翟曉磊 郝朝輝 張楠 李萍 韓前河

膀胱癌發(fā)病率在泌尿生殖系統(tǒng)中占首位，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，患者生存時(shí)間有所延長(zhǎng)，但晚期患者的5年生存率僅15%[1]。因此，持續(xù)探索膀胱癌的分子機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)有效的診療方案必不可少。大量研究顯示，許多長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long chain non-coding RNA, lncRNA)在膀胱癌中異常表達(dá)，且通過(guò)調(diào)控相關(guān)微小RNA(microRNA, miRNA)影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為進(jìn)而發(fā)揮致癌或抑癌作用[2-3]。有研究指出，lncRNA LINC01082在結(jié)腸癌組織中低表達(dá)并發(fā)揮抑癌作用，有望成為結(jié)腸癌的新型抑制劑或治療靶點(diǎn)[4]；也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)LINC01082在膀胱癌中表達(dá)下調(diào)，且與膀胱癌分級(jí)較低、低侵襲性密切相關(guān)[5]；目前關(guān)于LINC01082在膀胱癌中的作用及分子機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。miR-543在包括膀胱癌在內(nèi)的多種腫瘤中異常高表達(dá)，發(fā)揮致癌作用[6-8]。且生物信息學(xué)工具顯示LINC01082與miR-543之間有靶向關(guān)系，因此推測(cè)，LINC01082是否通過(guò)miR-543發(fā)揮抑癌作用。本研究旨在探討LINC01082是否通過(guò)靶向miR-543表達(dá)參與膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)調(diào)控，為膀胱癌的發(fā)病機(jī)制及治療提供新線索。

材料與方法

一、主要材料與試劑

膀胱癌和對(duì)應(yīng)癌旁組織均來(lái)自于鄭州人民醫(yī)院2019年3月至2020年6月收治的40例膀胱癌患者；人膀胱上皮永生化細(xì)胞系SV-HUC-1和人膀胱癌細(xì)胞系BIU87、5637、J82、UM-UC-3購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，F(xiàn)12K培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，MEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，RPMI-1640培養(yǎng)液、雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒和全蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，pcDNA 3.1-LINC01082過(guò)表達(dá)載體及空載體質(zhì)粒、miR-543模擬物及陰性對(duì)照miR-NC及各PCR引物購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。兔抗人Ki-67、MMP-9、Bcl-2、Bax一抗及羊抗兔二抗購(gòu)自武漢三鷹生物科技有限公司。本研究獲得本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

SV-HUC-1細(xì)胞采用含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)液培養(yǎng)；BIU87細(xì)胞和5637細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；J82細(xì)胞和UM-UC-3細(xì)胞采用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；培養(yǎng)條件均為5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱。

三、轉(zhuǎn)染與分組

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的J82細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，常規(guī)培養(yǎng)至65%～75%匯合度時(shí)，參照脂質(zhì)體3000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染5 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。細(xì)胞分為L(zhǎng)INC01082組、空載體組、miR-543組、miR-NC組和LINC01082+miR-543組，分別轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-LINC01082質(zhì)粒、pcDNA 3.1空載體、miR-543模擬物、miR-NC以及共轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-LINC01082和miR-543模擬物，同時(shí)設(shè)立正常培養(yǎng)的細(xì)胞為空白組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

四、RT-qPCR檢測(cè)膀胱癌組織和細(xì)胞中LINC-01082、miR-543的表達(dá)水平

按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取待測(cè)組織或細(xì)胞的總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA后，以cDNA為模板，參照RT-qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)上熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增；以GAPDH或U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算LINC01082和miR-543的表達(dá)水平。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR引物序列如下：LINC01082上游：5′-CAGTGACAGCCTTAACA-TTTGC-3′，下游：5′-TTCGGTGCTGGGTTGA-TCCT-3′；GAPDH上游：5′-GGAGCGAGATCCC-TCCAAAAT-3′，下游：5′-GGCTGTTGTCATAC-TTCTCATGG-3′；miR-543上游：5′-AAACATTC-GCG-3′，下游：5′-AAGAAGTGCAC-3′；U6上游：5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTG-3′。

五、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證LINC01082與miR-543的靶向作用

將野生的LINC01082片段和定點(diǎn)突變后的LINC01082片段克隆重組至psiCHECK-2載體上，分別構(gòu)建野生型psiCHECK-LINC01082(LINC01082-wt)和突變型psiCHECK-LINC01082(LINC01082-mut)載體質(zhì)粒。參照脂質(zhì)體3000說(shuō)明書(shū)將LINC01082-wt或LINC01082-mut與miR-543模擬物或miR-NC共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞檢測(cè)其熒光素酶活性，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

六、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

J82細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分別培養(yǎng)0、24、48、72、96 h；培養(yǎng)至所需時(shí)間后，每孔加入5 g/L MTT試劑20 μl孵育4 h；棄培養(yǎng)液后，每孔再加入150 μl二甲基亞砜；震蕩反應(yīng)至結(jié)晶充分溶解后，使用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度(OD)值。

