杜瑞芳，甘 偉，張建忠，張 榕，徐文靜，袁 玖*，萬欣杰,2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅正合生物科技有限公司，甘肅 蘭州 730060)

泡桐 (PaulowniaSieb. et Zucc.)原產(chǎn)于中國，目前已分布全世界。泡桐花多用于中藥材，具有抗菌、抗病毒、抗癌、鎮(zhèn)咳、降壓等作用。李時珍在《本草綱目》記載，“泡桐花傅豬瘡司豬肥大三倍”[1]。泡桐花、葉喂40 kg育肥豬3個月，體重達115～125 kg[2]。泡桐花黃酮粗提物能改善肉雞生長、屠宰性能及肉品質(zhì)[3]。泡桐花富含18種氨基酸，必需氨基酸指數(shù)達1.11；粗蛋白質(zhì)10.8%～14.8%，粗脂肪3.5%～6.4%，粗纖維11.3%～13.6%，鈣0.55%～0.72%，磷0.21%～0.42%[4]。而現(xiàn)實生活中，泡桐花期過后，泡桐花脫落、干枯，資源大量浪費。目前尚未查到泡桐花在反芻動物飼糧中應(yīng)用的報道。

單獨飼喂泡桐花可能無法完全滿足動物的營養(yǎng)需要，通過與苜蓿(Medicagosativa)搭配使用，以求獲得正組合效應(yīng)(associative effects，AE)。這種相互作用可改變反芻動物瘤胃及腸道的代謝過程。飼糧中添加苜?？筛纳频唾|(zhì)飼料的利用率[5]。據(jù)報道，苜?！霉炔轂?5∶75、50∶50時，能量和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化效率最高，50∶50時AE最優(yōu)[6]；棉花秸稈∶苜蓿為25∶75時，產(chǎn)氣量AE較優(yōu)[7]；玉米秸∶苜蓿干草60∶40、50∶50時，玉米秸∶苜蓿干草∶燕麥干草為50∶40∶10、50∶30∶20時發(fā)酵指標和AE最優(yōu)[8]。以飼草為基礎(chǔ)日糧時，須搭配飼喂精料，才能獲得較高生產(chǎn)性能[9]。玉米秸稈青貯∶羊草∶燕麥草∶精料10∶15∶25∶50時，MFAEI最優(yōu)[10]；青貯大米草∶玉米∶豆粕為55∶15∶30時，AE最大[11]。本研究旨在利用體外法評價泡桐花與苜蓿、精料間不同配比組合效應(yīng)情況，確定最佳配比組合，為泡桐花開發(fā)為反芻動物飼料提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

精料(配方組成：玉米84.50%，豆粕8.05%，棉粕3.30%，食鹽1.65%，復(fù)合預(yù)混料2.50%)購自甘肅省蘭州市某公司，苜蓿購自甘肅省臨洮縣，泡桐花為紫花毛泡桐，采集于甘肅農(nóng)業(yè)大學校園。

試驗用產(chǎn)氣管為德國制造的150 mL玻璃注射器(最小刻度1 mL)。注射器內(nèi)壁用凡士林涂勻，保證氣體的正常收集。注射器另一端與相同徑口的乳膠管無縫連接，夾子密封，進行體外產(chǎn)氣試驗。

1.2 試驗設(shè)計

試驗按精粗比(concentrate∶roughage，C∶R)60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80設(shè)計20個飼糧組合，加上精料∶泡桐花5個飼糧組合和3種原料單獨培養(yǎng)，合計28種飼糧組合，每個組合10個重復(fù)，共培養(yǎng)280個產(chǎn)氣管。試驗分4批，每批做3個空白管，以消除體外培養(yǎng)系統(tǒng)的誤差。具體配比見表1。

表1 28種飼糧組合比例Table 1 The proportion of 28 kinds of diets combination

1.3 瘤胃液供體動物及飼養(yǎng)

