湯 建，孫惠芳，張騰騰，安鳳霞，耿春葉，聞崇煒*

1亳州學(xué)院中藥學(xué)院，亳州 236800；2江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013

神經(jīng)元的損傷及死亡涉及的環(huán)節(jié)廣泛，主要有氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、興奮性神經(jīng)毒性、鈣離子(Ca2+)超載、線粒體損傷、凋亡蛋白、自噬等[1,2]。神經(jīng)保護(hù)是神經(jīng)系統(tǒng)疾病防治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，姜黃素、白藜蘆醇、人參皂苷等天然產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)ROS、抗炎、抑制興奮性神經(jīng)毒性等機(jī)制發(fā)揮了良好的神經(jīng)保護(hù)作用，在抗缺血性腦損傷、提高學(xué)習(xí)認(rèn)知能力等方面有著良好的應(yīng)用前景[2,3]。

紅藤(Sargentodoxacuneata(Oliv.) Rehd.et Wils.)是我國特有的一種植物，具有解毒消癰，活血止痛，祛風(fēng)除濕等功效[4]。紅藤中的化學(xué)成分主要有酚酸類、苯丙素、木脂素等，其提取物具有抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等藥理活性[5]。本實驗室在前期研究中從野生紅藤中分離到苯丙醇苷類化合物sargentol(6 kg的植物藤莖中分離得到190 mg)，但關(guān)于該化合物藥理活性的報道較少[6]。本文擬評價sargentol對PC12細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用，并基于分子對接技術(shù)對可能的作用機(jī)制進(jìn)行討論，以期為發(fā)現(xiàn)中藥來源的神經(jīng)保護(hù)活性成分提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Sargentol(見圖1)由本實驗室自制，純度≥95%；1640完全培養(yǎng)基和新生牛血清購于維森特生物技術(shù)(南京)有限公司；ROS檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PC12低分化細(xì)胞由江蘇大學(xué)藥學(xué)院高靜教授實驗室提供；其他化學(xué)試劑均為分析純；AutoDock Tools 1.5.6和AutoDock Vina(美國The Scripps Research Institute)；PyMOL(TM) 1.7.4.5 Edu(美國Schrodinger，LLC公司)和Discovery Studio 2016 client(美國BIOVIA公司)。

圖1 Sargentol化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structure of sargentol

1.2 Sargentol對PC12細(xì)胞增殖的影響

生長期PC12細(xì)胞用1640培養(yǎng)基懸浮，接種至96孔板，每孔2×105個，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸去上清，加入sargentol(培養(yǎng)基溶解，含0.2% DMSO，終濃度均為0.1、1、10 μmol/L)，繼續(xù)孵育24 h。加20 μL的MTT(5 mg/mL)再孵育3 h。吸去上清，每孔加入100 μL的DMSO溶解，得紫色溶液，采用酶標(biāo)儀(570 nm)檢測吸光度(A)，計算細(xì)胞存活率，每組設(shè)立3個復(fù)孔。

1.3 MTT法測定損傷PC12細(xì)胞的存活率

生長期PC12細(xì)胞接種至96孔板，細(xì)胞密度6×103個/孔，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸去上清，加入sargentol溶液，終濃度均為0.1、1、10 μmol/L，繼續(xù)孵育5 h。加入不同的化學(xué)試劑(正常組只加培養(yǎng)基)，繼續(xù)孵育24 h。加20 μL的MTT(5 mg/mL)再孵育3 h。吸去上清，每孔加入100 μL的DMSO溶解產(chǎn)生的固體至紫色溶液，酶標(biāo)儀570 nm處檢測吸光度(A)，計算細(xì)胞存活率，每組設(shè)立3個復(fù)孔。所加的化學(xué)試劑分別是H2O2(0.5 mmol/L)、魚藤酮(rotenone，10 μmol/L)、NaN3(50 μmol/L)。

1.4 DCFH-DA探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平

參照文獻(xiàn)[7]，PC12細(xì)胞接種至24孔板中，4×104個/孔，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)12 h。Sargentol(0.1、1、10 μmol/L)預(yù)處理5 h后再加入H2O2(0.5 mmol/L)損傷1 h。PBS洗滌2次，每孔加入終濃度為10 μmol/L含DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基20 μL。培養(yǎng)箱中黑暗條件下孵育20 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，熒光酶標(biāo)儀激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm測定DCF熒光強(qiáng)度。計數(shù)細(xì)胞后根據(jù)細(xì)胞數(shù)及各實驗組熒光OD值計算每組細(xì)胞的DCF熒光強(qiáng)度/104細(xì)胞。

