張彤彤，王 蒙，鄭玉杰，杜佳勉，王 昕

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

羊絨是山羊皮膚次級毛囊產(chǎn)生的無髓纖維[1]，影響羊絨產(chǎn)量和品質(zhì)的因素很多，其中次級毛囊數(shù)量和特性對羊絨生產(chǎn)具有重要影響。毛囊的發(fā)生起始于胚胎期，期間依賴于表皮和真皮間充質(zhì)細胞間的相互作用，可分為誘導(dǎo)、結(jié)構(gòu)形成與分化3個階段[2]。已有的研究表明，陜北白絨山羊毛囊在胚胎期65 d(E65)處于誘導(dǎo)階段，胚胎期120 d(E120)處于分化階段[3]。毛囊發(fā)生發(fā)育過程是眾多基因時空表達的過程，不僅受到信號、轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳的調(diào)節(jié)[4-5]，還受到microRNA (miRNA)的調(diào)控[6-8]。

MiRNA是一類內(nèi)生的、長度約為20～24 nt的小RNA，其種子序列通過與靶mRNA的3' UTR區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA的降解或翻譯起始的抑制，進而調(diào)控基因的表達[9]。近年來的大量研究表明， miRNA 參與毛囊的發(fā)生及周期性發(fā)育過程，如miR-140-5p[10]、miR-26a[11]和miR-29a[12]等。

課題組前期對陜北白絨山羊E65和E120的皮膚樣品進行miRNA測序，得到許多差異表達的miRNA，包括miR-199a-5p。已有研究表明，miR-199a-5p靶向調(diào)控cyclinB1促進小鼠角質(zhì)細胞增殖[13]。由此推測，miR-199a-5p可能參與調(diào)控陜北白絨山羊毛囊的發(fā)生發(fā)育。為了進一步研究miR-199a-5p在陜北白絨山羊毛囊發(fā)生發(fā)育過程中的作用，本研究利用生物信息學(xué)方法對miR-199a-5p進行同源性分析及靶基因預(yù)測。通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)和qPCR驗證miR-199a-5p與靶基因的靶向關(guān)系，為進一步研究陜北白絨山羊毛囊發(fā)生發(fā)育過程中miR-199a-5p調(diào)控作用的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 皮膚樣品、細胞和質(zhì)粒

試驗用羊來自于陜西省榆林學(xué)院陜北白絨山羊工程技術(shù)研究中心。選擇6只2歲左右、體重基本相同的妊娠母羊，手術(shù)法采集胚胎期65 d和120 d的胎兒皮膚組織，將組織浸潤到RNA/DNA保護液中，-80 ℃低溫保存。毛乳頭細胞為新分離的陜北絨山羊原代細胞， HEK293T細胞和psiCHECK-2載體均系本實驗室保存。

1.2 miR-199a-5p序列保守性分析

從miRBase中檢索人(Homosapiens, hsa)、小鼠(Musmusculus, mmu)、大鼠(Rattusnorvegicus, rno)、山羊(Caprahircus, chi)、雞(Gallusgallus, gga)、馬(Equuscaballus, eca)、婆羅州猩猩(Pongopygmaeus, ppy)、黑猩猩(Pantroglodytes, ptr)、大猩猩(Gorillagorilla, ggo)、獼猴(Macacamulatta, mml)和豬(Susscrofa, ssc)等的miR-199a-5p序列，分析其保守性。

1.3 miR-199a-5p的靶基因預(yù)測

將TargetScan7.0 ( http://www.targetscan.org /vert _ 71 /)、PicTar ( http://pictar.mdcberlin.de /)和miRanda ( http://www.microrna.org /microrna/getDownloads.do)預(yù)測的miR-199a-5p的靶基因取交集，結(jié)合課題組前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果以及文獻報道，初步確定miR-199a-5p的靶基因為JUNB。

1.4 引物的設(shè)計與合成

參照Chen等的方法設(shè)計miR-199a-5p莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計miR-199a-5p、U6、JUNB和β-actin的qPCR引物，引物序列詳見表1。上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences information

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

HEK293T細胞和毛乳頭細胞復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)皿中，待細胞長滿后用胰酶消化，然后分別用含10% FBS 的 DMEM和DMEM-F12培養(yǎng)基重懸細胞，后接種于6孔板。待細胞密度達到約70%～80%時，按照Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimics /mimics NC和inhibitor/inhibitor NC至細胞。試驗共設(shè)4個組，每組3個重復(fù)，48 h后收集細胞，提取RNA。根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫得到miR-199a-5p的成熟體序列，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成miR-199a-5p mimic /mimics NC和inhibitor/inhibitor NC，序列信息詳見表2。