試驗用瘤胃液采自5只5歲左右、體重500±4.1 kg安裝永久瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛，飼喂的日糧為小麥秸稈自由采食，精料5 kg·d-1·頭-1，每日喂3次，自由飲水。精料的組成和營養(yǎng)水平見表2。早飼前采集5只瘺管牛的瘤胃液，混合后經(jīng)4層紗布過濾至預(yù)熱的保溫瓶，持續(xù)通入CO2，保證厭氧環(huán)境，迅速運至實驗室，待用。

表2 5只瘺管牛日糧中精料的配方組成和營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Ingredients and nutrient levels of the concentrate in experimental diet for 5 Holstein-Friesian cows (DM basis)

1.4 體外發(fā)酵培養(yǎng)程序

精料、苜蓿、泡桐花3種原料，干燥、粉碎、過1 mm標準篩。準確稱取28種飼糧組合0.2000 g(DM基礎(chǔ))，置于已編號并稱重的3×5 cm 400目尼龍袋，尼龍繩扎緊，置產(chǎn)氣管底部，管中加39 ℃已預(yù)熱微生物培養(yǎng)液30 mL(10 mL瘤胃液+20 mL緩沖液，緩沖液配制參照Menke等[13]方法)，產(chǎn)氣管細端朝上，小心推出管內(nèi)空氣，乳膠管折疊，鐵夾密封，產(chǎn)氣管膠管端垂直向下，讀數(shù)并記錄初始刻度(mL)(GP0)。置39 ℃恒溫水浴鍋培養(yǎng)2、4、6、9、12、24、36、48、72 h(t)時，記錄各時間點產(chǎn)氣量 (gas production，GP)(mL)。某飼糧組合在某時間點產(chǎn)氣量GP=該段時間樣品管GP-樣品管0 h時初始讀數(shù)(GP0 h)-該段時間空白管GP空白。

1.5 上清液及殘渣的采集

72 h培養(yǎng)結(jié)束后，尼龍袋置冰水中，使微生物發(fā)酵停止，用蒸餾水洗凈，105 ℃烘48 h至恒重，測定干物質(zhì)降解率(dry matter digestibility, DMD)。殘渣測定粗灰分，計算有機物降解率(organic matter digestibility, OMD)。培養(yǎng)液5 000 × g離心10 min，上清液移至離心管，-20 ℃保存，待測乙、丙、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸 (volatile fatty acids，VFA)和氨態(tài)氮(NH3-N)。

1.6 測定指標及方法

1.6.1 飼料常規(guī)營養(yǎng)水平 泡桐花、苜蓿、精料的干物質(zhì)(dry matter，DM)、粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)、粗脂肪(ether extract，EE)、粗纖維(crude fiber，CF)和粗灰分(ash)含量采用美國分析化學家協(xié)會 (Association of Official Analytical Chemists，AOAC)[14]概略養(yǎng)分法測定。

1.6.2 產(chǎn)氣指標計算

1.6.2.1 GP測定GPt=200×(Vt-V0)/W

式中:t為發(fā)酵開始后某一時間(h)；GPt為樣品t時刻產(chǎn)氣量(mL)；Vt為樣品發(fā)酵th后產(chǎn)氣管讀數(shù)；Vo為開始培養(yǎng)時空白管讀數(shù)；W為樣品干物質(zhì)重(mg)。

1.6.2.2 產(chǎn)氣參數(shù)計算 利用“fit curve”軟件，Фrskov等[15]產(chǎn)氣模型公式GP=a+b(l-e﹣ct)，將2、4、6、9、12、24、36、48、72 h時的GP代入，計算a、b、c等消化動力參數(shù)。式中，t為發(fā)酵開始后某一時間(h)；a為快速產(chǎn)氣量(mL)；b為緩慢產(chǎn)氣量(mL)；c為b的產(chǎn)氣速度常數(shù)(%·h-1)；a+b為潛在產(chǎn)氣量(mL) 。

