申萌萌，劉雁峰，馬小娜，賈靜，王崢，朱慶文

胚胎著床是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，過(guò)程中子宮內(nèi)膜能夠允許具有著床能力的胚胎定位、黏附、植入是成功著床的關(guān)鍵。在胚胎著床這個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程中，許多生理活動(dòng)參與其中。自噬是真核生物降解、回收細(xì)胞內(nèi)生物大分子和受損細(xì)胞器的過(guò)程，對(duì)細(xì)胞能量代謝、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等發(fā)揮重要作用[1-2]。有研究表明，自噬存在于子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞中，并參與子宮內(nèi)膜的生理和病理過(guò)程[3-5]。自噬是否影響子宮內(nèi)膜的容受性，并參與調(diào)控胚胎著床過(guò)程，是近年研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。本研究結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，選擇妊娠第4～6 天小鼠子宮，觀察自噬在胚胎圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜中的作用，以對(duì)自噬在胚胎著床過(guò)程中的作用機(jī)制進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇7～8 周齡specefic pathogen free（SPF）級(jí)ICR 雌性小鼠36 只，未交配過(guò)，20 只雄性小鼠證明有生育能力，雌性體質(zhì)量（20±2）g，雄鼠體質(zhì)量（25±2）g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境，濕度為5%～10%，溫度為（22±2）℃，12 h/12 h 光照/暗循環(huán)，可以自由獲取食物和飲水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，編號(hào)：BUCM-4-2020110902-4108。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器米非司酮規(guī)格25 mg/片，批號(hào)：H10950003，購(gòu)買于北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥房，制備成濃度為0.8 mg/mL 的油劑。Anti-LC3B（ab48394；英國(guó)艾博抗公司）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；垂直電泳槽（美國(guó)伯樂(lè)公司）；半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)印儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；2.5%戊二醛；透射電鏡，日本HITACHI H-7650。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及造模 每日16:00，雌雄小鼠按照2:1 合籠，次日晨檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓（即雌鼠與雄鼠成功交配）記為妊娠第1 天（the first day of pregnancy，pd1）。將妊娠小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表，分為空白組、模型組各18 只，每組又分為pd4、pd5、pd6 3 個(gè)小組，每小組6 只小鼠。于pd1 開(kāi)始空白組和模型組每日灌服生理鹽水0.2 mL，連續(xù)5 d?？瞻捉M（pd4）早上9:00皮下注射麻油0.1 mL，模型組注射米非司酮油劑0.1 mL，制備成胚胎著床障礙模型。

1.3.2 取材 分別于pd4、pd5、pd6 16:00 將各組小鼠脫頸處死，裸眼觀察各組小鼠妊娠情況，計(jì)數(shù)胚胎著床位點(diǎn)數(shù)；其中3 只小鼠子宮投入2.5%戊二酸，備透射電鏡檢測(cè)；另3 只小鼠子宮組織保存于-80 ℃?zhèn)涞鞍踪|(zhì)印跡（Western blotting）檢測(cè)。

1.3.3 胚胎著床情況觀察 裸眼觀察pd4、pd5、pd6 兩組小鼠的子宮外觀，胚胎著床情況。記錄各組胚胎平均著床位點(diǎn)數(shù)。平均著床位點(diǎn)數(shù)=該組小鼠總著床位點(diǎn)數(shù)目/該組妊娠小鼠數(shù)目。

1.3.4 Western blotting 方法檢測(cè)圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜組織中LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá) 分別提取pd4、pd5、pd6 各組小鼠組織的蛋白，加入細(xì)胞裂解液，取上清液，BCA 法測(cè)定蛋白定量。配制10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠溶液，水封閉，靜置1 h；緩緩加入5%濃縮膠。處理好的樣品按順序加入濃縮膠的上樣孔內(nèi)，每張膠上加入10 μL 的蛋白標(biāo)記。采用半干電轉(zhuǎn)移儀進(jìn)行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂奶粉在吐溫三羥甲基氨基甲烷緩沖液中封閉，室溫振蕩60 min。一抗4 ℃封閉過(guò)夜，二抗37 ℃震蕩60 min?；瘜W(xué)發(fā)光試劑顯影。Image-Pro Plus 6.0 軟件分析目的條帶。

1.3.5 透射電鏡觀察圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞中自噬小體的表達(dá) 0.01 moL/L 磷酸鹽緩沖液進(jìn)行漂洗，共3 次，每次15 min，放置于新鋨酸溶液中固定2 h；0.01 moL/L 磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，分別用50%、70%、90%、100%乙醇逐級(jí)脫水，每次10 min，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，定位，制成超薄切片，醋酸雙氧鈾染色；最后HITACH H-7650 透射電子顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜細(xì)胞自噬小體表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。定量資料符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 法；不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，兩個(gè)獨(dú)立樣本比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，多個(gè)獨(dú)立樣本比較采用KrusKal-Wallis H 秩和檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮形態(tài)裸眼觀察各組小鼠子宮形態(tài)，空白組pd4 小鼠子宮無(wú)明顯串珠樣改變；pd5 可見(jiàn)串珠樣改變，串珠分布均勻；pd6 串珠樣改變明顯，分布均勻。模型組pd4 小鼠子宮纖細(xì)，無(wú)串珠樣改變；pd5子宮可見(jiàn)積血，無(wú)明顯串珠樣改變；pd6 可見(jiàn)少量串珠樣改變，孕體大小不均，串珠分布不均。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠子宮形態(tài)