1.5 靶標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)的獲取和預(yù)處理

通過檢索文獻(xiàn)[1-3,7-9]，選定14個蛋白(見表1)為對接受體，并從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)下載其PDB文件。將蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6中，刪除原配體，水分子，加氫，保存為pdbqt格式，以備分子對接。

表1 神經(jīng)保護(hù)相關(guān)蛋白靶點(diǎn)

1.6 Sargentol與受體的分子對接

Sargentol化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)能量最小化處理后，保存為pdbqt格式，用AutoDock Vina與14種選定的靶點(diǎn)蛋白(受體)進(jìn)行半柔性對接，根據(jù)對接打分值來確定潛在的作用靶點(diǎn)。原配體與受體重新對接，其結(jié)合能打分值為閾值。通常認(rèn)為均方根偏差(RMSD)在2 ?范圍內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1 Sargentol對PC12細(xì)胞增殖的影響

如圖2所示，sargentol在0.1和1 μmol/L濃度時明顯促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖，細(xì)胞存活率與正常組(Ctrl，以100%計)分別增加21.6%和11.5%。而采用較高濃度(10 μmol/L)sargentol干預(yù)PC12細(xì)胞時，其細(xì)胞存活率反而較正常組低4.7%。但三個濃度下細(xì)胞存活率都高于95%，所以后續(xù)的研究中均選用0.1、1、10 μmol/L三個濃度。

圖2 Sargentol對PC12細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of sargentol on PC12

2.2 Sargentol對H2O2致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

如圖3所示，H2O2(0.5 mmol/L，模型組)對PC12細(xì)胞具有顯著的損傷作用，與正常組相比，PC12細(xì)胞存活率下降至42.5%(P< 0.01)。Sargentol(0.1、1、10 μmol/L)預(yù)處理后，PC12細(xì)胞存活率分別增加至正常組的73.8%、76.7%和57.9%(Ctrl組以100%計)。10 μmol/L的sargentol組的存活率反而低于1 μmol/L組，這與“2.1”項下數(shù)據(jù)一致，可能是較高濃度的sargentol反而對PC12細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用。

圖3 Sargentol對H2O2損傷PC12細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of sargentol on the survival rate of PC12 cells injured by = 3)注：與正常組比較，##P < 0.01；與模型組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note: Compared with Ctrl,##P < 0.01;Compared with model group,*P < 0.05,**P < 0.01.

2.3 Sargentol對魚藤酮致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

如圖4所示，10 μmol/L的魚藤酮對PC12細(xì)胞有顯著損傷，與正常組比較，細(xì)胞存活率下降至48.4%(P< 0.01)。而sargentol(0.1、1、10 μmol/L)預(yù)處理后，PC12細(xì)胞存活率分別增加至正常組的51.9%、65.2%和72.9%。

圖4 Sargentol對魚藤酮損傷PC12細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effect of sargentol on the survival rate of PC12 cells injured by = 3)注：與正常組比較，##P < 0.01。Note: Compared with Ctrl,##P < 0.01.

2.4 Sargentol對NaN3致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

如圖5所示，50 μmol/L的NaN3對PC12細(xì)胞有顯著損傷，與正常組比較，細(xì)胞存活率下降至44.9%(P< 0.01)。而sargentol(0.1、1、10 μmol/L)預(yù)處理后，PC12細(xì)胞存活率分別增加至正常組的61.2%、69.1%和73.6%。

圖5 Sargentol對NaN3損傷PC12細(xì)胞存活率的影響Fig.5 Effect of sargentol on the survival rate of PC12 cells injured by = 3)注：與正常組比較，#P < 0.05。Note: Compared with Ctrl,#P < 0.05.

2.5 Sargentol對H2O2損傷PC12細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

氧化應(yīng)激(ROS)效應(yīng)是細(xì)胞損傷或凋亡常見的原因[7-9]，本實驗中以H2O2致PC12細(xì)胞損傷模型為例，采用DCFH-DA染料法檢測sargentol對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響。如圖6所示，PC12細(xì)胞與H2O2共同孵育1 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平(以1×104個細(xì)胞的DCF熒光密度值計)顯著增加至正常組的3.5倍(P< 0.01)。與H2O2組相比，0.1、1、10 μmol/L濃度的sargentol分別降低ROS水平6.5%、10.7%、27.2%。Sargentol能劑量依賴性地降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。Sargentol對ROS效應(yīng)的抑制是保護(hù)H2O2致PC12細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一。

圖6 Sargentol對H2O2損傷PC12細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.6 Effect of sargentol on ROS level in PC12 cells injured by H2O2 = 3)注：與正常組比較，##P < 0.01；與模型組比較，**P < 0.01。Note: Compared with Ctrl,##P < 0.01;Compared with model group,**P < 0.01.

