朱道仙，陸 江，劉 莉*，吳 植

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 寵物科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300；3.江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300)

雛鵝痛風(fēng)近年來(lái)在全國(guó)范圍內(nèi)大面積暴發(fā)，該病主要侵害3周齡以下雛鵝，發(fā)病率為10%～50%，死亡率高達(dá)50%，耐過(guò)雛鵝通常表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，危害嚴(yán)重[1-2]。高尿酸血癥是痛風(fēng)發(fā)生的病理基礎(chǔ)，主要由于尿酸合成過(guò)多或排泄障礙引起[3-4]。尿酸是禽類蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，飼糧蛋白質(zhì)含量過(guò)大，極易誘導(dǎo)高尿酸血癥，已有學(xué)者用高蛋白質(zhì)飼糧和高鈣飼糧成功誘導(dǎo)了家禽痛風(fēng)病例[5-7]。然而，有調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)降低飼料中的蛋白含量對(duì)雛鵝痛風(fēng)防治無(wú)顯著效果[8]。尿酸排泄障礙可能是雛鵝痛風(fēng)發(fā)生的重要原因，當(dāng)痛風(fēng)時(shí)腎功能受損，限制了尿酸經(jīng)腎排泄，經(jīng)腸排泄成為尿酸排泄主要途徑[9]。三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2(ABCG2)是腸上皮細(xì)胞中一種高容量尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，促進(jìn)血尿酸向腸腔外排泄[10]。溶質(zhì)載體家族2成員9(SLC2A9)可使腸中尿酸重吸收進(jìn)入血液[11]，這兩種尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)節(jié)血尿酸與腸尿酸的平衡。因此，促進(jìn)尿酸經(jīng)腸排泄有助于降低血中尿酸水平，從而減少痛風(fēng)的發(fā)生。

近年來(lái)，丁酸鈉以其增加畜禽采食量、提高日增重和飼料轉(zhuǎn)化率等功能得到了研究者的廣泛關(guān)注[12-13]。有研究表明，日糧中添加包膜丁酸鈉顯著提高了14日齡、28日齡揚(yáng)州鵝體重[14]。但有關(guān)丁酸鈉調(diào)節(jié)雛鵝尿酸代謝的報(bào)道甚少。本研究通過(guò)觀察不同丁酸鈉添加水平對(duì)高蛋白飲食雛鵝血清尿酸代謝、腸道尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白表達(dá)及痛風(fēng)的影響，探討其調(diào)節(jié)尿酸代謝的可能機(jī)制，為丁酸鈉在水禽領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取1日齡揚(yáng)州雛鵝300只，隨機(jī)等分為5組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只。分別是正常飼糧對(duì)照組(NDC組，粗蛋白質(zhì)16.5%)、高蛋白組(HPC組，粗蛋白質(zhì)24%)、低劑量丁酸鈉組(LSB組，按0.025%添加于高蛋白飼糧)、中劑量丁酸鈉組(MSB組，按0.05%添加于高蛋白飼糧)和高劑量丁酸鈉組(HSB組，按0.1%添加于高蛋白飼糧)，試驗(yàn)采取雙層籠養(yǎng)，自由采食與飲水，按正常免疫程序免疫，試驗(yàn)周期為18 d。試驗(yàn)飼糧參考美國(guó)NRC建議的鵝營(yíng)養(yǎng)需要量標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels ofthe basic diet(air-dry basis)

1.2 生長(zhǎng)性能觀察

于6、10、14和18日齡時(shí)，以重復(fù)為單位對(duì)試驗(yàn)雛鵝進(jìn)行空腹稱重，計(jì)算平均體重，同時(shí)記錄采食量，計(jì)算平均采食量。試驗(yàn)期間每天觀察記錄各試驗(yàn)動(dòng)物的臨床表現(xiàn)，當(dāng)雛鵝具有行動(dòng)遲緩、縮頸、糞便發(fā)白等前期臨床癥狀，剖檢后表現(xiàn)為心包增厚，有白色結(jié)晶物附著或包被，腎臟蒼白腫大、花斑腎，輸尿管變粗，直腸末端內(nèi)容物白色稀糞積聚，標(biāo)記為疑似發(fā)病，試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算各組發(fā)病率。

