徐銀娟 趙國連 崔曉利 王佩 談小文 楊珊珊 伍浩

早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是結(jié)核病的防治共識。分枝桿菌培養(yǎng)及菌種鑒定是結(jié)核病病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，是確定結(jié)核病診斷和化療方案的重要依據(jù)。BACTEC MGIT 960(簡稱“ MGIT 960”)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的分枝桿菌快速培養(yǎng)方法之一，但因其為進口試劑，存在價格昂貴、培養(yǎng)成本較高的問題，增加了結(jié)核病患者的經(jīng)濟壓力，也使得一些基層醫(yī)院無法開展此項工作，明顯影響了結(jié)核病的及時診治和增加了疾病傳播的風(fēng)險。因此，研發(fā)經(jīng)濟有效的分枝桿菌快速培養(yǎng)方法對我國結(jié)核病防治工作意義重大。

近年來，由我國自主研發(fā)的新型改良培養(yǎng)試劑相對于進口試劑具有價格低廉的優(yōu)勢，已被國內(nèi)較多實驗室使用，但對其檢測性能的評價報道不多。因此，筆者以MGIT 960培養(yǎng)為參照標(biāo)準(zhǔn)，評價新型國產(chǎn)改良Middlebrook液體培養(yǎng)試劑對分枝桿菌進行培養(yǎng)的檢測效能，為其在基層醫(yī)療機構(gòu)的應(yīng)用推廣提供參考。

材料和方法

一、標(biāo)本采集

采集2021年3—4月西安市胸科醫(yī)院診治的疑似肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本和肺泡灌洗液標(biāo)本，對其中質(zhì)量合格的89份痰液標(biāo)本和61份肺泡灌洗液標(biāo)本進行分枝桿菌改良試劑(Middlebrook液體培養(yǎng)試劑)培養(yǎng)(改良試劑法)和MGIT 960培養(yǎng)。

二、試劑和儀器

1.培養(yǎng)試劑：分枝桿菌改良培養(yǎng)試劑、改良生長添加劑及雜菌抑制劑均由廣東希格生物科技有限公司生產(chǎn)。MGIT 960培養(yǎng)試劑、MGIT 960生長添加劑及雜菌抑制劑均為美國BD公司產(chǎn)品。

2.鑒定試劑：采用MPB 64結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒(杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)和抗酸染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

3.自配標(biāo)本消化液：N-乙酰-L-半胱氨酸-4%氫氧化鈉(NALC)和磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=6.8)。

4.實驗儀器：BACTECTMMGITTM960 全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)儀。

三、研究方法

1.肺結(jié)核診斷：參照《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[1]標(biāo)準(zhǔn)。

2.標(biāo)本處理：液化標(biāo)本，視標(biāo)本性狀加入1～2倍體積的NALC于渦旋震蕩器中震蕩1 min，使痰標(biāo)本充分均勻化，室溫靜置18 min后加入PBS，3000×g離心20 min，棄上清后加入1 ml PBS緩沖液，震蕩混勻后靜置10 min。再取0.5 ml上清液分別接種于MGIT 960 液體培養(yǎng)基和改良試劑液體培養(yǎng)基中，混勻，放入MGIT 960系統(tǒng)孵育屜中培養(yǎng)，由儀器自動監(jiān)測并報告結(jié)果，最長觀察時間為42 d。

3.結(jié)果判讀：當(dāng)MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)超過42 d仍報告陰性，且肉眼觀察無細(xì)菌生長時，則報告為分枝桿菌陰性。當(dāng)培養(yǎng)系統(tǒng)報告為陽性時，則使用涂片抗酸染色進一步確認(rèn)，若僅發(fā)現(xiàn)抗酸染色陰性菌，則報告為培養(yǎng)陰性，且將該培養(yǎng)管登記為“污染”管；若未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌則報告為陰性；若發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌，再使用MBP64抗原檢測試劑(膠體金法)進行結(jié)核分枝桿菌鑒定。

