王萌冉，秦 儉，吳 凡，王學(xué)春，黎臘梅，胡 瑤，趙長坤，陳 婷，楊國濤，陳永軍，胡運(yùn)高

(1.西南科技大學(xué)水稻研究所，四川 綿陽 621010；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院水稻高粱研究所，四川 德陽 618000；3.綿陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川 綿陽 621010)

干旱是影響水稻生長發(fā)育的重要因素之一，近20年來，干旱使我國水稻減產(chǎn)近25.4%[1].在過去40多年以來，我國平均每年受干旱影響的土地面積高達(dá)2 667萬hm2，糧食減產(chǎn)700～800億kg[2]，干旱是限制水稻生產(chǎn)的一個(gè)重要因素[3].

水稻在干旱脅迫下表現(xiàn)為株高下降、萎蔫，葉片卷曲、衰老，氣孔關(guān)閉、葉片生長減少、干物質(zhì)降低等[4-7].這些變異在不同水稻品種中[4-5，8-9]存在顯著差異，很難根據(jù)農(nóng)藝性狀中的某一個(gè)來鑒定抗旱水稻品種.根系在植物吸收及轉(zhuǎn)移水分和養(yǎng)分中起重要作用，根長、根數(shù)量及根系分布與水稻抗旱性有著顯著的相關(guān)性[10]；干旱脅迫下，水稻為了改善根系的吸水特性，根系發(fā)育強(qiáng)壯.相關(guān)的研究[11]表明，深根系水稻能通過吸收深層土壤水分，增強(qiáng)其對(duì)干旱脅迫的耐受能力.O’Toole 等[12]的研究表明，典型旱稻品種比普通栽培品種具有更深的根.這種深層生根特性極大提高了旱稻品種對(duì)土壤深層水分的吸收能力[13].

研究人員以淺根型品種IR64和深根型品種Kinandang Patong雜交育成的重組自交系IK-RILs為材料，在重組自交系9號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了控制深根的基因DRO1；在淺根水稻(IR64)中引入DRO1，可增加水稻的根深，使該水稻在干旱條件下保持了高產(chǎn)性能[14-15].這表明DRO1可以改變水稻的生根方式，使水稻從淺生根向深生根轉(zhuǎn)變，因而有可能增強(qiáng)水稻的抗旱性[14].

水稻具有高效的抗氧化酶系統(tǒng)，包括SOD、CAT和POD等.在不同的環(huán)境脅迫條件下，抗氧化酶和抗氧化代謝物的含量都有所增加，這種防御活性在耐旱性品種中表現(xiàn)得比干旱敏感性品種要高[16-17].在干旱脅迫條件下，有的研究報(bào)道了水稻SOD、CAT和POD活性增強(qiáng)[18]，而另有研究卻得出了水稻SOD、CAT和POD活性下降的結(jié)論，這些抗氧化酶活性反應(yīng)的差異可能與逆境的嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間[19]以及植物的耐旱能力[20]有關(guān).

本研究旨在探討不同雜交水稻品種在干旱環(huán)境下的根系分布和抗氧化酶活性對(duì)品種抗旱的影響，評(píng)價(jià)DRO1基因在試驗(yàn)品種根系分布變異中的作用，以為雜交水稻育種提供理論依據(jù).

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以46個(gè)雜交水稻品種(見表1)作為試驗(yàn)材料，于2016—2018年在旱棚和水稻盆栽系統(tǒng)中對(duì)參試水稻品種進(jìn)行干旱脅迫試驗(yàn).其中，2016年為品種初篩試驗(yàn)，在旱棚進(jìn)行；2017—2018為典型品種耐旱特性試驗(yàn)，在水稻盆栽系統(tǒng)中進(jìn)行.

1.1.1 初篩試驗(yàn)

初篩試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，46個(gè)水稻品種共設(shè)計(jì)138個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)品種3個(gè)重復(fù).每個(gè)重復(fù)撒播150粒水稻種子.在三葉期移除病秧，保留100株健壯秧苗.待秧苗基本成長至四葉期時(shí)，停止灌溉，同時(shí)排干試驗(yàn)小區(qū)所有水分.每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)每隔3 d選擇10株代表性秧苗測(cè)定株高和葉片數(shù)；同時(shí)每隔3 d取3株秧苗測(cè)定生物量，直至所有水稻萎蔫死亡.在此基礎(chǔ)上，將46個(gè)水稻品種分為3組，從每組中選擇2個(gè)品種(共6個(gè)品種)作為典型水稻品種進(jìn)行進(jìn)一步研究.

