呂中睿，劉宏，張國昀，于立洋，羅紅梅，何彩云＊

(1.國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室，中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2.中國林業(yè)科學研究院沙漠林業(yè)實驗中心，內蒙古 磴口 015200)

沙棘(Hippophae rhamnoidesL.)屬胡頹子科多年生落葉灌木、小喬木或喬木[1]，原產(chǎn)于俄羅斯、中國和北歐[2]。沙棘營養(yǎng)極高，富含維生素、類胡蘿卜素、脂類、甾醇和類黃酮[3]。類黃酮是植物最主要的次生代謝物之一[4]，在沙棘葉和果實中大量存在，具有降血糖、降血脂、抗衰老、抗氧化等多種生理活性[5]，在食藥保健領域受到廣泛關注。類黃酮在沙棘中通常以糖基衍生物的形式出現(xiàn)[6]，Teleszko 等研究發(fā)現(xiàn)，黃酮醇糖苷是沙棘中最豐富的酚類化合物[7]。然而，類黃酮在沙棘中的糖基化作用機理仍不清楚。

糖基化修飾是類黃酮生物合成的關鍵修飾之一，這種修飾促進類黃酮的溶解性、穩(wěn)定性和生物活性，以防御和適應環(huán)境變化[8]。植物次生代謝物的糖基化是由UDP 糖基轉移酶(UGT,UDPglycosyltransferase)催化的[9]，可以催化糖基加到底物的特定位置或特定區(qū)域。植物中UGT 基因長度約為1 000～1 500 bp，UGT 基因在植物中保守性較強，尤其在終止密碼子附近有一段編碼44 個氨基酸的極強保守序列，稱為PSPG box[10]，可以作為挑選UGT 基因的依據(jù)。作為模式植物，擬南芥UGT 家族最早被研究，Li 等發(fā)現(xiàn)，擬南芥中共有107 個成員，根據(jù)序列同源性被劃分為 14 個系統(tǒng)發(fā)育組，命名為A-N[11]。隨后，在毛果楊、玉米、葡萄、蘋果和茶等植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了O、P、Q和 R組[12-13]。近期，Wilson 等分析了65 個全序列的植物基因組，應用嚴格的標準來選擇候選的UGTs，并進行系統(tǒng)發(fā)育分析，重建了被子植物原有的18 個系統(tǒng)發(fā)育組（A-R）和OG[14]。在高等植物的進化過程中，A、D、E、G 和L 這5 個組群擴展較快，E組擴展最快，不同物種中E組中的基因占UGT 家族的 20%～25%[15]。

迄今，多個物種中的數(shù)百個UGT 基因已經(jīng)被克隆出來，并對其功能進行了表征。如Lim 等以槲皮素為底物，對擬南芥中91 個糖基轉移酶進行了鑒定，其中，29 個能夠催化相關的糖基化反應[16]。Trapero 等對番紅花中糖基轉移酶功能驗證發(fā)現(xiàn)，UGT707B1 可以催化山奈酚、槲皮素生成相應的糖苷衍生物[17]。然而，與植物基因組中UGT 基因龐大的數(shù)量相比，功能被驗證的特征蛋白的數(shù)量仍然相對較低[15]。

本研究基于沙棘基因組信息，對UGT 基因家族進行了鑒定和分析，共鑒定到89 個沙棘UGT 基因成員，劃分為16 個系統(tǒng)發(fā)育分組。本研究對沙棘UGT 基因家族的蛋白理化性質、亞細胞定位、染色體分布、基因結構和基因復制進行了預測分析。在此基礎上，分析了UGT 基因在沙棘果實不同發(fā)育時期的表達模式，并通過實時熒光定量PCR 進行驗證，對日后解析沙棘類黃酮糖苷生物合成機制及其積累模式奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 沙棘UGT 基因家族的鑒定

