劉露 董健 張勇

肺癌是一種危險(xiǎn)程度較高的惡性腫瘤，其死亡人數(shù)正在逐年增加[1]。目前臨床因治療肺癌方法多樣化，且均有可觀的臨床效果，但對發(fā)生轉(zhuǎn)移的中晚期肺癌患者生存率仍未達(dá)到理想水平，因肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致療效不佳仍是未被解決的主要問題[2-4]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作為肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要途徑之一，對肺癌患者的術(shù)后總生存率影響較大[5]。早診斷、早干預(yù)肺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移是提高肺癌患者生存率的重要舉措，因此尋求評估肺癌轉(zhuǎn)移的有效標(biāo)記物對臨床肺癌治療意義重大[6]。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(MTA)1是MTA大家族的組成之一，在發(fā)生轉(zhuǎn)移的多種上皮惡性腫瘤中異常高表達(dá)[7]。血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)是VEGFs家族成員之一，既往動物研究結(jié)果證實(shí)VEGF-C在肝癌、乳腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)[8]。此外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)VEGF-C可能參與腫瘤淋巴管網(wǎng)結(jié)構(gòu)生成和重塑過程,對腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移起到正向或負(fù)向調(diào)節(jié)作用[9]。本研究旨在探究肺癌組織中MTA1及VEGF-C的表達(dá)，分析其與肺癌分期及轉(zhuǎn)移的內(nèi)在聯(lián)系。

對象與方法

1.對象：2019年1月～11月于華中科技大學(xué)附屬協(xié)和江北醫(yī)院行肺葉切除手術(shù)及淋巴結(jié)清掃手術(shù)的肺癌患者60例，其中男40例，女20例，年齡24～56歲，平均年齡(40.22±15.32)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《中華醫(yī)學(xué)會肺癌臨床診療指南(2019版)》中肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)臨床資料完整；(3)未合并其他惡性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有靶向藥物治療史；(2)行放化療。本研究經(jīng)華中科技大學(xué)附屬協(xié)和江北醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

2.方法

(1)免疫組織化學(xué)法檢測MTA1和VEGF-C在肺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)：取患者的肺癌組織及肺癌旁組織(距離腫瘤5 cm以外)作為組織標(biāo)本。組織標(biāo)本于甲醛溶液中固定后，經(jīng)不同濃度乙醇脫水，二甲苯溶液使切片透明后，包埋于石蠟中切片，撈片后烘干，經(jīng)過脫蠟和水化處理后，用抗原修復(fù)液浸泡組織切片行抗原修復(fù)。為避免組織假陽性染色，將組織置于3%的H2O2溶液中于室溫下37 ℃孵育半小時(shí)。加入非免疫山羊血清，37 ℃孵育，滴加稀釋的一抗(MTA1、VEGF-C抗體)后濕盒低溫中過夜，DAB顯色液對切片組織進(jìn)行顯色處理，在行蘇木精復(fù)染，復(fù)染結(jié)束脫水后中性樹脂封片。隨機(jī)選取5個(gè)較好的視野在光鏡下(400倍)觀察著色細(xì)胞數(shù)量和著色程度，由病理科專業(yè)醫(yī)師判斷細(xì)胞陽性情況。著色細(xì)胞比例為5%以下記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，50%以上記3分。細(xì)胞著色不明顯記0分，淺黃色記1分，黃色記2分，棕黃色或棕褐色記3分。著色細(xì)胞比例細(xì)胞著色計(jì)分之和為細(xì)胞陽性情況：0分為陰性，1～2分為弱陽性，3～4分為陽性，5～6分為強(qiáng)陽性。

(2)分組方法：根據(jù)性別、年齡、吸煙史、肺癌組織學(xué)類型、淋巴結(jié)N分期、腫瘤T分期及術(shù)后病理檢查結(jié)果中患者體內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量分別進(jìn)行分組，計(jì)算并比較各組MTA1和VEGF-C陽性表達(dá)率。淋巴結(jié)N分期：N0期表示無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，N1期表示有支氣管周圍或同側(cè)肺門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，N2期表示同側(cè)縱隔或隆突下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。腫瘤T分期：T1期表示腫瘤浸潤至黏膜及黏膜下層；T2期表示腫瘤浸潤至肌層或漿膜下層，T3期表示腫瘤穿透漿膜且未累及周圍器官，T4期表示直接侵犯鄰近器官，含腔內(nèi)擴(kuò)展至十二指腸或食管。陽性表達(dá)率(%)=陽性例數(shù)/總例數(shù)×100%。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。雙變量相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.MTA1和VEGF-C在肺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況：MTA1和VEGF-C蛋白陽性染色在肺癌細(xì)胞胞質(zhì)中呈棕褐色或棕黃色，在肺癌組織中主要呈陽性表達(dá)，在癌旁組織中主要呈陰性表達(dá)。見圖1、2。

2.不同性別、年齡、吸煙史、組織學(xué)類型患者肺癌組織中MTA1和VEGF-C陽性表達(dá)率比較：不同性別、年齡、吸煙史、組織學(xué)類型患者肺癌組織中MTA1和VEGF-C陽性表達(dá)率比較差異均無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。見表1。

注：A:肺癌組織中強(qiáng)陽性表達(dá)；B：肺癌組織中弱陽性表達(dá)；C：肺癌組織中陰性表達(dá)；D：癌旁組織中強(qiáng)陽性表達(dá)；E：癌旁組織中陰性表達(dá)圖1 MTA1在肺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

注：A:肺癌組織中強(qiáng)陽性表達(dá)；B：肺癌組織中弱陽性表達(dá)；C：肺癌組織中陰性表達(dá)；D：癌旁組織中強(qiáng)陽性表達(dá)；E：癌旁組織中陰性表達(dá)圖2 VEGF-C在肺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況(免疫組化染色，×400)

