于曉池，李鳳，歐陽，張鵬，郭小龍，肖遙，趙秋玲，楊桂娟,5，王軍輝,5，麻文俊,5＊

(1.林木遺傳育種國家重點實驗室，國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.小隴山林業(yè)科學(xué)研究所，甘肅 天水 741002；4.西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650000；5.國家林業(yè)和草原局楸樹國家創(chuàng)新聯(lián)盟，北京 100091)

隨著種質(zhì)資源收集與保存的發(fā)展，種質(zhì)資源庫不斷擴大，這為種質(zhì)保存、評價和利用帶來了一定難度[1]。為此，F(xiàn)rankel 等提出了核心種質(zhì)的概念[2]。其目的是以最少的種質(zhì)資源數(shù)量最大程度的代表原種質(zhì)的遺傳多樣性，從而在遺傳資源保護的過程中，大幅降低保存成本，提高效率。同時便于開展資源評價研究，減少工作量，降低篩選和挖掘難度[3]，促進種質(zhì)資源的合理開發(fā)與利用[4-5]。目前，國內(nèi)外已經(jīng)構(gòu)建出了多種農(nóng)作物的核心種質(zhì)[6-8]，木本植物也得到了越來越多的重視，已成功構(gòu)建核心種質(zhì)的樹種包括蘋果[9-10]（MaluspumilaMill.）、獼猴桃[11]（Actinidia chinensisPlanch.）、茶 樹[12]（Camellia sinensis(L.) O.Ktze.）、刺槐[13]（Robinia pseudoacaciaL.）、白樺[14]（Betula platyphyllaSuk.）、美洲黑楊[15]（Populus deltoidesMarsh.）和水青樹[16]（Tetracentron sinenseOliv.）等。

灰楸（Catalpa fargesiiBur.）為紫葳科（Bignoniaceae）梓屬（Catalpa）喬木，材質(zhì)優(yōu)良，木材細致，且根系發(fā)達，具有很強的固土、抗風(fēng)、耐旱耐寒能力，為我國特有的珍貴用材樹種[17-18]；其生態(tài)分布幅度較大，主要分布于陜西省、甘肅省、河北省、河南省等地[18]。以往的研究都集中在灰楸的種子發(fā)芽特性[19]、組織培養(yǎng)[20]、嫁接育苗[20-21]、抗性評價[22-23]、種質(zhì)多樣性研究[18]及優(yōu)良種質(zhì)的選擇[24]方面。李秀蘭等[25]曾將267 個灰楸種質(zhì)基于生長和葉部性狀，通過歐氏距離和離差平方和法，進行隨機取樣，初步構(gòu)建了63 份核心種質(zhì)。然而，在核心種質(zhì)的構(gòu)建過程中，不同構(gòu)建策略的效果不同。如在選擇遺傳距離時，所測性狀量綱單位不一致會影響歐氏距離，但不影響馬氏距離[26]；在選擇取樣方法時，隨機取樣法能更好的保留原始種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)，但不利于核心種質(zhì)的代表性和多樣性；偏離度取樣法能保留原種質(zhì)的變異程度和遺傳多樣性；優(yōu)先取樣法具有保留特殊或有價值種質(zhì)的優(yōu)點[27-28]。因此，選擇最適的核心種質(zhì)構(gòu)建策略尤為重要。

本研究對11～13 年生灰楸的生長、葉部和材性性狀的遺傳變異與多樣性進行分析，基于不同遺傳距離、不同系統(tǒng)聚類方法、不同取樣方法和取樣比例構(gòu)建灰楸初級核心種質(zhì)資源，并對不同方法構(gòu)建的核心種質(zhì)進行評價，最終選擇最適合灰楸的核心種質(zhì)構(gòu)建策略，得出較為可靠的灰楸初級核心種質(zhì)群體，對解決其種質(zhì)資源保存成本較高問題，促進灰楸種質(zhì)資源的鑒定和有效利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2007 年，在甘肅省、陜西省、山西省和河南省開展灰楸種質(zhì)資源全面調(diào)查收集，收集材料為1 年生和2 年生小枝，共收集267 株優(yōu)良單株。2008年，在甘肅省天水市麥積區(qū)嫁接擴繁（無性系化），每株嫁接擴繁36 株。2009 年，在甘肅省小隴山林業(yè)實驗局林業(yè)科學(xué)研究所沙壩實驗基地營建種質(zhì)資源對比試驗林，采用隨機完全區(qū)組設(shè)計，4 次重復(fù)，共200 份種質(zhì)，其中，甘肅省163 份、陜西省4 份、山西省22 份、河南省11 份。