1.3 血清相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

分別于6、10、14和18日齡時(shí)，每組每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取2只接近平均體重的雛鵝，頸靜脈采血并裝入試管中，在37 ℃水浴鍋中靜置，待分層后吸取上清液于離心管中，按2 500 r/min離心10 min，取上清液置于4 ℃冰箱中保存，次日檢測(cè)。血清肌酐(Scr)用改良苦味酸法測(cè)定，血清尿酸(UA)用酶比色法測(cè)定，血清尿素氮(BUN)用脲酶-谷氨酸脫氫酶法測(cè)定，血清黃嘌呤氧化酶活性(XOD)用ELISA法測(cè)定。

1.4 腸道尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白基因mRNA表達(dá)的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束后，每組每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1只接近平均體重的雛鵝，致死后取回腸黏膜，用RT-qPCR法檢測(cè)雛鵝回腸黏膜中三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2(ABCG2)及溶質(zhì)載體家族2成員9(SLC2A9)的mRNA表達(dá)。TRIzol法提取總RNA，在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s條件下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后按如下條件進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，循環(huán)35次。登陸CNBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找相應(yīng)基因序列，用Primer-BLAST進(jìn)行引物設(shè)計(jì)及特異性檢驗(yàn)，最后由上海生工合成，見(jiàn)表2。以β-actin為內(nèi)參，基因表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表2 相關(guān)基因mRNA表達(dá)的引物設(shè)計(jì)Table 2 Primers for mRNA expression of related genes

1.5 腸道尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白表達(dá)的測(cè)定

用RIPA裂解液提取回腸組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，用5×上樣緩沖液配平各蛋白樣品，上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳2 h，PVDF膜轉(zhuǎn)膜2 h，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加Ⅰ抗ABCG2(1:2 000)、SLC2A9(1:2 000)和β-actin(1:5 000)，置于4 ℃搖床中孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次5 min。加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鵝Ⅱ抗(1:5 000)室溫下孵育1 h, TBST洗膜3次，每次5 min?；瘜W(xué)發(fā)光成像儀中顯影成像。以β-actin為內(nèi)參，采用Image J分析軟件對(duì)各組條帶的光密度值進(jìn)行分析，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。所有抗體均購(gòu)于福因德科技(武漢)有限公司。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件單因素分析方法進(jìn)行組間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時(shí)段數(shù)值采用重復(fù)方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，發(fā)病率比較采用卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)。P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 丁酸鈉對(duì)高蛋白飲食雛鵝生長(zhǎng)性能的影響

由表3可以看出，HSB組10日齡、14日齡及18日齡采食量均顯著高于HPC組(P<0.05)，與NDC組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；MSB組14日齡及18日齡采食量顯著高于HPC組(P<0.05)，LSB組在各日齡時(shí)的采食量與HPC組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HSB組10日齡體重高于NDC組(P<0.05)，14日齡體重高于其他各組(P<0.05)，18日齡體重顯著高于HPC組和LSB組(P<0.05)；MSB組18日齡體重高于HPC組(P<0.05)。

表3 丁酸鈉對(duì)雛鵝采食量及體重的影響Table 3 Effect of sodium butyrate on feed intake and body weight of goslings