2.2 胚胎著床位點(diǎn)數(shù)空白組中胚胎著床位點(diǎn)數(shù)比較，pd5 較pd4 有增多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；pd6 較pd4 增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組pd4、pd5、pd6 胚胎著床位點(diǎn)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組pd5、pd6 平均著床位點(diǎn)數(shù)分別低于空白組pd5、pd6 的平均胚胎著床位點(diǎn)數(shù)（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠妊娠第4、5、6 天胚胎著床位點(diǎn)數(shù)[M（P25，P75）]

2.3 圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜中LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)空白組和模型組LC3-Ⅱ蛋白水平均表現(xiàn)出pd5 較pd4 降低，pd6 再升高的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。pd4 模型組LC3-Ⅱ表達(dá)低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜中LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)（n=3）

2.4 圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞中自噬小體的表達(dá)空白組和模型組pd4、pd5、pd6 子宮內(nèi)膜細(xì)胞中均可見(jiàn)自噬小體表達(dá)。透射電鏡下可見(jiàn)空白組小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞完整，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器形態(tài)正常，pd5 子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞表面可見(jiàn)蘑菇樣凸起——胞飲突表達(dá)豐富。空白組pd4 子宮內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量多，pd5 出現(xiàn)減少，pd6 又增多。模型組部分子宮內(nèi)膜細(xì)胞受到破壞，出現(xiàn)細(xì)胞壞死。模型組pd4 細(xì)胞中自噬小體較空白組多，亦較模型組pd5、pd6 自噬小體表達(dá)多。見(jiàn)圖3。

圖3 圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞中自噬小體的表達(dá)（×5 000）

3 討論

自噬是真核細(xì)胞通過(guò)溶酶體清除受損細(xì)胞器和異常蛋白等的主要方式之一，是細(xì)胞的一種生存防御機(jī)制。適度的自噬可維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，異常的自噬則與某些疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。子宮內(nèi)膜容受性低是指子宮內(nèi)膜允許胚胎定位、黏附、植入的能力降低，造成胚胎著床失敗、妊娠率降低[6]。有研究顯示，自噬活動(dòng)存在于子宮內(nèi)膜細(xì)胞，并受雌孕激素的影響在月經(jīng)周期中發(fā)生變化[7]。那么自噬是否在胚胎著床過(guò)程中發(fā)揮作用？自噬調(diào)控異常是否與子宮內(nèi)膜容受性降低有關(guān)呢？基于這些思考，本研究觀察小鼠妊娠第4、5、6 天[8]，即圍著床期子宮內(nèi)膜的自噬變化情況，以初步探討自噬在胚胎著床過(guò)程中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，空白組小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜自噬水平發(fā)生波動(dòng)，隨著胚胎黏附植入于子宮內(nèi)膜以及內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程，自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ、自噬小體的表達(dá)于pd5 出現(xiàn)減少，pd6 初級(jí)蛻膜化區(qū)形成后自噬水平出現(xiàn)回升。Su 等[9]對(duì)自噬在胚胎著床期子宮內(nèi)膜中的作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)胚胎植入時(shí)自噬標(biāo)志物水平較植入前有降低趨勢(shì)。說(shuō)明自噬參與胚胎著床的過(guò)程，并在過(guò)程中起到一定的作用。

胚胎著床障礙小鼠模型是研究子宮內(nèi)膜容受性的常用動(dòng)物模型，采用米非司酮制備，模擬子宮內(nèi)膜容受性低的狀態(tài)。米非司酮是藥物流產(chǎn)的臨床經(jīng)典用藥，與孕酮受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合以抑制孕酮作用，造成子宮內(nèi)膜細(xì)胞自噬增強(qiáng)[10]。本研究觀察該模型下子宮內(nèi)膜的自噬水平以了解子宮內(nèi)膜容受性降低是否與自噬水平異常有關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，米非司酮制備的著床障礙模型小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞中自噬小體增多，具有凋亡傾向，部分細(xì)胞出現(xiàn)破壞、死亡，與孫敬霞等[11-12]研究相一致。LC3-Ⅱ是自噬小體形成的結(jié)構(gòu)蛋白，附著于自噬小體膜上，是反映自噬水平的重要標(biāo)志物[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠子宮內(nèi)膜自噬小體表達(dá)水平高，但LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)卻低于空白組，考慮LC3-Ⅱ水平降低與模型組細(xì)胞破壞、死亡有關(guān)。說(shuō)明自噬參與并調(diào)控胚胎著床過(guò)程，過(guò)度自噬還可導(dǎo)致細(xì)胞自噬依賴性死亡[14]，降低胚胎著床率。

目前對(duì)于胚胎著床過(guò)程中自噬是如何激活和調(diào)控的并不明確，可能由于胚胎在植入子宮內(nèi)膜過(guò)程中，缺氧激發(fā)子宮內(nèi)膜的自噬機(jī)制[15-16]。已有研究發(fā)現(xiàn)雌孕激素能對(duì)自噬產(chǎn)生抑制作用[17-18]，亦可能是黃體中期高水平雌孕激素調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞自噬，進(jìn)而促進(jìn)胚胎著床，但對(duì)于其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制并不清楚。

綜上，自噬在胚胎著床過(guò)程中發(fā)揮重要作用，適度的子宮內(nèi)膜自噬可能與維持子宮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及胚胎正常植入能力密切相關(guān)，自噬異?？赡芷茐淖訉m內(nèi)膜細(xì)胞活性和功能，造成子宮內(nèi)膜容受性降低，不利于胚胎著床。目前對(duì)于胚胎著床過(guò)程中子宮內(nèi)膜的自噬調(diào)控機(jī)制并不明確，值得深入研究，未來(lái)結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。