113 條擬南芥UGT 氨基酸序列下載自擬南芥基因組網(wǎng)站（https://www.arabidopsis.org/），UGT基因家族保守結構域隱馬爾科夫模型HMM 文件（PF00201，UDPGT.HMM）下載自Pfam（http://pfam.xfam.org/）。首先以擬南芥UGT 氨基酸序列作為query 序列，使用BLASTP 程序搜索沙棘基因組蛋白數(shù)據(jù)庫（未發(fā)表），evalue=1 e?15，構建沙棘候選UGT 數(shù)據(jù)集1。通過HMM 文件對沙棘基因組蛋白數(shù)據(jù)庫進行hmmsearch 搜索，evalue=1 e?20，提取結果文件中比對一致的序列通過hmmbuild程序構建沙棘UGT 保守結構域隱馬爾科夫模型，并再次進行hmmsearch，構建沙棘候選UGT 數(shù)據(jù)集2。合并2 個數(shù)據(jù)集，提交至CDD、Pfam 和SMART 數(shù)據(jù)庫驗證保守結構域，然后手動刪除氨基酸序列小于250 aa 和PSPG box 不完整的序列。

1.2 UGT 基因家族理化性質和亞細胞定位分析

利用Expasy server 的ProtParam 工具（https://web.expasy.org/protparam/）計算沙棘中各UGT 蛋白的分子量、氨基酸長度和等電點。使用DeepLoc（http://www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/）預測沙棘UGT 蛋白的亞細胞定位。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

通過MUSCLE 對沙棘UGT 蛋白序列進行多重序列比對（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/），刪除gap 區(qū)域。利用MEGA 7.0 軟件，基于比對后的UGT 蛋白序列，采用neighbor-joining 法，設置bootstrap 值為1000，構建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

1.4 保守序列和基因結構分析

通過GSDS 在線工具(v2.0 http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)，輸入沙棘基因注釋GFF 文件，將沙棘UGT 的編碼序列與其對應的基因組序列進行比較，展示沙棘UGT 的外顯子內含子信息。為了比較沙棘UGT 的差異，本研究利用MEME 在線工具對沙棘UGT 蛋白的保守基序進行分析，參數(shù)設置為：site distribution:zero or one occurrence (of a contributing motif site) per sequence,maximum number of motifs:10,and optimum motif width ≥ 6 and ≤ 60。

1.5 染色體定位和基因復制分析

通過自建腳本，從沙棘基因組注釋文件中提取沙棘UGT 位置信息。使用MCScanX 軟件分析基因加倍事件。染色體定位和基因加倍信息通過Circos 軟件繪圖展示。

1.6 表達模式分析

2 個沙棘亞種（中國沙棘，“FN”；蒙古沙棘，“XY”）不同果實發(fā)育階段的轉錄組數(shù)據(jù)下載自沙棘基因組數(shù)據(jù)庫，使用每百萬映射reads 的千堿基片段（FPKM）來估計表達水平。利用TBtools軟件對數(shù)據(jù)進行標準化和聚類，并繪制表達量熱圖[19]。

實時熒光定量PCR 分析所用樣品為中國林業(yè)科學研究院沙漠林業(yè)實驗中心種植的蒙古沙棘花后21、63、91 d 果實，每批樣品設置3 個生物學重復，采樣后迅速使用液氮速凍，并置于?80℃?zhèn)溆谩？俁NA 的提取采用天根公司RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒，參照使用說明書的方法進行提取。反轉錄試劑盒為TAKARA 公司的PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit，并按照使用說明進行。用primer Premier 5.0 軟件對選定的9 個HrUGTs 進行特異性引物設計，引物信息見表1。實時熒光定量PCR 反應體系按照TAKARA公司TB Green?Premix Ex Taq ? II 試劑盒使用說明書配置，PCR 反應程序為：95℃ 30 s 預變性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán)擴增。使用2?ΔΔCT法計算HrUGT 基因的相對表達水平[20]，使用Origin 8.0 軟件作圖。

表1 實時熒光定量PCR 引物信息表Table 1 The primer sequence for quantitative real-time PCR (RT-qPCR)

2 結果分析

2.1 沙棘UGT 基因家族成員鑒定

對利用BLASTP 和hmmsearch 兩種方法搜索沙棘基因組蛋白數(shù)據(jù)庫獲得的110 個候選沙棘UGT 基因成員，經(jīng)過驗證保守結構域和手動篩選，共鑒定出89 個沙棘UGT 基因。蛋白理化性質分析結果（表2）表明：沙棘UGT 家族各成員蛋白質長度為266～533 aa，平均長度462 aa，蛋白理論分子量平均值為52.00 KDa，平均等電點5.89。82 個沙棘UGT 家族成員定位于細胞質，6 個成員定位于線粒體，1 個成員定位于質體。