1.6.3 瘤胃發(fā)酵參數(shù)、DMD、OMD的測定 采用梅特勒-托利多FE20型酸度計測定pH；采用Lu等[16]氣相色譜法測定VFA濃度。采用Broderick和Kang[17]方法測定NH3-N濃度；干物質(zhì)降解率(DMD，%)=(原樣品重量×原DM含量-殘渣樣品重量×殘渣DM含量)/原樣品重量×原DM含量×100%；有機物降解率(OMD， %)=(原樣品重量×原OM含量-殘渣樣品重量×殘渣有機物含量)/原樣品重量×原有機物含量×100%。

1.6.4 組合效應(yīng)的計算 單項組合效應(yīng)指數(shù)(single-factor associative effects index，SFAEI)和綜合組合效應(yīng)指數(shù)(multiple-factor associative effects index，MFAEI)參照王加啟[18]方法。

SFAEI=(各組合實測值-加權(quán)估算值)×100 / 加權(quán)估算值

式中:實測值為各組合的實際測定值，加權(quán)估算值=精料的實際測定值×精料配比(%)+泡桐花的實際測定值×泡桐花配比(%)+苜蓿的實際測定值×苜蓿配比(%)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行單因子方差分析，結(jié)果以平均值和平均標準誤表示，以P<0.05為差異顯著判斷標準，P<0.01為差異極顯著。差異顯著時，采用Tukey test法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 各單一飼料的營養(yǎng)水平及體外產(chǎn)氣參數(shù)

由表3可見，泡桐花的CP小于精料和苜蓿。精料和苜蓿的a為負值，存在產(chǎn)氣滯后效應(yīng)；泡桐花a值為正值，產(chǎn)氣不滯后。泡桐花的b、(a+b)、GP72 h、c均高于苜蓿，泡桐花的b、c低于精料，(a+b)、GP72 h高于精料。

表3 飼料營養(yǎng)水平及體外產(chǎn)氣參數(shù)(絕干基礎(chǔ))Table 3 Nutrient levels and in vitro gas parameters of experimental diets (dry matter basis)

2.2 各飼糧組合的產(chǎn)氣參數(shù)、發(fā)酵參數(shù)及組合效應(yīng)

由表4、表5可見，不添加苜蓿時，40∶60∶0、20∶80∶0組的各產(chǎn)氣、發(fā)酵參數(shù)顯著或極顯著高于其它各組(P<0.05或P<0.01)，40∶60∶0、20∶80∶0組的4個SFAEI和MFAEI極顯著高于其它3組(P<0.01)。精粗比60∶40時，60∶10∶30組的各產(chǎn)氣、發(fā)酵參數(shù)顯著或極顯著高于其它組(P<0.05或P<0.01)，60∶10∶30、60∶20∶20組的5項SFAEI、MFAEI極顯著高于其它組(P<0.01)。精粗比50∶50時，50∶20∶30、50∶10∶40組的各產(chǎn)氣、發(fā)酵參數(shù)顯著或極顯著高于其它2組(P<0.05或P<0.01)，50∶20∶30、50∶10∶40組的5項SFAEI、MFAEI顯著或極顯著高于其它組(P<0.05或P<0.01)。精粗比40∶60時，40∶30∶30、40∶20∶40組的各產(chǎn)氣、發(fā)酵參數(shù)顯著或極顯著高于其它組(P<0.05或P<0.01)，40∶30∶30組的5項SFAEI、MFAEI極顯著高于其它各組(P<0.01)，40∶20∶40組的MFAEI極顯著高于其它3組 (P<0.01)。精粗比30∶70時，30∶55∶15、30∶40∶30組的各產(chǎn)氣、發(fā)酵參數(shù)顯著或極顯著高于其它組(P<0.05或P<0.01)，且該2組的5項SFAEI和MFAEI極顯著高于其它2組 (P<0.01)。精粗比20∶80時，20∶65∶15組的的各產(chǎn)氣、發(fā)酵參數(shù)顯著或極顯著高于其它組(P<0.05或P<0.01)，20∶65∶15組的5項SFAEI、MFAEI極顯著高于其它組 (P<0.01)，20∶50∶30組的3項SFAEI、MFAEI極顯著高于其它2組 (P<0.01)。