1.2 試驗地概況

試驗地位于甘肅省天水市麥積區(qū)（105°53′24.468″ E，4°34′14.484″ N），隸屬于甘肅省小隴山林業(yè)實驗局林業(yè)科學(xué)研究所。該地地處秦嶺西段，土壤為黃綿土，年平均氣溫10.7℃，≥ 10℃ 積溫3 359℃，極端高溫39℃，極端低溫?19.2℃，無霜期約190 d，年降水量600 mm 以上。

1.3 方法

1.3.1 指標(biāo)測定 分別于2018 年（11 年生）測定灰楸種質(zhì)的葉部性狀，2020 年（13 年生）測定灰楸種質(zhì)的生長和材性性狀，每份種質(zhì)選擇生長正常的3 個分生株，測定指標(biāo)包括樹高、胸徑、冠幅、Pilodyn 值、彈性模量、葉長、葉寬、葉長寬比、葉柄長和SPAD 值，共10 項指標(biāo)。樹高和胸徑的測定精確度分別為0.01 m 和0.1 cm；測定東西冠幅和南北冠幅，取平均值為單株冠幅（0.01 m）[29]；在樹高1.3 m 處，使用Pilodyn（6J，PROCEQ，Switzerland）分別測定南北向的Pilodyn 值[30-31]，取平均值作為單株測定值（0.01 mm）；使用Director ST300 活立木力學(xué)性質(zhì)測定儀進行彈性模量的測定（0.01 GPa）[32-33]；每株選擇倒數(shù)第5～6 輪完全展開、無病蟲害的3 片成熟南向葉，用直尺測量葉長度（0.1 cm）、葉寬度（0.1 cm）和葉柄長度（0.1 cm），計算葉長寬比（0.1），用SPAD-502 測定葉綠素含量（0.01）[25]。

1.3.2 遺傳距離計算 參照Hu 等[28]的逐步聚類方法進行聚類，遺傳距離的計算分別采用歐氏距離、切比雪夫距離、絕對值距離、蘭氏距離和明科夫斯基距離。

1.3.3 系統(tǒng)聚類方法 參照魏志剛等[14]的方法，分別采用離差平方和法、最短距離法、類平均法、最長距離法、相似法和中間距離法6 種系統(tǒng)聚類方法進行系統(tǒng)聚類。

1.3.4 取樣方法 根據(jù)劉遵春等[27]提出的隨機取樣法、優(yōu)先取樣法和偏離度取樣法進行取樣。

1.3.5 取樣比例 按照10%、15%、20%、25%和30%的比例進行取樣。

1.3.6 核心種質(zhì)的評價 按照Hu 等[28]的方法，計算均值差異百分率（MD）、方差差異百分率（VD）、極差符合率（CR）和變異系數(shù)變化率（VR）來評價核心種質(zhì)的代表性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2013 整理和分析數(shù)據(jù)，用SAS 9.4 進行巢式設(shè)計方差分析，用SPSS 16.0 軟件進行單因素方差分析，用RStudio 進行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、聚類分析和Shannon Weaver 遺傳多樣性指數(shù)（H'）的計算。

變異系數(shù)（CV）=標(biāo)準(zhǔn)差（SD）/無性系平均值（）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰楸無性系遺傳變異和遺傳多樣性分析