表2 沙棘UGT 基因家族成員信息 Table 2 The information of HrUGTs

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于蛋白同源序列的相似性進行功能預測是基因功能研究的重要手段，本研究以沙棘和擬南芥、玉米、山柳蘭等植物UGT 蛋白序列為基礎，構建了系統(tǒng)發(fā)育樹。圖1 表明：89 個沙棘UGT 可被聚類為16 個先前鑒定的類群[13]，沙棘UGT 在O組和Q組均沒有分布，大部分沙棘UGT 聚集在E（8）、G（8）、D（11）、L（16）和A（17）組。多序列比對分析表明：89 個沙棘UGT 的C 端序列均存在PSPG box，并在 1（W）、4（Q）、8（L）、10（H）、12（S/A）、14（G）、16（F）、19-24（HCGWNS）、27（E）、32-34（GVP）、39（P）、43（D/E）、44（Q）位點高度保守。

圖1 沙棘、擬南芥、玉米和山柳蘭UGT 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of UGT proteins of sea buckthorn,Arabidopsis,maize and mouse-ear hawkweed

2.3 蛋白基序和基因結構分析

為了進一步確定沙棘UGT 家族的保守結構域特征，利用在線工具MEME 創(chuàng)建了10 個基序，并從1 到10 列出（圖2）?；? 和基序3為UGT 家族保守結構域PSPG box。La4g1035、La5g0208、La11g1107、La5g1327、La4g1118、La10g1561 和La10g1574 由于1 或2 個氨基酸的插入并沒有匹配到基序3，在后續(xù)的分析中發(fā)現(xiàn)，這些基因除La5g0208 外均未發(fā)現(xiàn)表達或表達量極低。A組和R組成員均未發(fā)現(xiàn)基序9 的存在，這一基序中3 個氨基酸（GSS）之前被認為在單糖基轉移酶中高度保守[21]。

圖2 沙棘UGT 家族基因蛋白基序及基因結構的構建Fig.2 Gene structure and architecture of conserved protein motifs in UGT family genes of sea buckthorn

內含子外顯子結構的多樣性通常在基因家族的進化中發(fā)揮關鍵作用，并為支持系統(tǒng)發(fā)育類群提供了額外的證據(jù)[22]。為了進一步了解基因結構，對沙棘UGT 的內含子外顯子結構進行了分析。在本研究鑒定的89 個UGT 基因中，45 個UGT 基因含有內含子(50.6%)，其中，40 個UGT 基因有1 個內含子，5 個UGT 有2 個內含子。G組、P組和F組成員大多具有較長的內含子插入。M組、B組和R組成員均不含內含子。

2.4 染色體定位和基因復制分析

在鑒定出的89 個沙棘UGT 中，84 個UGT 被定位于沙棘染色體上。圖3 表明：在12 條沙棘染色體中，只有11 條沙棘染色體包含UGT 基因。11 號染色體包含最多的共13 個UGT 家族成員，而7 號染色體中沒有UGT 基因存在。12 號染色體含有12 個UGT 基因，10 號染色體包含11 個UGT基因，4 號、8 號和9 號染色體均只含3 個UGT 基因。沙棘UGT 基因在染色體上的這種不平衡分布，說明沙棘在進化過程中存在遺傳變異。

為了揭示沙棘UGT 基因家族的擴展和進化機制，對沙棘基因組中潛在的基因復制事件進行了分析。本研究利用MCScanX 軟件基于氨基酸序列同源性在沙棘全基因組內進行了比對，發(fā)現(xiàn)UGT 基因家族成員中存在12 個串聯(lián)重復基因簇和11 個共線基因對（圖3），這一結果表明，串聯(lián)重復是導致沙棘UGT 基因家族擴張的主要復制事件。本研究計算了復制基因間的Ka 和Ks 值，其比值均小于1，說明UGT 基因在進化過程中受到純化選擇。

圖3 沙棘UGT 基因的染色體分布和基因重復Fig.3 Chromosomal distribution and gene duplications of the HrUGTs