表1 抗旱篩選水稻品種

1.1.2 典型品種耐旱特性試驗(yàn)

將內(nèi)徑為20 cm、高60 cm的PVC管放入內(nèi)徑為40 cm、高60 cm的硬塑料桶中.PVC管內(nèi)襯尼龍網(wǎng)袋，裝入稻田土形成土柱，每桶裝土20 kg，PVC管上口高出土面10 cm；外桶灌水浸泡，靜置沉淀2 d.根據(jù)綜合耐旱指數(shù)選擇6個(gè)水稻品種，在72個(gè)桶中播種，每個(gè)品種種植12桶，每桶移栽1株五葉期秧苗.為了減少營養(yǎng)脅迫對(duì)水稻生長的影響，在每桶土壤中分別混合施用3.5 g氮(N)、5.3 g磷(P2O5)和3.6 g鉀(KCl).在水稻分蘗盛期，排干桶中所有水分，并停止灌溉，等水稻完全萎蔫后(大約一周)，每個(gè)品種選擇3桶檢測(cè)根系分布，3桶檢測(cè)根系和葉片抗氧化酶活性；剩下6桶水稻進(jìn)行復(fù)水灌溉，等水稻完全復(fù)活后，再次排干桶中所有水分，停止灌溉.等水稻第二次完全萎蔫后(大約5 d)，每個(gè)品種選擇3桶檢測(cè)根系分布，3桶檢測(cè)根系和葉片抗氧化酶活性.

1.2 取樣觀測(cè)

1.2.1 根系分布

水稻第一次萎蔫時(shí)，每個(gè)品種選擇3桶取樣.將內(nèi)桶取出，由土表向下將土柱分3層切割，洗去各層泥沙，分別測(cè)量表層(0～10 cm)、中層(10～30 cm)、深層(30～50 cm)不定根長度和數(shù)量；用干燥組織吸去根部表面水分，測(cè)定不同土層的根重.水稻第二次萎蔫時(shí)，每個(gè)品種選擇3桶，對(duì)上層、中層和下層水稻根長、根數(shù)和根重進(jìn)行測(cè)定.

1.2.2 根及葉片中的酶

水稻第一次萎蔫時(shí)，每個(gè)品種選擇3桶取葉片和根樣，檢測(cè)抗氧化酶活性.葉樣取法：剪取水稻自上而下的第二片與第三片葉，放入20 mL離心管，液氮保存.根樣取法：由土表向下將土柱分層切割，洗去各層泥沙，留取中間層根條，放入20 mL離心管，液氮保存.

分別取0.20 g水稻葉片和水稻根系于預(yù)冷的研缽中，加入預(yù)冷的0.05 mol/L pH=7.8的磷酸緩沖液1 mL，在冰浴上研磨成漿；吸入2 mL EP管，再加入1 mL緩沖液沖洗研缽，再吸入2 mL EP管，最終體積為2 mL.4℃下5 000 r/min離心20 min，上清液即為提取液.分裝、編號(hào)，4℃保存?zhèn)溆茫詈蠊y(cè)定SOD、POD和CAT活性指標(biāo)，測(cè)定方法參照《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》[21].

1.2.3DRO1基因測(cè)序

剪下水稻葉片，用保鮮膜包裹，-20℃保存，用于基因測(cè)序.DRO1基因測(cè)序由成都市擎科生物公司完成.

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

根據(jù)不同水稻基因型在干旱脅迫下生物量、株高和葉片的動(dòng)態(tài)變化，采用下列公式計(jì)算水稻的綜合耐旱指數(shù)(Complex tolerance index of rice under drought environment，Icd).

