推測這種差異可能是JcBRL3基因參與煙草雌蕊發(fā)育導致的。雖然目前的研究尚未直接表明BRL3 能調(diào)控雄蕊發(fā)育，但大量研究證明BR在植物雄性器官發(fā)育方面有不可替代的作用。BR能促進番茄[21]、扁桃（Prunus dulcisL.）[22]、水稻（Oryza sativaL.）[23]及擬南芥[24]等植物的花粉萌發(fā)，而BR 信號傳導或生物合成缺陷會導致花粉發(fā)育缺陷和雄蕊縮短[25]。BR 缺陷與不敏感株系如：cpd、dwf4和bri1皆表現(xiàn)為雄性不育[26-27]，而導致這類植株雄性不育的主要原因是花絲變短[28]、花粉數(shù)量減少以及絨粘層和小孢子發(fā)育異常[25]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中BR 可以通過控制MS1、MS2、MYB103、TDF1和SPL/NZZ基因的表達來調(diào)控雄蕊的發(fā)育，這種調(diào)控能夠完成的關鍵在于這些基因的啟動子上含有BES1 轉錄因子的結合位點[25]。已有研究證明BRL3基因的表達能修復bri1突變體的表型缺陷[7]，并發(fā)現(xiàn)BES1 轉錄因子能與BRL3啟動子上的BRRE 相結合從而調(diào)控BRL3[19]，這暗示BRL3的表達很可能通過調(diào)控雄蕊發(fā)育來修復bri1突變體的雄性不育。因此，推測在煙草、擬南芥和麻瘋樹中極可能存在相同的BR 調(diào)控途徑，JcBRL3基因的過量表達導致煙草花絲伸長、花粉?；温式档褪呛苊黠@的BR 增強表型，這種BR 增強型很可能是由BES1 轉錄因子的調(diào)控導致的，而這種推測是否屬實還需進一步研究證明。

4 結論

本研究通過RACE PCR 技術成功從麻瘋樹花蕾中獲得了JcBRL3基因的cDNA 全長序列，該基因開放閱讀框長3 618 bp，編碼1 205 個氨基酸；原核表達產(chǎn)物為JcBRL3 蛋白，預測屬于跨膜蛋白，含有多個LLR；qRT-PCR 分析表明，其可能參與了麻瘋樹雌花單核胚囊期和雄花花粉粒成熟的發(fā)育過程；此外，其轉基因煙草花藥位置高于柱頭，花粉粒也較為飽滿，進一步表明JcBRL3可能參與了麻瘋樹雄花發(fā)育。而關于JcBRL3 和其介導的BR 信號是如何參與調(diào)控麻瘋樹花發(fā)育的還需進一步的研究來揭示。