表2 miR-199a-5p相關(guān)序列信息Table 2 Information of miR-199a-5p related sequence

1.6 實時熒光定量PCR

采用Trizol法提取皮膚和細胞總RNA后，將RNA稀釋到同一濃度，按照 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(TaKaRa)進行實時熒光定量PCR(qPCR)，每個樣本重復(fù)3次。 qPCR反應(yīng)體系為15 μL：cDNA 1.2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，2×SYBR Ex Taq Ⅱ 7.5 μL，ddH2O補足體系。qPCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。分別以U6和β-actin為內(nèi)參計算miRNA和mRNA的相對表達量。使用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量，通過GraphPad Prism 7.0軟件的t-test檢驗分析數(shù)據(jù)并作圖。

1.7 載體構(gòu)建

以絨山羊皮膚組織DNA為模板，PCR擴增miR-199a-5p靶基因JUNB3' UTR序列，設(shè)計引物如下，F(xiàn):CCCTCGAGGACCTGAGGGCGCAACAAAC；R：ATTTGCGGCCGCTCCACAGTACGGTGCAGAGG。將擴增產(chǎn)物膠回收后和psiCHECK2質(zhì)粒使用XhoⅠ和NotⅠ內(nèi)切酶進行酶切，將擴增片段連接到psiCHECK2質(zhì)粒上，構(gòu)建重組質(zhì)粒。

1.8 雙熒光素酶報告系統(tǒng)

HEK293T細胞復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)皿中，待細胞長滿后用胰酶消化，然后用含10% FBS 的 DMEM培養(yǎng)基重懸細胞后接種于48孔板。待細胞密度達到約70%～80%時，按照 Lipofectamine 2000說明書將miR-199a-5p mimics /mimics NC和inhibitor/inhibitor NC分別與JUNB3' UTR重組質(zhì)粒兩兩共轉(zhuǎn)染至細胞。共設(shè)4個試驗組，每組3個重復(fù)。按照Dual-Luciferase? Reporter Assay System (Promega)試劑盒說明書進行細胞裂解和雙熒光素酶活性檢測。

1.9 數(shù)據(jù)分析

通過SPSS統(tǒng)計分析軟件對基因表達水平進行差異顯著性檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗法，后利用GraphPad Prism 7.0軟件進行作圖。結(jié)果以平均值±標準誤表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-199a-5p在絨山羊胎兒皮膚組織中的表達

通過qPCR技術(shù)檢測miR-199a-5p在絨山羊毛囊發(fā)生過程中不同階段的表達情況，結(jié)果表明miR-199a-5p在E65(誘導(dǎo)階段)高表達，E120(分化階段)低表達(P<0.05)(圖1)。

圖1 miR-199a-5p在絨山羊胚胎期65 d和120 d皮膚組織中的表達情況* 表示P<0.05, **表示P<0.01。下圖同F(xiàn)ig. 1 Expression of miR-199a-5p in the skin tissuesof cashmere goat embryos at 65 d and 120 d* indicate significant difference(P<0.05), ** indicatehighly significant difference(P<0.01). The same below

2.2 miR-199a-5p保守性分析

從表3中人、小鼠、大鼠、山羊、雞、馬、婆羅州猩猩、黑猩猩、大猩猩、獼猴和豬等物種的miR-199a-5p序列可以看出，miR-199a-5p在進化中非常保守，成熟體序列完全一致。

表3 不同物種的miR-199a-5p序列Table 3 Sequence of miR-199a-5p from different species

2.3 miR-199a-5p靶基因的預(yù)測和分析

利用TargetScan、PicTar和miRanda預(yù)測miR-199a-5p的靶基因，取三者的交集共有151個基因(圖2A)，合并已研究證實的60個靶基因[14-21](表4)，共獲得193個基因。將靶基因集合與課題組胚胎期轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)聯(lián)合分析[3]，取交集獲得88個靶基因(圖2B)。GO富集分析發(fā)現(xiàn)靶基因主要富集在細胞組分、細胞進程和大分子結(jié)合等過程(圖3)，而 KEGG pathway富集分析發(fā)現(xiàn)這些靶基因主要富集在調(diào)節(jié)干細胞多能性、TNF及MAPK等通路上(圖4)。