3.不同淋巴結(jié)N分期肺癌組織及癌旁組織患者M(jìn)TA1和VEGF-C的陽性表達(dá)率比較：肺癌患者按淋巴結(jié)N分期可分為N0期32例、N1期10例和N2期18例。N0、N1、N2期肺癌組織患者M(jìn)TA1和VEGF-C陽性表達(dá)率均高于癌旁組織(P<0.05)。見表2。

表2 不同淋巴結(jié)N分期肺癌組織及癌旁組織患者M(jìn)TA1和VEGF-C的陽性表達(dá)率比較[例，(%)]

4.不同組織中N0期、N1期、N2期患者M(jìn)TA1和VEGF-C陽性表達(dá)率比較：肺癌組織中N2期MTA1、VEGF-C陽性表達(dá)率均高于N0期和N1期(P<0.05)。癌旁組織N0期、N1期、N2期MTA1、VEGF-C陽性表達(dá)率兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

5.不同組織中不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量患者M(jìn)TA1和VEGF-C陽性表達(dá)率比較：肺癌組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量≥3枚患者M(jìn)TA1和VEGF-C陽性表達(dá)率均高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量為1～2枚患者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，癌旁組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量≥3枚患者M(jìn)TA1和VEGF-C陽性表達(dá)率均低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量為1～2枚患者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P>0.05)。見表4。

表3 不同組織中N0期、N1期和N2期患者M(jìn)TA1和VEGF-C的陽性表達(dá)率比較[例，(%)]

表4 不同組織中不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量患者M(jìn)TA1和VEGF-C的陽性表達(dá)率比較[例，(%)]

6.不同組織中不同分期患者M(jìn)TA1和VEGF-C陽性表達(dá)率比較：肺癌組織MTA1陽性表達(dá)率在T3～4期高于肺癌旁組織同期(P<0.05)。肺癌組織VEGF-C陽性表達(dá)率在各T分期中比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。癌旁組織MTA1、VEGF-C陽性表達(dá)率在各T分期中比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 不同組織中不同分期患者M(jìn)TA1和VEGF-C的陽性表達(dá)率比較[例，(%)]

7.肺癌患者M(jìn)TA1和VEGF-C陽性評分相關(guān)分析：Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，肺癌組織MTA1陽性評分總分與VEGF-C陽性評分總分呈正相關(guān)(r=0.394，P=0.024)。

討 論

肺癌患者術(shù)后5年總生存率較低，癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移是影響肺癌患者生存的主要原因[10]。肺內(nèi)淋巴系統(tǒng)發(fā)達(dá)[11]，因此淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要途徑。肺癌淋巴管生成能幫助癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)引流腫瘤細(xì)胞至淋巴結(jié)，增加了腫瘤惡性程度。VEGF-C被認(rèn)為是促淋巴管生成因子，并通過受體VEGFR-2、VEGFR-3發(fā)揮其生物學(xué)效用，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，啟動淋巴系統(tǒng)進(jìn)行全身性癌細(xì)胞擴(kuò)散[12]。林川等[13]研究發(fā)現(xiàn)MTA1與肝癌轉(zhuǎn)移過程關(guān)系密切，且控制相關(guān)信號通路的表達(dá)。陳偉妍等[14]、劉濤等[15]均通過免疫組織化學(xué)法檢測到MTA1在食管癌中的表達(dá)出現(xiàn)異常，且其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，不同性別、年齡、吸煙史、組織學(xué)類型患者肺癌組織中MTA1和VEGF-C陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)意義，說明肺癌組織中MTA1和VEGF-C表達(dá)不受性別、年齡、組織學(xué)類型等因素影響。我們進(jìn)一步對肺癌患者進(jìn)行N分期后，發(fā)現(xiàn)N0、N1、N2期肺癌組織患者M(jìn)TA1和VEGF-C陽性表達(dá)率均高于癌旁組織，提示MTA1和VEGF-C高表達(dá)是肺癌發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)因素；另一方面，本研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中N2期MTA1、VEGF-C陽性表達(dá)率均高于N0期和N1期，表明肺癌組織中MTA1、VEGF-C陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。進(jìn)一步以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量分組，發(fā)現(xiàn)肺癌組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量≥3枚患者M(jìn)TA1和VEGF-C陽性表達(dá)率均高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量為1～2枚患者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，癌旁組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量≥3枚患者M(jìn)TA1和VEGF-C的陽性表達(dá)率均低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量為1～2枚患者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，再次證實(shí)MTA1、VEGF-C陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量(≥3枚)甚至可以影響到癌旁組織MTA1、VEGF-C的陽性表達(dá)。

本研究中肺癌組織MTA1陽性表達(dá)率在T3～4期高于肺癌旁組織，說明MTA1蛋白在肺癌組織高表達(dá)可能與腫瘤大小相關(guān)。鑒于以上MTA1和VEGF-C兩種蛋白在肺癌臨床特征表達(dá)趨勢相似，Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示肺癌組織MTA1陽性評分總分與VEGF-C陽性評分總分呈正相關(guān)，說明MTA1和VEGF-C在肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移中可能具有協(xié)同作用。

綜上所述，MTA1和VEGF-C在肺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且與肺癌的惡性程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)，兩者有望成為臨床判定肺癌侵襲及轉(zhuǎn)移的重要靶標(biāo)。本研究仍存在不足之處，由于條件限制，納入的病例數(shù)量較少，且未收集到N3期的病例，群體代表性較差，上述結(jié)論仍需進(jìn)一步Meta分析或用實(shí)驗(yàn)動物模型來證實(shí)。