2.2 丁酸鈉對(duì)雛鵝血清尿酸代謝及腎功能的影響

由圖1可知，在14日齡時(shí)，HPC組及LSB組血中XOD活性最高，顯著高于其他各組(P<0.05)，MSB組次之，其后為HSB組，最低為NDC組；18日齡時(shí)，各試驗(yàn)組XOD活性有所降低，且HSB組XOD活性顯著低于HPC組、LSB組和MSB組(P<0.05)，與NDC組無(wú)顯著差異(圖1A)。各組UA在6日齡、10日齡及18日齡時(shí)均低于閾值(400 μmol/L)，各高蛋白試驗(yàn)組UA在14日齡時(shí)均高于閾值，表現(xiàn)為高尿酸血癥，但給與不同劑量丁酸鈉后，血清UA均低于HPC組(P<0.05)，且HSB組UA分別低于MSB組和LSB組(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。從10日齡起，HPC組反映腎功能的指標(biāo)Scr及BUN均顯著高于NDC組、MSB組與HSB組(P<0.05)，見(jiàn)圖1C、圖1D。試驗(yàn)期間，HPC組雛鵝痛風(fēng)發(fā)病率約為38%，添加丁酸鈉后可降低發(fā)病率，HSB組發(fā)病率僅為PHC組的一半(圖1E)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 丁酸鈉對(duì)雛鵝血清非蛋白氮代謝的影響同期比較，柱上標(biāo)相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同F(xiàn)ig.1 Effect of sodium butyrate on serum nonprotein nitrogen metabolism in goslingsIn the same period, the same or absent letters above the columns indicate insignificant difference (P>0.05),different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). The same below

2.3 丁酸鈉對(duì)雛鵝回腸中ABCG2、SLC2A9基因mRNA表達(dá)量的影響

在分析各組回腸中尿素氨轉(zhuǎn)運(yùn)體基因mRNA表達(dá)差異時(shí)發(fā)現(xiàn)，與NDC組比較，HPC組ABCG2的mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與HPC組比較，不同劑量丁酸鈉均可上調(diào)ABCG2的mRNA表達(dá)，HSB組具有顯著差異(P<0.05)(圖2A)。HPC組SLC2A9基因mRNA表達(dá)量顯著高于NDC組(P<0.05)，HSB組及MSB組SLC2A9基因mRNA表達(dá)量顯著低于HPC組，但高于NDC組(P<0.05)，且HSB組低于MSB組及LSB組(P<0.05)(圖2B)。

圖2 丁酸鈉對(duì)雛鵝回腸中ABCG2、SLC2A9基因mRNA表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of sodium butyrate on the mRNA expression of ABCG2 and SLC2A9 in the ileum of goslings

2.4 丁酸鈉對(duì)雛鵝回腸中ABCG2、SLC2A9蛋白表達(dá)量的影響

從圖3可以看出，HPC組回腸中ABCG2蛋白表達(dá)量高于NDC組，隨著丁酸鈉劑量增加有降低趨勢(shì)，但僅HSB組有顯著性差異(P<0.05)。HPC組回腸中SLC2A9蛋白表達(dá)量亦高于NDC組，且隨著丁酸鈉劑量增加有降低趨勢(shì)，MSB組及HSB組均顯著低于HPC組(P<0.05)。

圖3 丁酸鈉對(duì)雛鵝回腸中ABCG2及SLC2A9蛋白表達(dá)量的影響A.Western blot結(jié)果圖；B.ABCG2蛋白相對(duì)表達(dá)量；C.SLC2A9蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Effect of sodium butyrate on the protein expression of ABCG2 and SLC2A9 in the ileum of goslingsA. Western blot results; B. Relative expression of ABCG2; C. The relative expression of SLC2A9

3 討 論

研究表明，一定量蛋白日糧可以提高動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率。然而，為了過(guò)度追求鵝的快速生長(zhǎng)，提高經(jīng)濟(jì)效益，在生產(chǎn)實(shí)踐中常有高蛋白飼糧飼喂雛鵝[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，高蛋白飼糧在飼喂前期可促進(jìn)雛鵝快速生長(zhǎng)，在10日齡時(shí)最為明顯，而到18日齡時(shí)其生長(zhǎng)性能反而會(huì)降低，但添加不同劑量丁酸鈉后，可顯著提高雛鵝體重。說(shuō)明高蛋白飼糧對(duì)不同日齡雛鵝的促生長(zhǎng)作用不同，丁酸鈉有助于提高高蛋白日糧的促生長(zhǎng)作用。