參試的200 個灰楸無性系的生長、葉部和材性性狀分析結(jié)果（表1)表明：10 個性狀在無性系間均達極顯著差異，灰楸的樹高平均值為6.37 m，變幅為3.60～14.90 m；胸徑平均值為9.4 cm，變幅為4.3～21.5 cm；冠幅平均值為2.64 m，變幅為1.13～6.05 m。樹高、胸徑和冠幅的變異系數(shù)（CV）分別為18.49%、22.57%和30.39%，遺傳多樣性指數(shù)（H'）分別為1.778、1.908 和1.915。Pilodyn 值和彈性模量的平均值分別為14.01 mm和9.22 GPa，CV分別為12.09%和15.55%，H'分別為1.910 和2.003?；议钡娜~部性狀中，CV均介于9.66%～18.09%之間，H'均大于1.988。因此，灰楸種質(zhì)各性狀均存在豐富的遺傳變異，遺傳多樣性分布范圍較廣，具有核心種質(zhì)構(gòu)建的必要性和可能性。

表1 灰楸無性系遺傳變異和遺傳多樣性Table 1 Genetic variation and genetic diversity of C.fargesii clones

2.2 不同遺傳距離、系統(tǒng)聚類方法、取樣方法和抽樣比例構(gòu)建灰楸核心種質(zhì)的結(jié)果比較

2.2.1 不同遺傳距離構(gòu)建灰楸核心種質(zhì)的結(jié)果比較 基于歐氏距離、切比雪夫距離、絕對值距離、蘭氏距離和明科夫斯基距離5 種遺傳距離，采用離差平方和法進行聚類，以30%的抽樣比例隨機取樣，構(gòu)建出的核心種質(zhì)遺傳差異見表2。僅基于蘭氏距離構(gòu)建出的核心種質(zhì)方差差異百分數(shù)（VD）大于0.00%，然而其均值差異百分率（MD）為30.00%，不符合核心種質(zhì)（MD）低于20.00%的要求，因此，蘭氏距離不適于灰楸核心種質(zhì)的構(gòu)建。基于切比雪夫距離和明科夫斯基距離構(gòu)建出的核心種質(zhì)MD為20.00%；運用歐式距離和絕對值距離構(gòu)建出的核心種質(zhì)MD為0.00%，各性狀較原始種質(zhì)均無顯著差異。將歐氏距離和絕對值距離進行比較發(fā)現(xiàn)，歐氏距離構(gòu)建的核心種質(zhì)的極差符合率（CR）（89.14%）和變異系數(shù)變化率（VR）（114.09%）均大于絕對值距離的CR（87.52%）和VR（113.07%）。綜合分析表明，基于歐式距離構(gòu)建出的核心種質(zhì)在還原原種質(zhì)均值的前提下，極大的保留了原種質(zhì)的極差，提高了變異系數(shù)，更加適用于構(gòu)建灰楸的核心種質(zhì)。

表2 基于不同遺傳距離構(gòu)建的核心種質(zhì)與原種質(zhì)差異百分率 Table 2 Percentage difference between core collection and original collection based on different genetic distance

2.2.2 不同系統(tǒng)聚類方法構(gòu)建灰楸核心種質(zhì)的結(jié)果比較 在采用歐氏距離的前提下，基于離差平方和法、最短距離法、類平均法、最長距離法、相似法和中間距離法6 種系統(tǒng)聚類方法，以30%的抽樣比例進行隨機取樣，構(gòu)建出的核心種質(zhì)遺傳差異見表3?；陔x差平方和法、最短距離法、類平均法和最長距離法構(gòu)建的核心種質(zhì)MD均為0.00%；相似法和中間距離法的MD為20.00%?；谧疃叹嚯x法構(gòu)建出的核心種質(zhì)CR最大，為93.51%，其次為類平均法（89.53%）和離差平方和法（89.14%）。運用最短距離法構(gòu)建的核心種質(zhì)VR最大，為120.35%，其次為類平均法（113.10%）和最長距離法（108.95%）。因此，最短距離法更適用于構(gòu)建灰楸核心種質(zhì)。