七、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲、遷移能力

收集轉(zhuǎn)染24 h后的各組J82細(xì)胞，以無(wú)血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×104個(gè)/ml。將Matrigel基質(zhì)膠用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋后，取100 μl均勻涂抹于上室表面，放置30 min 后凝成基質(zhì)膠。而后向Transwell小室上室中加入細(xì)胞懸液200 μl，在下室中加入含血清培養(yǎng)液500 μl；孵育24 h后，以棉簽擦去未侵入的細(xì)胞，采用4%多聚甲醛固定小室下室表面細(xì)胞后，0.5%結(jié)晶紫染色15 min。采用顯微鏡觀察并統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)。同時(shí)，調(diào)整細(xì)胞終濃度約5×104個(gè)/ml，不涂抹基質(zhì)膠重復(fù)上述過(guò)程，檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。

八、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(預(yù)冷)漂洗3次后，加入結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/ml。向100 μl細(xì)胞液中加入染色液Annexin V-FITC和碘化丙啶各5 μl；充分混勻后，在避光下室溫孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

九、Western blot檢測(cè)細(xì)胞中蛋白表達(dá)

參照全總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞總蛋白后，檢測(cè)其蛋白濃度；將蛋白樣品和上樣緩沖液(4∶1)混勻后，置于沸水浴中變性5 min；將蛋白樣品按照每泳道60 μg行12% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯膜。脫脂奶粉封閉2 h后，以特異性一抗Ki-67(1∶800)、MMP-9(1∶500)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)4 ℃下孵育過(guò)夜；洗去一抗反應(yīng)液后，再以二抗(1∶5 000)37 ℃孵育2 h。暗室內(nèi)顯影曝光后，以GAPDH作參照,使用Gel Pro 4.0 軟件分析細(xì)胞中Ki-67、MMP-9、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平。

十、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、LINC01082和miR-543在膀胱癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性

與癌旁組織比較，膀胱癌組織中LINC01082表達(dá)水平明顯降低(圖1A)，而miR-543水平明顯升高(圖1B，P<0.001)；且LINC01082與miR-543表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(圖1C)。

A：LINC01082在膀胱癌組織中的表達(dá)(*P<0.001)；B：miR-543在膀胱癌組織中的表達(dá)(*P<0.001)；C：膀胱癌組織中LINC01082和miR-543表達(dá)的相關(guān)性

二、LINC01082和miR-543在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)

與SV-HUC-1細(xì)胞比較，膀胱癌細(xì)胞BIU87、5637、J82和UM-UC-3中LINC01082表達(dá)水平較低(圖2A)，而在miR-543表達(dá)水平較高(圖2B，P<0.001)，且J82細(xì)胞中LINC01082表達(dá)水平最低，因此以J82細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象。轉(zhuǎn)染后，J82細(xì)胞中LINC01082組LINC01082表達(dá)水平明顯升高(圖2C)，miR-543表達(dá)水平明顯降低，而miR-543組中miR-543表達(dá)水平明顯升高(圖2D，P<0.001)。

A：膀胱癌及膀胱上皮細(xì)胞中LINC01082表達(dá)水平；B：膀胱癌及膀胱上皮細(xì)胞中miR-543表達(dá)水平；C：轉(zhuǎn)染后膀胱癌細(xì)胞中LINC01082表達(dá)水平；D：轉(zhuǎn)染后膀胱癌細(xì)胞中miR-543表達(dá)水平

三、LINC01082與miR-543的靶向關(guān)系

生物信息學(xué)軟件LncBase Predicted v.2分析結(jié)果顯示，LINC01082和miR-543之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC+LINC01082-wt組比較，miR-543+LINC01082-wt組熒光素酶活性明顯較低(圖3B，P<0.001)。

A：LINC01082和miR-543的結(jié)合位點(diǎn)；B：熒光素酶活性(*P<0.001)

四、LINC01082過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響

與空白組比較，LINC01082組細(xì)胞增殖能力明顯減弱(P<0.05)，而miR-543組明顯增強(qiáng)(P<0.001)；與LINC01082組比較，LINC01082+miR-543組細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

圖4 LINC01082過(guò)表達(dá)對(duì)J82細(xì)胞增殖的影響(*P<0.01，**P<0.001)

五、LINC01082過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移的影響

與空白組比較，LINC01082組細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目明顯降低，而miR-543組明顯增多(P<0.001)；與LINC01082組相比，LINC01082+miR-543組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P<0.001)，見(jiàn)圖5。

A：Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色，×200)；B：Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色，×200)；C：侵襲細(xì)胞數(shù)比較(*P<0.001)；D：遷移細(xì)胞數(shù)比較(*P<0.001)

六、LINC01082過(guò)表達(dá)對(duì)膀胱癌J82細(xì)胞凋亡的影響

與空白組比較，LINC01082組細(xì)胞凋亡率明顯升高，而miR-543組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；與LINC01082組比較，LINC01082+miR-543組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖6 LINC01082過(guò)表達(dá)對(duì)J82細(xì)胞凋亡的影響