2.5 沙棘UGT 基因在果實不同發(fā)育階段的表達模式

本研究利用兩個沙棘亞種果實3 個發(fā)育階段的轉錄組數(shù)據(jù)，來進一步了解沙棘UGT 基因的表達模式，結果發(fā)現(xiàn)：沙棘各UGT 在種間和時間上的表達表現(xiàn)出顯著差異（圖4）。La10g1046，La10g2527和La3g0035 只在中國沙棘果實中微量表達，在蒙古沙棘果實中不表達。La2g0165，La3g0199 和La1g2297 則表現(xiàn)相反；而La9g0469 在蒙古沙棘果實中高表達，在中國沙棘中不表達。La5g0668在兩個亞種不同發(fā)育時期均高表達。La11g2592、HrUGT0002、La12g1442 等基因在兩個亞種果實中表達較高且隨著果實發(fā)育表達量逐漸升高。大多數(shù)UGT 基因主要在果實發(fā)育的前期或中期表達量較高，而在果實發(fā)育后期表達量降低。

圖4 沙棘UGT 基因在兩個亞種不同發(fā)育時期的表達模式Fig.4 Expression profiles of HrUGTs in various developmental stages of two sea buckthorn subspecies

從沙棘UGT 基因所處的系統(tǒng)發(fā)育分組看，A組中，La5g0208 和La12g2361 兩個基因表達水平相對較高，且均隨果實發(fā)育表達量逐漸降低。相似的，La5g0951 只在果實發(fā)育初期表達，而在果實發(fā)育的中到后期均不表達。C組中，La11g1107在兩個沙棘亞種果實中均不表達，而La12g1442 在兩個沙棘中表達量相對較高且主要在果實發(fā)育的中后期表達。D組和E組均包含較多的沙棘UGT 基因家族成員，但兩組基因的表達模式卻有著巨大差異。在D組中，除La2g1189 外，其他10 個基因在中國沙棘中均不表達，這些基因在蒙古沙棘果實中的表達水平也相對較低甚至不表達。而在E組中，除La9g0469 在中國沙棘果實中不表達，其余基因在兩個沙棘亞種果實中均有一定程度的表達。La11g0447 和La11g0570 在兩個沙棘亞種果實中表達量相對較高，La11g0447 在蒙古沙棘中表達量隨著果實發(fā)育先升高后降低，而在中國沙棘中表現(xiàn)出相反的趨勢；La11g0570 在中國沙棘中隨著果實發(fā)育表達量逐漸降低，而在蒙古沙棘果實中的表達水平先小幅升高，在果實成熟時下降到較低水平。F組成員在沙棘果實中除前期有少量表達外，其余時期表達水平較低或不表達。G組中，La12g0737表達量整體較高，在兩個沙棘亞種果實中均表現(xiàn)為隨著果實發(fā)育表達量先升高后降低；La2g2279 在中國沙棘果實中有著較高的表達水平，且隨著果實發(fā)育表達量逐漸升高，而在蒙古沙棘果實發(fā)育末期表達量下降到較低水平。L組中，La10g1081 和La10g1082 均在果實發(fā)育中期表達量較高，且蒙古沙棘高于中國沙棘；HrUGT0002 隨著果實發(fā)育表達量逐漸增加，且與發(fā)育初期相比HrUGT0002 在蒙古沙棘果實成熟期的表達水平提高了16.7 倍，而在中國沙棘中達到了25 倍。J組和R組中的沙棘UGT 基因在果實發(fā)育的各個時期均有相對較高的表達水平，H組、I組、K組、M組和N組中各成員在沙棘果實中表達量均相對較低。

本研究對部分表達差異較大的沙棘UGT 利用實時熒光定量PCR 進行驗證，結果（圖5）表明：在蒙古沙棘中HrUGT0002、La2g0900、La9g0469和La11g2592 均隨果實成熟表達量逐漸上升，而La2g3104、La10g1923、La12g2361 總體呈下降趨勢，La11g0447 和La11g0570 基因則在果實發(fā)育的中期表達較高?？傮w來看，實時熒光定量PCR 結果與轉錄組結果基本一致。

圖5 沙棘UGT 基因在果實不同發(fā)育時期的實時熒光定量PCR 分析Fig.5 Expression analysis of selected HrUGTsin various developmental stages using RT-qPCR.