2.2.3 不同取樣方法和取樣比例構(gòu)建灰楸核心種質(zhì)的結(jié)果比較 采用歐氏距離，最短距離法聚類后，通過隨機取樣法、優(yōu)先取樣法和偏離度取樣法3 種方法進行取樣，取樣比例分別為10%、15%、20%、25%、30%，構(gòu)建的核心種質(zhì)遺傳差異見圖1。結(jié)果表明：采用隨機取樣法時（圖1A），僅在取樣比例為10%時，VD>0.00%，此時VR達到最大值151.46%，MD為10.00%。因此，隨機取樣法應(yīng)選擇10%的取樣比例。在采用優(yōu)先取樣法時（圖1B），5 種取樣比例下，VD均為0.00%，CR均為100.00%；在抽樣比例為15%、25%、30%時，MD為0.00%；抽樣比例越大，VR值越小。因此，進行優(yōu)先取樣法時應(yīng)選擇15%的取樣比例。采用偏離度取樣法時（圖1C），在抽樣比例為15%時，MD最小，為10.00%；VD最大，為40.00%；此時CR和VR分別為91.95%和136.96%。因此，偏離度取樣法構(gòu)建核心種質(zhì)時應(yīng)選擇15%的取樣比例。綜合分析可知，采用偏離度取樣法，取樣比例為15%時，不僅能夠較好的還原原種質(zhì)的均值和極差，提高變異系數(shù)，還顯著增加了核心種質(zhì)的方差。

圖1 不同取樣比例構(gòu)建的核心種質(zhì)與原種質(zhì)差異百分率Fig.1 The difference percentage between core collection and original collection constructed by different sampling proportion

2.3 核心種質(zhì)構(gòu)建

采用歐式距離和最短距離系統(tǒng)聚類法，以15%的取樣比例進行偏離度取樣法構(gòu)建的包括30 個無性系的灰楸初級核心種質(zhì)，MD為10.00%、VD為40.00%、CR為91.95%、VR為136.96%，最能代表原有的種質(zhì)群體。

將各性狀的均值進行分析（表4）表明：各性狀核心種質(zhì)的均值均略大于原種質(zhì)的均值。將原始種質(zhì)和核心種質(zhì)在各省中的分布情況進行分析，結(jié)果（圖3）顯示：原始種質(zhì)中，甘肅省的種質(zhì)份數(shù)占比最大，為81.50%；陜西省、山西省和河南省的種質(zhì)份數(shù)占比分別為2.00%、11.00%和5.50%。在筆者初步構(gòu)建的核心種質(zhì)中，甘肅省的種質(zhì)份數(shù)依舊最大，但低于原始種質(zhì)的占比，為66.67%；陜西省、山西省和河南省的核心種質(zhì)份數(shù)占比均高于原始種質(zhì)，分別為3.33%、13.33%和16.67%，表明陜西省、山西省和河南省的種質(zhì)具有較大的變異程度。

表4 原始種質(zhì)和核心種質(zhì)均值Table 4 The mean value of original germplasm and core germplasm

圖3 原始種質(zhì)和核心種質(zhì)在4 省分布比例Fig.3 Distribution proportion of original germplasm and core germplasm in four provinces