七、LINC01082過(guò)表達(dá)對(duì)增殖、遷移及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，LINC01082組細(xì)胞Ki-67、MMP-9和Bcl-2表達(dá)水平顯著較低且Bax顯著較高，而miR-543組Ki-67、MMP-9和Bcl-2表達(dá)水平較高且Bax表達(dá)水平較低(P<0.001)；與LINC01082組相比，LINC01082+miR-543組Ki-67、MMP-9和Bcl-2表達(dá)水平較高，Bax表達(dá)水平較低(P<0.001)，見(jiàn)圖7。

A:Western blot檢測(cè)各組Ki-67、MMP-9、Bcl-2和Bax蛋白；B:各組Ki-67、MMP-9、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平比較(*P<0.001)

討 論

lncRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼長(zhǎng)鏈RNA，可從轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及表觀遺傳學(xué)等多個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá)，參與機(jī)體多種生物學(xué)功能的調(diào)控，與包括膀胱癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9]。如lncRNA TP73-AS1過(guò)表達(dá)可通過(guò)減弱上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]；lncRNA LINC01638可通過(guò)上調(diào)ROCK2表達(dá)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并參與膀胱癌術(shù)后的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[11]。LINC01082是lncRNAs家族成員之一，其在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌作用，可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[4]；然而，LINC01082在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究顯示LINC01082在40例膀胱癌組織和4種膀胱癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，且在J82細(xì)胞中表達(dá)最低；過(guò)表達(dá)J82細(xì)胞中的LINC01082可抑制J82細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)可以下調(diào)增殖促進(jìn)蛋白Ki-67、遷移促進(jìn)蛋白MMP-9和凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)凋亡促進(jìn)蛋白Bax的表達(dá)。因此可以看出，LINC01082可能在膀胱癌中通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、侵襲等行為發(fā)揮抑癌作用，而當(dāng)其由于某些機(jī)制被下調(diào)時(shí)，可能間接導(dǎo)致膀胱癌的惡性進(jìn)展。

miRNAs是一類(lèi)堿基序列長(zhǎng)度為18～23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，可通過(guò)結(jié)合下游靶基因的3′非翻譯區(qū)導(dǎo)致基因降解或翻譯受阻來(lái)調(diào)控mRNA表達(dá)，從而影響細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等生物學(xué)過(guò)程。已有多種miRNA被報(bào)道與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[12]。例如miR-539可通過(guò)靶向調(diào)控IGF-1R表達(dá)抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和侵襲[13]；miR-3622a可通過(guò)靶向下調(diào)LASS2表達(dá)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖和侵襲[14]。miR-543是miRNAs家族成員之一，有研究證實(shí)miR-543在前列腺癌中表達(dá)水平較高，且可通過(guò)靶向RKIP促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[15]；miR-543在非小細(xì)胞肺癌中也存在異常高表達(dá)，且通過(guò)靶向MATA1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[16]。還有研究證實(shí)，miR-543在膀胱癌組織和細(xì)胞中也存在表達(dá)水平升高，具有促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用[6]。本研究進(jìn)一步證實(shí)了上調(diào)miR-543后可促進(jìn)膀胱癌J82細(xì)胞增殖、遷移、侵襲并抑制其凋亡，在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要促進(jìn)作用，與現(xiàn)有關(guān)于miR-543發(fā)揮促癌作用的研究結(jié)論一致。lncRNA往往通過(guò)與miRNA結(jié)合充當(dāng)內(nèi)源性海綿，抑制miRNA表達(dá)，參與包括惡性腫瘤在內(nèi)的生理、病理過(guò)程[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中LINC01082表達(dá)與miR-543表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，上調(diào)LINC01082可使膀胱癌J82細(xì)胞中miR-543表達(dá)降低；采用生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，LINC01082序列上存在著能夠與miR-543結(jié)合的核苷酸序列；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-543模擬物可使轉(zhuǎn)染野生型LINC01082質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶活性降低，提示miR-543是LINC01082的靶向結(jié)合miRNA。因此推測(cè)LINC01082是通過(guò)miR-543發(fā)揮抑癌作用。在上調(diào)LINC01082的基礎(chǔ)上，我們轉(zhuǎn)染了miR-543模擬物以進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，上調(diào)LINC01082對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響作用被逆轉(zhuǎn)，提示LINC01082是通過(guò)靶向下調(diào)miR-543表達(dá)發(fā)揮抑制膀胱癌的作用。

本研究初步揭示了LINC01082在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的抑癌作用，并可通過(guò)調(diào)控miR-543的表達(dá)抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并誘導(dǎo)凋亡。該結(jié)果進(jìn)一步豐富了膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，為膀胱癌的治療提供了新的線索和突破點(diǎn)。但本研究對(duì)于miR-543的下游靶向mRNA尚未進(jìn)行研究，因此在下一步的研究工作中，會(huì)持續(xù)探索LINC01082相關(guān)調(diào)控機(jī)制軸的分子通路。