3 討論

為了從功能上對沙棘UGT 進行鑒定，通過系統(tǒng)發(fā)育分析將鑒定到的89 個沙棘UGT 基因聚類為16 個組。沙棘中的UGT 基因約占沙棘全基因組基因總數(shù)的0.29%，低于桃（0.6%）[23]和擬南芥（0.44%）[11]，高于石斛（0.28%）[24]和玉米（0.23%）[12]的UGT 基因占比。A組、L組、D組、G組和E組被認為是高等植物進化過程中進化最快的分組[15]，在沙棘中這些分組包含了最多的UGT 基因家族成員，這一結果與Ren 等[24]和Cui 等[13]的研究高度一致。A組中的多數(shù)UGT 被鑒定為能夠催化類黃酮糖苷再次糖基化的糖基轉移酶[25-27]，本研究發(fā)現(xiàn)，沙棘UGT 家族A組成員均不含單糖基轉移酶中高度保守的C 端GSS 基序，這一結構特征也暗示著沙棘UGT 家族A組成員可能和多糖基類黃酮糖苷的生物合成存在重要聯(lián)系。O組和Q組在沙棘中未發(fā)現(xiàn)有成員存在，這兩個分組最早在玉米中鑒定出來[12]并被認為可能與細胞分裂素的糖基化有關。La12g1195、La11g1196 和La5g0668 被劃分為UGT95 亞家族，這一亞家族在山柳蘭中首先被鑒定出來，能夠催化木犀草素和槲皮素的3′-OH 基團和山萘酚的7-OH 基團糖基化[28]。在石榴[29]和茶樹[13]中均發(fā)現(xiàn)了UGT95 亞家族成員的存在，Cui 等將其劃為R組[13]，在本研究中延續(xù)了這一分組的劃分。

在鑒定到的89 沙棘UGT 基因中，有84 個基因被定位到染色體上。這些基因在染色體上通常成簇存在且表現(xiàn)出較高的序列相似性，這一特征與石斛和棉花表現(xiàn)一致[24,30]。本研究基于序列相似性和基因間距鑒定出12 個串聯(lián)重復基因簇和11 個共線基因對，證明串聯(lián)重復是導致沙棘UGT 基因家族擴張的主要復制事件。內含子的位置、丟失和獲得可以作為了解基因家族在系統(tǒng)發(fā)育類群內進化的重要指標。超過一半(50.6%)的沙棘UGT 有內含子插入，低于玉米(60%)[12]和擬南芥(58%)[11]的內含子數(shù)量。利用MEME 在線工具來搜索UGT 蛋白之間共享的保守基序，共發(fā)現(xiàn)了10 個不同的保守基序，其中，在所有鑒定的UGT 中都發(fā)現(xiàn)了編碼UGT 結構域的基序1。這些基序在組間有著顯著差異，特別是R組和A組均不含在其他分組中普遍存在的基序9。這些特定的基序可能會導致沙棘UGTs 功能的分化。

了解基因的時空表達模式有助于推測基因的功能。在蒙古沙棘中，48 個UGT 基因在果實發(fā)育過程中表達（FPKM >1），在中國沙棘中這一數(shù)字為51。R組3 個成員表達量在兩個亞種果實發(fā)育時期均較高。除La9g0469 外，E組成員在兩個亞種果實中均有不同程度的表達。La9g0469 在中國沙棘中不表達，而在蒙古沙棘中高表達，且隨著果實發(fā)育表達量逐漸上升，這種特異性的表達可能對兩個亞種果實中代謝物組成造成一定影響。

4 結論

本研究在沙棘全基因組范圍內鑒定獲得89 條含有UGT 保守結構域的HrUGTs 蛋白序列，并劃分為16 個系統(tǒng)發(fā)育分組。同一分組內沙棘UGT 具有相似的蛋白基序和基因結構，但在組間存在著巨大差異。沙棘UGT 家族在進化過程中受到純化選擇。沙棘UGT 基因家族成員在兩個沙棘亞種和果實不同發(fā)育階段的表達模式具有顯著差異。沙棘UGT 基因家族的表達模式和生物信息學分析將為進一步鑒定沙棘類黃酮糖基轉移酶功能和催化機理奠定基礎。