表4 泡桐花與苜蓿、精料混合體外培養(yǎng)72 h后的產(chǎn)氣及發(fā)酵參數(shù)Table 4 GP and fermentation parameters at 72 h when Paulownia flower was incubated with alfalfa, concentrate in vitro

表5 泡桐花與苜蓿、精料混合體外培養(yǎng)72 h后的揮發(fā)性脂肪酸、SFAEI和MFAEITable 5 VFA, SFAEI and MFAEI after fermentation for 72 h when Paulownia flower incubatedwith alfalfa and concentrate in vitro

3 討 論

3.1 各單一飼料的產(chǎn)氣參數(shù)

本試驗中泡桐花的a為正值，不存在產(chǎn)氣滯后。精料、苜蓿的a為負值，且精料的產(chǎn)氣滯后時間更長。原因是本試驗精料由84.5%玉米構(gòu)成，而玉米比大麥(HordeumvulgareL.)產(chǎn)氣滯后時間更長[19]。精料的b和c較高，泡桐花次之。泡桐花的a、GP72 h和(a+b)最高，精料次之。即相對于苜蓿、精料，泡桐花產(chǎn)氣性能更好。

3.2 各飼糧組合的產(chǎn)氣、發(fā)酵參數(shù)及組合效應(yīng)

本試驗中，40∶60∶0、20∶80∶0、60∶10∶30、50∶20∶30、40∶30∶30、30∶55∶15、30∶40∶30、20∶65∶15組的a、b、c、(a+b)、GP72 h、DMD、OMD、NH3-N、乙酸、丙酸、TVFA、5個指標的SFAEI、MFAEI顯著或極顯著高于同一精粗比下其它各組。上述AE效果較優(yōu)的8個組合從大到小依次為：30∶55∶15、30∶40∶30組>40∶30∶30組>50∶20∶30組>20∶65∶15組>60∶10∶30組>40∶60∶0、20∶80∶0組。即當精粗比30∶70時AE效果最明顯，其次是C∶R為40∶60、50∶50、20∶80、60∶40及無苜蓿組。表明在低精料、高粗料(C∶R為30∶70)時，高比例泡桐花(55、40)配比低比例苜蓿(15、30)組合效果最優(yōu)；隨著精料的增加(C∶R為40∶60、50∶50、60∶40)，AE效果降低，40∶30∶30組>50∶20∶30組> 60∶10∶30組，精料需要配比泡桐花的比例亦降低(30、20、10)；不加苜蓿組，以 40∶60∶0、20∶80∶0組(即低精料、高粗料組)AE較優(yōu)。然而，當C∶R為20∶80時，其AE效果與C∶R為50∶50時相當。說明精粗比為30∶70時，不同飼料之間協(xié)同互作最強，飼料之間的AE最大，精粗比高于或低于30∶70，AE效果均會降低。隨著精料的降低，泡桐花的需要量增加，說明在一定程度上泡桐花可以替代精料的使用量。AE最小的是不加苜蓿組，說明苜蓿、泡桐花、精料三者配比組合效果優(yōu)于泡桐花、精料二者組合。