4.觀察指標(biāo)：記錄兩種方法培養(yǎng)陽性數(shù)、污染數(shù)和報陽時間(d)。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用“百分率(%)”描述，組間差異的比較采用McNemar配對χ2檢驗，檢測效能采用Kappa檢驗。計量資料呈偏態(tài)分布，采用“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]”描述，組間差異的比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。比較改良試劑法和MGIT 960培養(yǎng)法檢測分枝桿菌的陽性率、污染率和報陽時間的差異，并以MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，評價改良試劑法的檢測效能。評價指標(biāo)：敏感度(%)=真陽性份數(shù)/(真陽性份數(shù)+假陰性份數(shù))×100%；特異度(%)=真陰性份數(shù)/(真陰性份數(shù)+假陽性份數(shù))×100%；陽性預(yù)測值(%)=真陽性份數(shù)/(真陽性份數(shù)+假陽性份數(shù))×100%；陰性預(yù)測值(%)=真陰性份數(shù)/(真陰性份數(shù)+假陰性份數(shù))×100%，陽性似然比=敏感度/(1-特異度)，陰性似然比=(1-敏感度)/特異度。一致性檢驗標(biāo)準(zhǔn)：Kappa值≤0.40時，表明一致性較差；0.400.80時，表明一致性好。

結(jié) 果

一、兩種分枝桿菌培養(yǎng)法的檢測結(jié)果

改良試劑法檢測痰液和肺泡灌洗液結(jié)核分枝桿菌的總陽性率和各自陽性率，以及總報陽時間和各自報陽時間與MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。兩種方法檢測灌洗液標(biāo)本均無污染出現(xiàn)，但改良試劑法檢測痰液標(biāo)本的污染率(12.4%)明顯高于MGIT 960(4.5%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 兩種培養(yǎng)法檢測兩種標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的陽性與污染情況

二、改良試劑法的檢測效能

以MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，改良試劑法檢測痰液和肺泡灌洗液標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的效能見表2。兩種方法進行培養(yǎng)的一致性好，其中檢測痰液標(biāo)本的Kappa值為0.907，檢測肺泡灌洗液標(biāo)本的Kappa值為0.902。

表2 改良試劑法以MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)對痰液和肺泡灌洗液標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的檢測效能

三、兩種液體培養(yǎng)基成本情況

改良培養(yǎng)試劑的成本為(49.6±10.5)元/份，MGIT 960試劑成本為(75.4±15.8)元/份，前者培養(yǎng)試劑的價格僅約為后者的60%。

討 論

近年來，隨著分子生物學(xué)診斷方法的發(fā)展，結(jié)核病的診斷時間被大大縮短，但是分枝桿菌培養(yǎng)對于表型藥物敏感性試驗及涂片陰性結(jié)核病患者的檢測依然必不可少[2]。目前，分枝桿菌MGIT 960液體培養(yǎng)因其全自動化結(jié)果判讀系統(tǒng)準(zhǔn)確度高、能夠增加實驗室周轉(zhuǎn)速度而被推薦為結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)[3]，但其液體培養(yǎng)試劑培養(yǎng)管(美國BD公司)和另一種常用Bac T/Alert 3D培養(yǎng)管(法國生物梅里埃公司)均為國外研發(fā)產(chǎn)品，存在價格昂貴、運輸不便等問題，嚴(yán)重消耗著我國的醫(yī)療衛(wèi)生資源。這也為我國自主研發(fā)的新型改良分枝桿菌液體培養(yǎng)試劑(Middlebrook液體培養(yǎng)試劑)提供了應(yīng)用空間。該試劑現(xiàn)已被多家機構(gòu)使用，其價格低廉、便于運輸，具有良好的應(yīng)用價值，但與MGIT 960培養(yǎng)相比較，尚缺乏臨床數(shù)據(jù)的對比研究。