圖2 miR-199a-5p靶基因預(yù)測情況A. 3種軟件預(yù)測miR-199a-5p的靶基因結(jié)果；B. 靶基因集合與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的聯(lián)合分析結(jié)果Fig. 2 Prediction of miR-199a-5p target genesA. Prediction results of miR-199a-5p target genes using 3 kinds of bioinformatics tools;B. Combined analysis of target gene set and transcriptome sequencing results

圖3 miR-199a-5p靶基因的GO富集分析結(jié)果Fig. 3 GO enrichment analysis results of miR-199a-5p target genes

圖4 miR-199a-5p靶基因的KEGG pathway分析結(jié)果Fig. 4 KEGG pathway enrichment analysis results of miR-199a-5p target genes

表4 研究證實的miR-199a-5p靶基因統(tǒng)計Table 4 Statistics of research confirmed miR-199a-5p target gene

2.4 miR-199a-5p過表達和抑制效果檢測

將miR-199a-5p mimics /mimics NC和inhibitor/inhibitor NC轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，轉(zhuǎn)染48 h后利用qPCR技術(shù)檢測，結(jié)果表明，mimics組與mimics NC組相比，miR-199a-5p的表達量極顯著升高(P<0.01)；inhibitor組與inhibitor NC組相比，miR-199a-5p的表達量顯著降低(P<0.05)(圖5)。

圖5 轉(zhuǎn)染mimics/mimics NC和inhibitor/inhibitorNC后miR-199a-5p的表達情況Fig. 5 Expression of miR-199a-5p after transfection withmimics/mimics NC and inhibitor/inhibitor NC

2.5 雙熒光素酶試驗驗證miR-199a-5p與JUNB的靶向關(guān)系

由于轉(zhuǎn)錄因子JUNB在毛囊分化過程中起重要作用[3,22]，因此將JUNB基因作為候選靶基因進一步研究。TargetScan分析表明，JUNB基因的3' UTR包含miR-199a-5p的結(jié)合位點(圖6A)，PCR擴增JUNB基因3' UTR片段，長度為296 bp(圖6B)。將擴增的JUNB基因3' UTR片段克隆至psiCHECK2載體上，構(gòu)建psiCHECK2-JUNB3' UTR重組載體。經(jīng)測序驗證(圖6C)，雙熒光素酶報告載體構(gòu)建成功。

圖6 psiCHECK2-JUNB 3' UTR載體構(gòu)建A. miR-199a-5p與JUNB 3' UTR的結(jié)合位點；B. PCR擴增JUNB 3' UTR片段；C, psiCHECK2-JUNB 3' UTR載體測序結(jié)果M. DL5000 DNA Marker; 1. 絨山羊皮膚DNA的PCR產(chǎn)物；圖6C中顏色標記部分為PCR擴增JUNB基因3' UTR片段序列Fig. 6 psiCHECK2-JUNB 3'UTR vector constructionA. The binding site of miR-199a-5p and JUNB 3' UTR;B. PCR amplification of the JUNB 3' UTR fragment;C. psiCHECK2-JUNB 3' UTR vector sequencing resultsM. DL5000 DNA Marker; 1. PCR product from skin DNA of cashmere goat；fig. 6C, color labeled sequence of JUNB gene 3' UTR amplified by PCR

將psiCHECK2-JUNB3' UTR重組載體和miR-199a-5p mimics/mimics NC/inhibitor/inhibitor NC分別共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，每組設(shè)置3個重復(fù)，轉(zhuǎn)染48 h后按照雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒說明書進行細胞裂解和雙熒光素酶活性檢測。結(jié)果表明，miR-199a-5p-mimics+JUNB3' UTR共轉(zhuǎn)染組與對照組相比，熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；miR-199a-5p inhibitor +JUNB3' UTR共轉(zhuǎn)染組與對照組相比，熒光素酶活性顯著升高(P<0.05)，表明JUNB基因的3' UTR存在miR-199a-5p的結(jié)合位點，JUNB基因是miR-199a-5p的潛在靶基因(圖7)。

圖7 雙熒光素酶試驗檢測miR-199a-5p與JUNB 3'UTR的關(guān)系Fig. 7 The dual luciferase assay detected the relationshipbetween miR-199a-5p and JUNB 3' UTR

2.6 miR-199a-5p抑制JUNB的表達

將miR-199a-5p mimics /mimics NC和inhibitor/inhibitor NC轉(zhuǎn)染至毛乳頭細胞中，通過qPCR檢測靶基因JUNB的表達量。結(jié)果表明，mimics組與mimics NC組相比，JUNB的表達量極顯著下降(P<0.01)；inhibitor組與inhibitor NC組相比，JUNB的表達量顯著升高(P<0.05)，即miR-199a-5p抑制JUNB基因的表達(圖8)。