由于禽類的蛋白質(zhì)分解代謝主要通過(guò)嘌呤核苷酸途徑形成嘌呤，然后在黃嘌呤氧化酶的作用下被氧化成尿酸，大部分經(jīng)腎排出體外。然而攝入高蛋白飼糧后可導(dǎo)致體內(nèi)尿酸生成過(guò)多，且尿酸在水中的溶解度較小，易形成高尿酸血癥，大量尿酸鹽進(jìn)入腎臟易引起腎損傷，成為痛風(fēng)的病理基礎(chǔ)[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高蛋白飼料后，雛鵝在10日齡、14日齡和18日齡時(shí)血中UA、XOD活性以及腎臟功能指標(biāo)Scr及BUN水平均較對(duì)照組顯著升高，特別14日齡時(shí)的UA水平已超過(guò)閾值，說(shuō)明高蛋白可以增加雛鵝高尿酸血癥及腎損傷的風(fēng)險(xiǎn)。而高蛋白飲食同時(shí)給予不同劑量丁酸鈉后均可降低10日齡、14日齡和18日齡時(shí)雛鵝血中UA、Scr及BUN水平，呈量效關(guān)系。與相關(guān)報(bào)道丁酸鈉可以降低血清中非蛋白氮水平的結(jié)論相一致[19]。

研究表明，高尿酸血癥或痛風(fēng)時(shí)，尿酸經(jīng)腸排泄途徑代償性增強(qiáng)[9]。ABCG2是一種高容量的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在不同腸段均有表達(dá)，特別在回腸有大量表達(dá)，其功能障礙會(huì)導(dǎo)致血清尿酸水平升高[20]。ABCG2基因敲除不僅會(huì)導(dǎo)致小鼠血清尿酸濃度增加，并且腸道尿酸的排泄水平明顯下降[21]。因此，ABCG2在腸道尿酸排泄中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，高蛋白飼糧可以下調(diào)雛鵝回腸中ABCG2的基因mRNA表達(dá)，而ABCG2蛋白表達(dá)卻有所增加，提示基因和蛋白表達(dá)不一致。徐象威等[22]在研究基于腸道尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 ABCG2的芒果苷降尿酸作用機(jī)制分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。這可能由于蛋白質(zhì)飼料導(dǎo)致雛鵝產(chǎn)生大量尿酸的刺激，引起回腸中ABCG2蛋白適應(yīng)性上調(diào)，以增加尿酸排泄有關(guān)。高劑量丁酸鈉可以回調(diào)ABCG2的mRNA和蛋白表達(dá)，使之趨于正常水平，提示丁酸鈉降尿酸作用可能與腸道ABCG2的改變有關(guān)。然而，ABCG2是一種多功能蛋白且作用機(jī)制復(fù)雜，丁酸鈉是否通過(guò)調(diào)節(jié)ABCG2蛋白的功能以促進(jìn)尿酸的腸道排泄，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

SLC2A9是一種新型的高容量、低親和力的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體[23-24]。有a和b兩種亞型。其中b亞型僅分布于肝臟及腎臟，而a亞型除在腎臟中表達(dá)外，還在小腸中有所表達(dá)[25]，主要功能是將腸腔中尿酸轉(zhuǎn)入腸上皮細(xì)胞內(nèi)，具有促進(jìn)尿酸重吸收作用。本研究發(fā)現(xiàn)，中劑量及高劑量丁酸鈉可以顯著下調(diào)高蛋白飲食雛鵝回腸中SLC2A9的基因mRNA和蛋白表達(dá)。表明抑制腸道尿酸重吸收可能是丁酸鈉干預(yù)尿酸代謝的作用機(jī)制之一。

4 結(jié) 論

本研究表明，丁酸鈉能提高高蛋白飲食雛鵝生長(zhǎng)性能，降低血中尿酸水平，緩解高尿酸血癥，減少痛風(fēng)的發(fā)生，可能與丁酸鈉下調(diào)回腸SLC2A9及回調(diào)ABCG2表達(dá)有關(guān)。