本研究使用150份痰液和肺泡灌洗液臨床標(biāo)本，經(jīng)過統(tǒng)一的前處理方法，將標(biāo)本混懸液按照相同量分別加入到兩種培養(yǎng)試劑中進行培養(yǎng)。結(jié)果顯示，改良培養(yǎng)試劑法與MGIT 960培養(yǎng)對兩種標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的檢測陽性率無明顯差異，說明改良試劑法對結(jié)核分枝桿菌的檢出能力與MGIT 960培養(yǎng)不相上下；進一步參考楊順利等[4]對MGIT 960、Bac T/ALERT 3D和改良羅氏培養(yǎng)方法檢測痰標(biāo)本的陽性率結(jié)果(分別為45.34%、42.27%和40.11%)，可以認(rèn)為本研究國產(chǎn)改良培養(yǎng)試劑對分枝桿菌的檢出能力要優(yōu)于其他類型的培養(yǎng)試劑。同時，改良培養(yǎng)試劑檢測痰液和肺泡灌洗液的報陽時間也與MGIT 960培養(yǎng)的結(jié)果相差無幾，進一步參考陳軍等[5]對BACTE MGIT 960、Bac T/ALERT 3D和羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)痰標(biāo)本的報陽時間[分別為(14±7) d，(19±6) d和(26±7) d]的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MGIT 960培養(yǎng)的報陽時間最短，故可以認(rèn)為改良培養(yǎng)試劑在報陽時間方面不劣于MGIT 960和其他培養(yǎng)試劑。

在痰液標(biāo)本檢測污染率方面，改良試劑法明顯高于MGIT 960培養(yǎng)，也高于我國《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[6]要求的6%。筆者認(rèn)為有以下原因：首先，可能與改良培養(yǎng)試劑中的雜菌抑制劑組分與MGIT 960試劑中的組分存在差異有關(guān)。盡管筆者在配制改良培養(yǎng)試劑時，盡量將營養(yǎng)添加劑和雜菌抑制劑所含成分與MGIT 960培養(yǎng)試劑相一致，但仍可能出現(xiàn)一定的差異，導(dǎo)致其對痰液標(biāo)本中常見菌群的抑制作用有所差別。其次，也可能與接種操作引起的系統(tǒng)誤差有關(guān)，即向培養(yǎng)基接種標(biāo)本懸液時先吸取0.5 ml加入BD管，再吸取0.5 ml加入改良管，有可能將含雜菌較多的沉渣帶入到改良管中，增加其污染率[7]。但兩種培養(yǎng)基對肺泡灌洗液報告陽性的所有培養(yǎng)管均無污染，這可能與4%NALC處理液和雜菌抑制劑的雙重作用可使肺泡灌洗液標(biāo)本中的雜菌生長受限，降低了污染風(fēng)險有關(guān)；也可能與下呼吸道感染較少、肺泡灌洗液標(biāo)本采集無菌化有關(guān)[8]。這些都提示，可以通過改善操作、接種時減少沉渣帶入、改變標(biāo)本前處理消化液中NaOH濃度[9]來降低污染率。盡管本款改良試劑對痰液標(biāo)本的高污染率沒有降低其陽性檢出率，但按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的要求，所有污染標(biāo)本均需進行重處理，這將會增加試劑成本和日常工作量，延長培養(yǎng)時間。

以MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，改良試劑法檢測的敏感度和特異度均高于90%，說明該方法診斷效能高，且與MGIT 960培養(yǎng)的診斷一致性好，Kappa值為0.905。而在價格方面，國產(chǎn)改良培養(yǎng)試劑有著明顯優(yōu)勢，其成本僅約為MGIT 960試劑的60%。這些均為改良培養(yǎng)試劑的廣泛應(yīng)用提供了有力支撐。但目前改良培養(yǎng)試劑尚缺乏對其他類型標(biāo)本(如組織、腦脊液、胸腹腔積液等)的培養(yǎng)結(jié)果，也不明確是否會影響一些以分枝桿菌培養(yǎng)為基礎(chǔ)的實驗結(jié)果，如熔解曲線、GeneXpert MTB/RIF及藥物敏感性試驗等，這些均有待進一步研究。

綜上所述，改良試劑法檢測痰液和肺泡灌洗液標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的陽性率及報陽時間與MGIT 960培養(yǎng)無差異，診斷一致性好，且價格較低，可用于結(jié)核病患者痰液和肺泡灌洗液標(biāo)本的培養(yǎng)，但應(yīng)注意痰液標(biāo)本檢測污染率較高的問題。本研究為單中心研究，比對標(biāo)本份數(shù)有限，且僅分析了痰液和肺泡灌洗液標(biāo)本的培養(yǎng)結(jié)果，可能降低結(jié)果的代表性，還需要多中心大樣本的研究。