GP指標在預(yù)測飼料在瘤胃的消化率方面意義重大[20]。將單一飼料、各種飼料配比的混合飼料體外發(fā)酵培養(yǎng)，通過測定GP等可有效確定混合飼料的AE。體外法培養(yǎng)樹葉飼草與精料，在GP上呈現(xiàn)正AE[21]。體外培養(yǎng)小麥(TriticumaestivumL.)秸與苜蓿，產(chǎn)氣參數(shù)呈正AE[22]。豆科牧草混合低質(zhì)秸稈表現(xiàn)出AE是很多因素共同作用的結(jié)果，證明苜蓿等優(yōu)質(zhì)豆科牧草能改善劣質(zhì)秸稈的利用率[23]。將純纖維素、奶薊草(2種慢速發(fā)酵纖維)和無籽番茄(Solanumlycopersicum)、柑橘渣、果膠(3種快速發(fā)酵纖維)75∶25或25∶75體外培養(yǎng)后，3種快速發(fā)酵纖維的GP顯著增加[24]。象草分別與紅苕藤、油菜秸稈、桑葉、柑橘渣按25∶75、25∶75、75∶25、0∶100配比時，GP的AE最佳[25]。象草與皇竹草以25∶75組合，山羊瘤胃DM、NDF、CP的降解率及其正AE最高[26]。雜交構(gòu)樹、玉米秸稈青貯和燕麥青干草為50∶25∶25，玉米秸稈青貯∶燕麥青干草為50∶50或25∶75[27]，桑葉與羊草按60∶40組合[28]，油菜秸與蠶豆秸、小麥秸、豌豆秸、馬鈴薯秸稈、青貯玉米秸分別以75∶25、50∶50、50∶50、25∶75、25∶75配比[29]，玉米秸稈青貯與紅薯秧配比為50∶50[30]，蘇丹草與棉花稈為25∶75[31]時，AE效果最佳。混合草顆粒(優(yōu)質(zhì)牧草與低質(zhì)粗飼料按比例混合)適口性好，能保證攝取養(yǎng)分的均一性和穩(wěn)定性，科學搭配后能產(chǎn)生正AE[32]。

3.3 各飼糧組合的瘤胃pH、DMD、OMD、NH3-N和VFA濃度

本研究中，60∶10∶30、50∶20∶30、40∶30∶30、30∶55∶15、30∶40∶30、20∶65∶15組共6個組合的瘤胃pH顯著低于同精粗比下其它組。分析原因是這6個飼糧組合的產(chǎn)氣和發(fā)酵參數(shù)較高，TVFA較高，TVFA和pH呈負相關(guān)，TVFA高會降低瘤胃pH，因為發(fā)酵產(chǎn)生VFA的速度大于瘤胃的吸收速度，致使瘤胃pH下降[33]。

GP與瘤胃微生物發(fā)酵活性、飼料消化率呈正相關(guān)[13]。DMD和OMD是飼料營養(yǎng)價值的重要衡量指標。本研究中，GP、DMD和OMD變化趨勢一致。苜蓿的有效降解率相對較高，其碳氮比更適合瘤胃微生物的繁殖[34]。

氨氮濃度能充分反應(yīng)飼料在瘤胃中蛋白質(zhì)分解、氮代謝、微生物蛋白質(zhì)合成情況。正常的NH3-N濃度是6.3～27.5 mg·dL-1[35]。本研究中，25種飼糧組合的NH3-N濃度范圍為9.88～23.02 mg·dL-1，處于正常范圍內(nèi)，30∶55∶15等上述8組的NH3-N濃度高于其它組，原因是這些組合各單一飼料間發(fā)生了協(xié)同作用，增強了瘤胃內(nèi)能量和氮的同步釋放，促進了微生物蛋白質(zhì)的合成[36]。

本研究中，上述8個飼糧組合的乙酸、丙酸和TVFA顯著高于其它組。飼糧中可消化碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生VFA，GP與TVFA產(chǎn)量呈正相關(guān)，與乙酸亦呈正相關(guān)。乙酸/丙酸能反映瘤胃發(fā)酵的類型。本研究中，25種飼糧組合的乙酸/丙酸均大于3，屬于乙酸發(fā)酵型，有助于乳脂率的提高。另外，各飼糧組合中乙酸高于丙酸，原因是反芻動物對VFA的吸收率從大到小依次為丁酸、丙酸、乙酸，且瘤胃中VFA的濃度與日糧類型關(guān)系不大[37]。