Icd=HI×0.1+BI×0.3+LI×0.6；

式中：HI是高度變化指數(shù)，BI是生物量變化指數(shù)，LI是水稻干旱脅迫的葉片變化指數(shù)；Hi是水稻第一個(gè)量度時(shí)間的株高，Hi+1是水稻第 (i+1)次測(cè)量的株高；Bi是水稻生物量，Bi+1是第(i+1)次測(cè)量的水稻生物量；Li是第一次測(cè)量的水稻葉片數(shù)，Li+1是第 (i+1)次測(cè)量的水稻葉片數(shù)；Di是水稻生長的日數(shù)，Di+1是水稻生長的第(i+1)日數(shù)；n是各指標(biāo)總測(cè)量次數(shù).

2 結(jié)果

2.1 干旱環(huán)境下水稻的綜合耐旱指數(shù)

雜交水稻品種在干旱脅迫條件下表現(xiàn)多樣，綜合耐旱指數(shù)從0.84～0.55不等，根據(jù)綜合耐旱指數(shù)值將水稻品種分為3組：0.75～0.84為耐旱型(C)，0.65～0.75為半耐旱型(H)，0.55～0.65(A)為干旱敏感型.共篩選出12個(gè)耐旱型品種、25個(gè)半耐旱型品種和9個(gè)干旱敏感型品種(見圖1).從耐旱型(C)中選擇德優(yōu)4727和川谷優(yōu)208，半耐旱型(H)中選擇德香4103和蓉18優(yōu)447，干旱敏感型(A)中選擇B優(yōu)2761和B優(yōu)5768作為典型品種，進(jìn)一步分析其抗旱性.

圖1 46個(gè)水稻品種分類(部分?jǐn)?shù)據(jù))

2.2 根系分布分析

根是水稻吸收養(yǎng)分和水分的重要器官之一，其對(duì)水分的吸收利用能力對(duì)水稻抗旱能力具有顯著影響.根系分布數(shù)據(jù)(見圖2)表明，與敏感型水稻(B優(yōu)2761和B優(yōu)5768)根系相比，耐旱型水稻(德優(yōu)4727和川谷優(yōu)208)根系在10～30 cm和30～50 cm土層分別增長171和489 cm；但在0～10 cm土層，從敏感型向耐旱型根系的增長趨勢(shì)不顯著.在10～30 cm和30～50 cm土層，耐旱型水稻根系數(shù)量分別比敏感型多32和41個(gè)；在0～10 cm土層根系數(shù)量則無顯著性差異.在0～10 cm和30～50 cm土層，耐旱型水稻根重顯著大于敏感型，而在10～30 cm土層根重顯著小于敏感型.以上結(jié)果表明，0～10 cm土層水稻根系密度差異不顯著；30～50 cm土層水稻根系垂直分布差異顯著，耐旱型水稻(德優(yōu)4727和川谷優(yōu)208)比敏感型水稻(B優(yōu)2761和B優(yōu)5768)在干旱脅迫條件下具有更深的根系，可以有效地利用深層水分，生存得更好.

2.3 深層生根基因DRO1序列分析

已有的研究[14-15]表明，DRO1基因參與水稻根系的深層發(fā)育，在干旱脅迫條件下可保證水稻產(chǎn)量的穩(wěn)定性.基因測(cè)序結(jié)果表明，耐旱型水稻(德優(yōu)4727和川谷優(yōu)208)與干旱敏感型水稻(B優(yōu)2761和B優(yōu)5768)的第3外顯子區(qū)均具有單核苷酸多態(tài)性(SNP).與耐旱型水稻(德優(yōu)4727和川谷優(yōu)208)相比，敏感型水稻(B優(yōu)2761和B優(yōu)5768)在752 bp區(qū)域的第3外顯子區(qū)堿基表現(xiàn)為“A”而不是“C”(見表2).同時(shí)，半耐旱型水稻(德香4103和蓉18優(yōu)447)表現(xiàn)為雜合子(H)，在同一區(qū)域同時(shí)含有“A”和“C”堿基(見表2).結(jié)果表明，第3外顯子區(qū)中含有“C”堿基的雜交水稻品種在水平軸方向上根系生長角最大，在干旱脅迫條件下根系發(fā)育更深(見圖3)，可以有效利用較深層的水分.