3 討論

3.1 構(gòu)建灰楸初級核心種質(zhì)方法的確定

通過聚類法構(gòu)建核心種質(zhì)時，首先要計算種質(zhì)間的遺傳距離，再進行聚類分析，然后通過一定的取樣比例和取樣策略，進行核心種質(zhì)的抽取[26-27]。遺傳距離是度量樣品間遺傳相似性的綜合數(shù)量指標(biāo)，不同遺傳距離的計算方法直接影響了聚類結(jié)果和核心種質(zhì)的構(gòu)建[28]。目前，先通過原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化以排除各性狀量綱的不同對種質(zhì)材料的影響再采用歐式距離構(gòu)建核心種質(zhì)的方法被廣泛應(yīng)用。如劉遵春等將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，對不同距離構(gòu)建的新疆野蘋果（Malus sieversii（Ledeb.）Roem.）核心種質(zhì)進行比較，發(fā)現(xiàn)歐式距離要優(yōu)于馬氏距離[27]。在棗樹（Ziziphus jujubaMill.）[34]和棉花（Gossypium hirsutumLinn.）[35]核心種質(zhì)構(gòu)建的研究中，同樣都是采用歐式距離的效果更好。本研究將原始數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化后，發(fā)現(xiàn)基于歐式距離構(gòu)建的核心種質(zhì)具有最小的均值差異百分率，較大的極差符合率和變異系數(shù)變化率。因此，歐氏距離更適于灰楸核心種質(zhì)的構(gòu)建。然而，基于歐式距離、切比雪夫距離、絕對值距離和明科夫斯基距構(gòu)建的核心種質(zhì)方差差異百分數(shù)均為0.00%，這可能是由于在比較不同遺傳距離時，本研究統(tǒng)一采用離差平方和法進行聚類，以30%的抽樣比例進行隨機取樣，而隨機取樣法不利于保持原種質(zhì)的變異程度和多樣性[28]。

核心種質(zhì)受聚類方法的影響[14]，通過對不同聚類方法構(gòu)建的核心種質(zhì)進行差異分析能達到最優(yōu)結(jié)果。魏志剛等對白樺核心種質(zhì)進行初步構(gòu)建，比較了8 種不同聚類方法，認為最短距離法構(gòu)建的核心種質(zhì)最具代表性[14]。Zhang 等發(fā)現(xiàn)，離差平方和法最適合芝麻（Sesamum indicumLinn.）核心種質(zhì)的構(gòu)建[36]。劉遵春等研究證明，最短距離法是構(gòu)建新疆野蘋果核心種質(zhì)最好的系統(tǒng)聚類方法[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，最短距離法的均值差異百分率為0.00%，極差符合率和變異系數(shù)變化率均最大，因此，歐氏距離結(jié)合最短距離法進行聚類，最適合灰楸核心種質(zhì)的構(gòu)建。

取樣方法和取樣比例是進一步保持核心種質(zhì)遺傳多樣性的重要環(huán)節(jié)[8]。目前常用的取樣策略包括隨機取樣法、優(yōu)先取樣法和偏離度取樣法，取樣比例一般為原始種質(zhì)的5%～30%[36]。Hu 等研究發(fā)現(xiàn)，隨機取樣法能夠保留原始種質(zhì)的遺傳多樣性；優(yōu)先取樣法既能獲得各性狀的極值，又能保持原始種質(zhì)的遺傳變異結(jié)構(gòu)；偏離度取樣法選擇的種質(zhì)具有較大的偏離程度，能夠保留原始種質(zhì)的遺傳變異豐富度[28]。在對新疆野蘋果的核心種質(zhì)進行構(gòu)建時，發(fā)現(xiàn)優(yōu)先取樣法和偏離度取樣法均具有最高的方差差異百分數(shù)、極差符合率和變異系數(shù)變化率，保留了原種質(zhì)的遺傳變異。但優(yōu)先取樣法具有保留特殊或有價值特性種質(zhì)的優(yōu)點，略優(yōu)于偏離度取樣法[27]。這與在棉花[26]、水稻[36]（Oryza sativaL.）、白樺[14]和水青樹[16]上的研究結(jié)果一致。而在對苦瓜[37]（Momordica charantiaL.）、辣 椒[38]（Capsicum annuumL.）和櫻桃番茄[39]（Lycopersivon esculentumMill.）等植物的研究中發(fā)現(xiàn)，采用偏離度取樣法構(gòu)建的核心種質(zhì)具有較大的遺傳差異，更適用于核心種質(zhì)的構(gòu)建。在本研究中，以15%取樣比例進行偏離度取樣法，不僅能較好的還原原種質(zhì)的均值和極差，還能提高變異系數(shù)，不改變原種質(zhì)的變異水平。因此，采用歐式距離和最短距離法進行聚類，以15%的取樣比例通過偏離度取樣法構(gòu)建的包括30 個無性系的灰楸初級核心種質(zhì)最能代表原有的種質(zhì)群體。