2.6 分子對接結(jié)果

本研究將原配體、sargentol分別與14個蛋白進(jìn)行對接，均選擇第一行(即dist from rmsd l.b.值和best mode rmsd u.b.值均為0)的打分值。具體結(jié)果見表2。

表2 Sargentol與14種蛋白受體的結(jié)合能

根據(jù)結(jié)合能和比值R(見表2)可知，排名前五的受體分別是TLR2(5D3I)、iNOS(2Y37)、PI3K(1E7V)、Keap1(4L7B)和IKKβ(3RZF)，這也是sargentol潛在的作用靶點(diǎn)。雖然Caspase-1(1RWN)與化合物的結(jié)合能僅有-5.9 kcal/mol，但與其閾值相同，后續(xù)的研究中也值得關(guān)注。Sargentol與5D3I、2Y37的結(jié)合能力最強(qiáng)，其打分值均為-7.7 kcal/mol。3D圖顯示sargentol的分子剛好卡在蛋白5D3I和2Y37的凹槽內(nèi)(見圖7A和7B)。圖7C顯示，sargentol與VAL348等10余種氨基酸殘基之間存在范德華力；其苯環(huán)與LEU160形成Pi-Alkyl鍵，與PHE322、PHE349形成Pi-Pi鍵；糖的3-OH的O與LYS347形成氫鍵，但糖4-OH的H與ILE319以及6-OH的O與LEU317之間存在斥力。圖7D顯示，sargentol與SER236等10種氨基酸殘基之間存在范德華力；三元環(huán)的O與ASN364、醇羥基的H與TYR483、糖3-OH的H與TRP366之間形成氫鍵；苯環(huán)與TRP188形成Pi-Pi鍵，與CYS194形成Pi-Donor氫鍵；但糖3-OH的H與MET368之間存在斥力?；衔飐argentol與周圍的氨基酸殘基結(jié)合緊密，存在著作用明顯的作用力，有助于與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合。

圖7 Sargentol與5D3I(A、C)和2Y37(B、D)的分子對接圖Fig.7 Docking of sargentol with proteins 5D3I (A,C) and 2Y37 (B,D)

3 討論與結(jié)論

魚藤酮損傷PC12細(xì)胞常用于建立帕金森病的細(xì)胞模型，而NaN3損傷PC12細(xì)胞模型常用于抗阿爾茨海默病化合物的初步篩選[9,10]。本文中sargentol對魚藤酮和NaN3引起的PC12細(xì)胞損傷無明顯抑制(P> 0.05)，而對H2O2損傷模型最為敏感，對H2O2引起的PC12細(xì)胞內(nèi)ROS亦有顯著抑制作用。

為了進(jìn)一步研究sargentol的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，本文中采用AutoDock Vina軟件虛擬篩選其結(jié)合靶點(diǎn)蛋白?？紤]到H2O2損傷的細(xì)胞模型中，ROS效應(yīng)是細(xì)胞損傷或凋亡常見的原因[9]，因此，我們選定了ROS效應(yīng)以及炎癥相關(guān)蛋白為主的14種蛋白進(jìn)行分子對接。

根據(jù)結(jié)合能和比值R確定了sargentol潛在的作用靶點(diǎn)TLR2(5D3I)、iNOS(2Y37)、PI3K(1E7V)、Keap1(4L7B)和IKKβ(3RZF)。其中Keap1-Nrf2-ARE信號通路是細(xì)胞防御ROS損傷的最重要機(jī)制之一[8]，Keap1(4L7B)與sargentol的結(jié)合能為-7.2 kcal/mol，提示sargentol對蛋白Keap1可能存在較強(qiáng)的激活能力，具有潛在的基于Keap1-Nrf2-ARE信號通路的抗ROS作用，這一推測與實驗“2.2”項下數(shù)據(jù)一致。TLR2(5D3I)、iNOS(2Y37)和PI3K(1E7V)是ROS和炎癥的重要調(diào)節(jié)蛋白[11,12]，本次分子對接中與sargentol的結(jié)合能分別是-7.7、-7.7和-7.3 kcal/mol，特別是前者，結(jié)合強(qiáng)度超過原配體的結(jié)合能(-7.5 kcal/mol)。提示sargentol可能是通過抑制氧化應(yīng)激—炎癥—氧化應(yīng)激循環(huán)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。前期研究中發(fā)現(xiàn)sargentol能顯著抑制小鼠耳腫脹[6]，其抗炎活性與本次分子對接預(yù)測一致。根據(jù)結(jié)合能，sargentol在抑制興奮性神經(jīng)毒性、凋亡基因調(diào)節(jié)方面的能力較弱，以后的研究中將會關(guān)注sargentol的抗炎方面的活性與機(jī)制研究。