表2 不同雜交水稻品種DRO1基因序列分析

T1為分蘗盛期的第一次干旱處理，T2為復(fù)水后的第二次干旱處理.

圖3 德優(yōu)4727(C)、德香4103(H)和B優(yōu)5768(A)根系的區(qū)別

2.4 干旱脅迫下的抗氧化酶活性

抗氧化酶活性測(cè)定結(jié)果(見表3)表明，干旱脅迫條件下耐旱型水稻(德優(yōu)4727和川谷優(yōu)208)、半耐旱型水稻(德香4103和蓉18優(yōu)447)和干旱敏感型水稻(B優(yōu)2761和B優(yōu)5768)葉片SOD活性差異顯著，POD活性差異不顯著，CAT活性無顯著性差異.根系抗氧化酶活性，尤其是SOD和POD活性，均高于葉片抗氧化酶活性.干旱脅迫條件下，耐旱型水稻表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化酶系統(tǒng).

表3 干旱脅迫對(duì)不同品種水稻抗氧化酶活性影響 U/mg

2.5 相關(guān)性分析

相關(guān)分析表明，根系分布與綜合耐旱指數(shù)具有良好的相關(guān)性.在10～30 cm和30～50 cm土層，根長、根數(shù)與綜合耐旱指數(shù)具有顯著的相關(guān)性(見表4)；在0～10 cm和30～50 cm土層，根重與綜合耐旱指數(shù)同樣具有顯著的相關(guān)性(見表4).這說明30～50 cm土層的根長、根數(shù)和根重對(duì)雜交水稻抗旱能力具有重要影響.

綜合耐旱指數(shù)與根系SOD和POD活性呈極顯著相關(guān)(見表4)，相關(guān)系數(shù)分別為0.983和0.890.根系CAT活性和綜合耐旱指數(shù)間不具有顯著相關(guān)性(見表4).葉片SOD、CAT和POD活性與綜合耐旱指數(shù)無顯著相關(guān)性，CAT和POD活性與綜合耐旱指數(shù)的相關(guān)性分別為0.668和0.648(見表4).和葉片相比，根系SOD和POD活性對(duì)水稻抗旱能力有更重要的影響.

表4 綜合耐旱指數(shù)與根系分布及抗氧化酶活性相關(guān)性分析

DRO1基因與水稻的根長在10～50 cm土層呈顯著正相關(guān)，與根數(shù)和根重在30～50 cm土層呈顯著正相關(guān)(見表5)，表明DRO1基因與水稻根系具有良好的相關(guān)性，尤其在水稻根系分布較深的情況下.

DRO1基因與根系和葉片的SOD酶活性均呈正相關(guān)，與根系SOD活性呈顯著正相關(guān)；與根系和葉片POD活性均呈正相關(guān)，與根系POD活性呈顯著正相關(guān)(見表5)；與根系和葉片CAT活性無顯著相關(guān)性(見表5).綜合來看，DRO1基因與根系抗氧化酶活性呈良好正相關(guān).

表5 DRO1基因與根系、抗氧化酶的相關(guān)性分析

3 討論

3.1 水稻綜合耐旱指數(shù)

據(jù)報(bào)道，干旱脅迫會(huì)造成植株整體生長的減緩，具體體現(xiàn)在植株高度降低和生物量減少等方面[5].本試驗(yàn)以株高、生物量和葉片數(shù)為基礎(chǔ)，建立了水稻耐旱性的變異性分析方法，為水稻耐旱種質(zhì)資源的篩選提供了依據(jù).雜交水稻的綜合耐旱指數(shù)值變化很大(0.55～0.84)，耐旱型品種為0.75～0.84，半耐旱型品種為0.65～0.75，干旱敏感型品種為0.55～0.65.本文根據(jù)綜合耐旱指數(shù)值從46個(gè)水稻品種中篩選出12個(gè)耐旱品種，其中，嘉優(yōu)727、川優(yōu)5727和德優(yōu)4727具有同一親本——成恢727，F(xiàn)優(yōu)498和川農(nóng)優(yōu)498具有同一親本——蜀恢498，表明這些耐旱品種的抗旱性源于其親本成恢727和蜀恢498，因此認(rèn)為成恢727和蜀恢498可能具有抗旱特性.