3.2 灰楸初級核心種質(zhì)結(jié)果分析

本研究基于灰楸無性系11 年生的葉部性狀和13 年生的生長和材性性狀，通過歐氏距離、最短距離系統(tǒng)聚類法，以15%的取樣比例進行偏離度取樣構(gòu)建的30 個核心種質(zhì)，MD為10.00%、VD為40.00%、CR為91.95%、VR為136.96%，不僅還原了原種質(zhì)的均值和極差，提高原種質(zhì)的變異系數(shù)，保留變異程度，還略增大了核心種質(zhì)各性狀的均值。在各省的種質(zhì)分布比例上，核心種質(zhì)與原種質(zhì)相差不大，陜西省、山西省和河南省略有增加，表明上述3 省的種質(zhì)變異程度較大，甘肅省較小。這可能是由于在甘肅省取樣較為密集，種質(zhì)間差異較小。另一個原因可能是，4 省采集的種質(zhì)均栽植于甘肅省天水市麥積區(qū)，甘肅省的種質(zhì)更能適應(yīng)當(dāng)?shù)氐臍夂颦h(huán)境。而經(jīng)過10 a 以上的生長，來自于陜西省、山西省和河南省的種質(zhì)受到現(xiàn)栽植地的環(huán)境條件影響，發(fā)生了適應(yīng)性變異。

李秀蘭曾將267 份1 年生灰楸無性系基于生長性狀和葉部性狀，通過歐氏距離和離差平方和法，進行隨機取樣，初步構(gòu)建了63 份核心種質(zhì)[25]。本研究對灰楸核心種質(zhì)的構(gòu)建進行了優(yōu)化。在種質(zhì)材料方面，以灰楸中齡林為材料，相較于幼齡林，中齡林對立地環(huán)境更加適應(yīng)，具有更強的穩(wěn)定性[40]。在測量性狀方面，灰楸為我國珍貴的用材樹種，木材材性是衡量其優(yōu)良性的一個重要指標(biāo)，因此，本研究加入Pilodyn 值和彈性模量兩種材性性狀?；谏L、葉片大小和形狀以及木材質(zhì)量3 個方面構(gòu)建的核心種質(zhì)結(jié)果更可靠。在構(gòu)建方法上面，本研究采用了5 種距離計算方法、6 種系統(tǒng)聚類方法、5 種取樣比例和3 種取樣方法構(gòu)建灰楸初級核心種質(zhì)資源，并利用均值差異百分率、方差差異百分率、極差符合率和變異系數(shù)變化率對不同方法構(gòu)建的核心種質(zhì)進行評價，最終挑選的核心種質(zhì)更具代表性。所獲核心種質(zhì)中胸徑、冠幅、葉長、葉寬、葉長寬比、葉柄長和彈性模量高于原均值的種質(zhì)份數(shù)占比提高，Pilodyn 值高于原均值的種質(zhì)份數(shù)占比則降低。因此，本研究構(gòu)建出的灰楸初級核心種質(zhì)也在一定程度上提高了核心種質(zhì)的生長和材性水平。

4 結(jié)論

灰楸種質(zhì)表型性狀存在豐富的遺傳變異，遺傳多樣性分布范圍較廣，運用歐氏距離、最短距離系統(tǒng)聚類法、以15%的取樣比例進行偏離度取樣構(gòu)建出30 個核心種質(zhì)，不僅還原了原種質(zhì)的均值、極差和變異程度，還提高了種質(zhì)的變異系數(shù)，略提高了核心種質(zhì)的生長和材性水平，為降低種質(zhì)資源保存成本，促進灰楸種質(zhì)資源的鑒定和有效利用奠定了基礎(chǔ)。