3.4 各飼糧組合的AE值

評價飼糧AE的指標包括采食量、養(yǎng)分消化率、養(yǎng)分利用率、生長性能。最常用的指標是能量或消化率，而體外GP與OM的表觀降解率和真降解率具有高度相關(guān)性[20]。因此，利用體外GP法評價飼料AE的報道很多。然而，發(fā)生AE的機制很復(fù)雜，單項組合效應(yīng)指數(shù)(SFAEI)僅通過某一個指標評價飼糧的AE，缺乏代表性[38]。飼料的營養(yǎng)價值應(yīng)采用綜合性的指標或數(shù)學模型全面、科學地評價。因此，盧德勛[39]根據(jù)體外產(chǎn)氣法在不同時間點測定的各項指標，提出了“綜合組合效應(yīng)指數(shù)(MFAEI)”的概念。近年來，很多學者通過體外產(chǎn)氣試驗，利用MFAEI指標評估飼料之間的AE。豆秸∶花生蔓為25∶75時，SFAEI和MFAEI最佳[40]。玉米秸稈∶稻草為60∶40、玉米秸稈∶稻草∶玉米秸稈青貯為24∶16∶60、玉米秸稈∶稻草∶玉米秸稈青貯∶精料為9.6∶6.4∶24∶60時[41]，玉米秸稈∶谷草為60∶40，玉米秸稈∶谷草∶玉米秸稈青貯12∶8∶80時[42]，青貯茭白鞘葉與玉米、豆粕為40∶30∶30時[43]，辣木葉與玉米按60∶40組合時[44]，油菜∶玉米青貯為20∶80時，蕎麥秸∶苜蓿為20∶80時[45]，瘤胃發(fā)酵性能最好，SFAEI和MFAEI最佳。玉米青貯+羊草、玉米青貯+啤酒糟、羊草+稻秸的MFAEI依次為1.40、1.07、0.52；玉米青貯+羊草+精料、玉米青貯+啤酒糟+精料的MFAEI分別是0.37、0.24[46]。上述研究證實，不同種類粗飼料或精、粗飼料配比組合后，由于營養(yǎng)素的互補，日糧的整體發(fā)酵性能更高，這正是飼料間發(fā)生正AE的結(jié)果。

本研究中，精料∶泡桐花∶苜蓿最佳MFAEI組依次是30∶55∶15、40∶30∶30、50∶20∶30、20∶65∶15、60∶10∶30、40∶60∶0組。其中，MFAEI最低的是不加苜蓿組(40∶60∶0組)，其次是高精料組(60∶10∶30組)，再次是低精料組(20∶65∶15組)。C∶R為30∶70時MFAEI最高。即：精料過高或過低，MFAEI均會受到影響，且3種飼料組合的AE優(yōu)于2種飼料組合。給飼喂稻草(OryzasativaL.)基礎(chǔ)日糧的湖羊羔羊補飼高水平玉米淀粉時，纖維素酶活、纖維素分解菌群和飼料的消化率均降低；補飼適量玉米淀粉時，羔羊生長性能顯著提高[47]。證明合適的精料使用量非常關(guān)鍵。袁玖等將葵花籽殼[48]、火龍果皮[49]、玉米芯[50]、花生殼[51]、大豆莢[52]等與苜蓿、精料合適比例配比后，飼糧呈最佳正AE，證實經(jīng)濟作物或農(nóng)作物副產(chǎn)品配比適宜的苜蓿、精料后，為瘤胃微生物的生長、繁殖提供了充足的碳源、氮源，AE效果最優(yōu)。

本試驗中，30∶55∶15、40∶30∶30、50∶20∶30、20∶65∶15、60∶10∶30、40∶60∶0組的MFAEI較大。因此，泡桐花可以此配比為參考，作為反芻動物新的飼料，降低泡桐花的資源浪費，緩解人畜爭糧矛盾。

4 結(jié) 論

當精料∶泡桐花∶苜蓿為30∶55∶15、40∶30∶30、50∶20∶30、20∶65∶15、60∶10∶30、40∶60∶0時，MFAEI較佳。尤其以精粗比30∶70時最佳，30∶55∶15組MFAEI達到478.77%；40∶60時次之，40∶30∶30組MFAEI為415.90%。