綜合耐旱指數(shù)值與根系分布和根系POD、SOD酶活性具有良好的相關(guān)性，尤其是在10～50 cm土壤中更為顯著.這些結(jié)果表明，綜合耐旱指數(shù)方法是一種有效的、可操作的水稻種質(zhì)資源篩選方法.

3.2 水稻抗旱性與根系分布

植物抗旱性是一個(gè)復(fù)雜的性狀，它與土壤質(zhì)地、根系分布和水分條件等環(huán)境因子密切相關(guān)[22].根系作為植物從土壤中吸收水分和養(yǎng)分的重要器官，可通過吸收深層土壤水分來避免干旱，對(duì)植物的抗旱性起著至關(guān)重要的作用[23].本文研究了不同雜交水稻品種在表層、中層和底層土壤中根系分布情況，進(jìn)一步闡明了根系發(fā)育基因型變異的重要性.與半耐旱型品種(德香4103和蓉18優(yōu)447)和干旱敏感型品種(B優(yōu)2761和B優(yōu)5768)相比，耐旱型品種(德優(yōu)4727和川谷優(yōu)208)的根系更發(fā)達(dá)，這與早期的相關(guān)研究結(jié)果[14-15，24]一致.

3.3 DRO1基因與水稻根系

許多控制根系形態(tài)的數(shù)量性狀基因座(QTL，quantitative trait locus)已經(jīng)有過報(bào)道，但是對(duì)控制水稻深根性狀的QTL的研究還比較有限.目前已有6個(gè)主要的水稻深根性狀QTL[14-15，25-28]被報(bào)道.Kinandang Patong(KP)攜帶的功能性等位基因DRO1具有深根特性，而IR64攜帶的非功能性等位基因DRO1具有淺根特性[15].本研究中對(duì)一些典型的雜交水稻品種進(jìn)行了DRO1基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了其在第3外顯子中的單核苷酸多態(tài)性.干旱敏感型品種中含有A，根系生長角度小，因此生根淺；耐旱型品種中含有C，根系生長角度大；半耐旱型品種中含有A和C，根系生長角度中等，表現(xiàn)為混合根表型(見表2、圖3).這些結(jié)果表明，深根栽培品種攜帶功能等位基因DRO1的同時(shí)，其他兩組所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可能不具有正常功能.

3.4 水稻抗旱性與抗氧化酶

植物中抗氧化酶的誘導(dǎo)活性是一種自然的反應(yīng)策略，用以對(duì)抗惡劣環(huán)境中的氧化損傷[29].SOD被認(rèn)為是通過將活性氧轉(zhuǎn)化為過氧化氫(H2O2)、再通過CAT和POD消除H2O2減少活性氧對(duì)植株傷害的關(guān)鍵酶[30-31].在各種抗氧化酶中，CAT和SOD在干旱環(huán)境下表現(xiàn)出較高的誘導(dǎo)活性；雖然POD也可受到誘導(dǎo)，但活性相對(duì)低于CAT和SOD.本試驗(yàn)的研究表明，干旱脅迫條件下，耐旱組水稻表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化酶系統(tǒng)；根系抗氧化酶尤其是SOD酶活性顯著提升，降低了干旱脅迫對(duì)水稻植株的損害，對(duì)于提高水稻抗旱性具有重要意義，這與前人的研究結(jié)果[5]一致.根系SOD和POD活性在耐旱型、半耐旱型和干旱敏感型品種間差異顯著(見表3)，這些結(jié)果為根系SOD和POD酶活性在水稻耐旱能力鑒定中起重要作用提供了依據(jù).

4 結(jié)論

與敏感品種相比，耐旱品種根系較深，在干旱環(huán)境下根系中POD和SOD活性相對(duì)較高，這種深層根系分布和抗氧化酶活性均與DRO1基因顯著相關(guān).綜合耐旱指數(shù)值可用于水稻抗旱性評(píng)價(jià)，德優(yōu)4727和川谷優(yōu)208的綜合耐旱指數(shù)值較高，耐旱性較強(qiáng)，適宜在四川盆地等季節(jié)性干旱易發(fā)稻區(qū)推廣應(yīng)用.