3 討 論

毛囊是皮膚組織重要的附屬可再生器官，控制著動物毛發(fā)的生長、品質(zhì)和產(chǎn)量[23]。毛囊發(fā)生始于早期的胚胎階段，表皮與真皮間充質(zhì)細胞之間相互作用，期間毛囊形態(tài)學(xué)變化較為復(fù)雜，可分為誘導(dǎo)、結(jié)構(gòu)形成和分化3個階段[2]。已有研究表明，miRNA在毛囊發(fā)生發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用。miR-30b-5p通過靶向CaMKIIδ抑制毛乳頭細胞的增殖，進而參與絨山羊毛囊發(fā)育[24]。miR-218-5p通過靶向SFRP2增強Wnt信號通路活性，并在皮膚和毛囊發(fā)育過程中發(fā)揮動態(tài)調(diào)控作用[25]。miR-148a和miR-10a抑制真皮乳頭細胞增殖，并且靶向調(diào)控BMP7基因[26]。

研究表明，在人類皮膚鱗狀細胞癌中，miR-199a-5p 過表達可抑制皮膚角質(zhì)形成細胞的增殖，并下調(diào)靶基因Bcam、Fzd6和Ddr1的表達[27]。但miR-199a-5p的研究大多集中于人和小鼠，在山羊上的研究較少。課題組前期對陜北白絨山羊胚胎期皮膚組織進行了miRNA測序，發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p在胚胎期65 d的表達量較高，在120 d的表達量較低。本研究利用qPCR技術(shù)檢測miR-199a-5p在陜北白絨山羊胎兒皮膚組織中的表達情況，結(jié)果與測序結(jié)果相一致，提示miR-199a-5p可能在毛囊發(fā)生發(fā)育過程中起重要作用。通過對多個物種間miR-199a-5p序列進行對比，發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p在多個物種中序列高度保守，提示其可能在山羊上具有重要的生物學(xué)功能。

miRNA通常與靶基因mRNA 3′UTR結(jié)合，以負調(diào)控的方式作用于靶基因，繼而發(fā)揮其調(diào)控作用[28]。本研究對miR-199a-5p的靶基因進行預(yù)測和篩選，并進行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)其靶基因顯著富集于調(diào)控干細胞多能性、TNF及MAPK信號通路等。TNF家族參與毛囊的發(fā)生發(fā)育，其家族成員Eda及其受體Edar發(fā)揮主要調(diào)控作用，誘導(dǎo)毛囊發(fā)生并維持基板結(jié)構(gòu)[29]，推測miR-199a-5p可能通過調(diào)控TNF信號通路相關(guān)基因的表達影響毛囊的發(fā)生。MAPK信號通路在細胞增殖、分化和遷移等多種生理學(xué)過程中發(fā)揮調(diào)控作用，且在真核生物中高度保守[30]。有研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路在毛囊干細胞的自我更新中起重要作用[31]，推測miR-199a-5p能夠通過調(diào)控MAPK信號通路參與毛囊的生長發(fā)育。

轉(zhuǎn)錄因子JUNB是二聚體轉(zhuǎn)錄因子AP-1(activator protein-1, 激活蛋白-1)家族的成員，是構(gòu)成轉(zhuǎn)錄激活蛋白 AP-1的重要亞基。已有研究表明糖皮質(zhì)激素受體在多種細胞類型(包括角質(zhì)形成細胞)中與轉(zhuǎn)錄因子JUNB結(jié)合并抑制其表達，能夠顯著影響毛囊的發(fā)育[22]。本研究以JUNB基因作為miR-199a-5p的潛在靶標，研究miR-199a-5p在毛囊分化過程中的重要作用，發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p能夠靶向下調(diào)JUNB的表達，提示miR-199a-5p可能通過調(diào)控JUNB的表達參與毛囊的分化。但miR-199a-5p在毛囊發(fā)生發(fā)育中的功能尚不清楚，有待研究。

4 結(jié) 論

本研究利用qPCR技術(shù)檢測到miR-199a-5p在絨山羊毛囊發(fā)生不同階段中差異表達，并通過生物信息學(xué)對miR-199a-5p的靶基因進行預(yù)測和分析。從中篩選并鑒定JUNB基因是miR-199a-5p的靶基因。這些結(jié)果為進一步研究miR-199a-5p調(diào)控陜北白絨山羊毛囊發(fā)生發(fā)育奠定基礎(chǔ)。